Modello di guarigione delle ferite da ustione simile a una scacchiera di topi basato su un dispositivo di riscaldamento digitale

Riepilogo

Viene presentato un protocollo semplificato per stabilire un modello di guarigione delle ferite da ustione nei topi utilizzando un dispositivo di riscaldamento digitale. I siti sperimentali a scacchiera creati sulla pelle facilitano ulteriori analisi funzionali per il test di guarigione delle ferite.

Abstract

Le ustioni gravi sono tra le condizioni più traumatiche e fisicamente debilitanti, hanno un impatto su quasi tutti i sistemi di organi e provocano una notevole morbilità e mortalità. Data la loro complessità e il coinvolgimento di più organi, sono stati creati vari modelli animali per replicare diversi aspetti delle lesioni da ustione. I metodi utilizzati per produrre superfici bruciate variano tra i modelli animali sperimentali. Questo studio descrive un modello di ustione del mouse semplice, economico e facile da usare per creare ustioni coerenti a tutto spessore utilizzando un dispositivo di riscaldamento digitale. La punta di questo dispositivo è stata applicata al dorso dei topi per 10 s a 97 °C per stabilire un'ustione simile a una scacchiera ed esaminare la guarigione delle ferite sotto il trattamento di una medicazione sperimentale. Sono stati raccolti campioni di pelle per l'analisi istologica, tra cui la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) e la colorazione di Masson. La guarigione della ferita è stata valutata attraverso l'analisi dell'area della ferita e l'esame microscopico dell'infiltrazione infiammatoria, della riepitelizzazione e della formazione di tessuto di granulazione. Il modello di lesione da ustione del topo può fungere da strumento fondamentale per studiare la fisiopatologia delle lesioni termiche e valutare gli interventi terapeutici.

Introduzione

Le ustioni sono considerate una delle lesioni critiche alla pelle, causate dall'esposizione al calore, all'elettricità, ai materiali chimici e all'esposizione alle radiazioni ^1,2. Può essere classificato in quattro gradi a seconda della profondità della lesione, che vanno dall'epidermide all'intero spessore della pelle e persino ai muscoli e alle ossa. Piccole ustioni possono portare alla formazione di cicatrici e aumentare il rischio di infezione. Un'ampia area di ustione non solo provoca danni locali, ma stimola anche disturbi del cuore, dei reni e di altri organi o sistemi del corpo attraverso infiammazioni gravi e a lungo termine e risposte immunitarie, portando a gravi conseguenze sistemiche e ad un'elevata morbilità³. La maggior parte dei sopravvissuti alle ustioni è accompagnata da disabilità fisiche di lunga durata, disagio emotivo e diminuzione della qualità della vita ^4,5. Pertanto, è importante studiare il processo patologico delle ustioni e i meccanismi di rigenerazione del tessuto ustionato.

Coinvolti nelle risposte immunitarie, nella rigenerazione tissutale e nell'omeostasi sistematica, gli studi in vitro non sono stati in grado di indagare in modo completo il processo patologico di guarigione delle ferite da ustione. Pertanto, negli ultimi due decenni, al fine di esplorare potenziali interventi terapeutici, sono stati sviluppati diversi modelli animali di guarigione delle ferite da ustione per replicare le varie caratteristiche delle lesioni da ustione ^6,7. Le ustioni sono solitamente prodotte sulla superficie del dorso di maiali, ratti, topi, conigli e altri animali dopo la depilazione. Il tempo di combustione può durare da 3 s a 30 s per formare danni termici da parziali a tutto spessore con un intervallo compreso tra il 5% e il 30% della superficie corporea totale (TBSA)⁸. Attualmente non esistono modelli standardizzati di questi metodi nella ricerca sugli animali ustionati a causa dell'elevata variabilità delle tecniche utilizzate. I metodi utilizzati per produrre superfici bruciate variano tra i modelli animali sperimentali, tra cui la fiamma a gas⁹, il bagno di etanolo combustionato¹⁰, la singola piastra/barra metallica preriscaldata^11,12, l'acqua bollente o calda^13,14. Tuttavia, la tecnica di inflizione dell'ustione e la profondità di ustione prodotta sono spesso incoerenti e scarsamente descritte in studi precedenti, il che è fondamentale per determinare la gravità dell'ustione e il metodo di trattamento delle ustioni.

Questo studio mira a sviluppare un modello animale di ustione di topo semplice, economico e di facile utilizzo per creare ustioni coerenti a tutto spessore in scenari clinici simulati. In questo protocollo, abbiamo utilizzato un comodo dispositivo di riscaldamento digitale per controllare la profondità dell'ustione regolando la temperatura applicata alla pelle. La punta di questo dispositivo può essere commutata in diverse dimensioni per indurre ustioni termiche con intervalli variabili di TBSA. Ciò consente la creazione di una ferita da ustione simile a una scacchiera sul dorso del topo, consentendo il confronto di diversi trattamenti sperimentali e di controllo all'interno dello stesso animale. Abbiamo osservato e registrato il processo di chiusura della ferita. I campioni di pelle sono stati raccolti per la valutazione istologica (colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) e colorazione tricromica di Masson) in diverse fasi della guarigione della ferita. Questo approccio riduce il numero di animali utilizzati nell'esperimento e, quindi, riduce i costi economici pur essendo più compatibile con l'etica animale. Questo studio fornirà ai ricercatori strumenti essenziali per facilitare lo sviluppo di nuovi trattamenti per le ustioni e rivelare i meccanismi fisiopatologici della guarigione delle ferite da ustione.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali in questo studio sono state esaminate e approvate dal Comitato etico della West China School of Stomatology, Sichuan University (WCHSIRB-D-2024-499). Per il presente studio sono stati utilizzati ventiquattro topi C57BL/6 di otto settimane (femmina, peso corporeo 25-30 g). I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione dell'attrezzatura e del mouse prima dell'ustione

1. Acquisisci gli animali e ospitali in gabbie per 7 giorni all'arrivo per consentire loro di acclimatarsi all'ambiente.
2. Sterilizzare l'area di lavoro spruzzando e strofinando con etanolo al 70% (v/v). Coprire il tavolo operatorio con assorbenti chirurgici sterili.
3. Regolare la temperatura del riscaldatore digitale a 97 °C. Il dispositivo di riscaldamento è composto da tre parti (Figura 1).
   NOTA: La temperatura da 50 a 450 °C può essere regolata tramite il regolatore di temperatura (Figura 1A). La base del supporto viene utilizzata per posizionare la punta (Figura 1B), che può essere smontata (Figura 1C) per sostituire strumenti di diverse dimensioni. Disinfettare la punta con iodoforo o alcool.
4. Anestetizzare il topo con isoflurano al 5% in ossigeno al 100% in una camera di induzione per 3 minuti (portata: 4 L/min) fino a quando la respirazione non è rallentata. Valutare la profondità dell'anestesia utilizzando un test di pizzicamento delle dita dei piedi.
   NOTA: L'inalazione di isoflurano può portare a sonnolenza e danneggiare il sistema cardiovascolare. È essenziale indossare dispositivi di protezione e maneggiarli all'interno di una cappa aspirante in un'area ben ventilata.
5. Una volta che il mouse è profondamente anestetizzato, trasferirlo su un tappetino riscaldato in posizione prona per mantenere il calore e prevenire l'ipotermia durante il recupero dall'anestesia. Ridurre l'isoflurano a 1. 5% di ossigeno per il mantenimento tramite un cono anteriore.
6. Applicare il gel lubrificante su entrambi gli occhi del topo con un batuffolo di cotone per prevenire l'essiccazione della cornea.

2. Indurre ustioni a tutto spessore

NOTA: Il processo generale di induzione e analisi della combustione è mostrato nella Figura 2.

1. Radere la pelle del mouse con un rasoio elettrico su un'area di circa 5 cm di lunghezza e 4 cm di larghezza dal collo alla coda. Lavorare delicatamente per evitare di ferire la pelle durante la rasatura (Figura 3C).
2. Utilizzare un applicatore con punta di cotone per applicare la crema depilatoria sulla zona della pelle rasata per 3 minuti (Figura 3D).
   NOTA: Evitare di applicare la crema depilatoria su altre parti del mouse per evitare ustioni, che possono essere difficili da rilevare. La crema ha causato eruzioni cutanee se usata per più di 5 minuti. La durata precisa per un'efficacia ottimale varia da un prodotto all'altro e deve essere determinata dall'operatore.
3. Pulire la crema con una garza umida fino a quando la crema e i capelli non vengono rilevati. Disinfettare l'area chirurgica con scrub alla clorexidina seguito da etanolo al 70% (v/v) tre volte ciascuno. Pulire e asciugare l'area con una garza sterile.
4. Utilizzare un puntale per pipetta sterilizzato da 1 ml con un diametro di 9 mm (Figura 3A) immerso in inchiostro sterilizzato per individuare con precisione i siti di ferita desiderati. La cute dorsale murina è caratterizzata da una topografia irregolare. Definire l'area della ferita oltre al midollo spinale dei topi è essenziale per garantire la ripetibilità.
5. Coprire la pelle con un telo sterile precedentemente tagliato, lasciando libera l'area chirurgica (Figura 3). Indossare guanti resistenti al calore e controllare la temperatura del dispositivo di riscaldamento digitale. Prima e dopo l'induzione della combustione, disinfettare la punta del dispositivo con etanolo al 70% (v/v).
6. Applicare la punta del dispositivo di riscaldamento al centro dei siti della ferita localizzati (97 °C per 10 s) per creare sei ferite rotonde con un diametro di 4 mm (Figura 3B). L'intervallo tra le ustioni adiacenti è di 0,5-1 cm. Determinare il numero di ustioni in base al disegno sperimentale.
   NOTA: L'ustione è causata principalmente dalla conduzione del calore; Pertanto, non è necessario esercitare pressione sull'asta, cioè tenerla a contatto con la pelle per gravità durante l'induzione della bruciatura. Ci sono state sei ustioni per il disegno sperimentale. Questo è il numero massimo di ustioni che possono essere costruite in base al dispositivo che abbiamo utilizzato e all'area del dorso del topo. Su questa base è possibile ottenere più repliche dello stesso gruppo sperimentale.

3. Cura e misurazione post-ustione

1. Applicare del ghiaccio sulla ferita da ustione per 5 minuti per ridurre il potenziale dolore per la gestione del dolore (Figura 3G).
2. Spegnere l'isoflurano e rimuovere il cono del naso dopo la lesione da ustione. Trasferire il mouse su un termoforo finché il mouse non si muove normalmente (ad esempio, non accovacciato o tremante).
3. Metti ogni topo in una gabbia di recupero per evitare che si graffino a vicenda. Ammorbidisci alcuni pellet di cibo aggiungendo 5-10 gocce di acqua potabile a ciascun pellet e posizionali sul pavimento della gabbia per facilitare l'alimentazione.
   NOTA: Sterilizzare le gabbie spruzzando e strofinando con etanolo al 70% (vol/vol). La lettiera deve essere sostituita regolarmente per mantenere i topi caldi e assorbire l'urina.
4. Somministrare buprenorfina (0,1 mg/kg) per via sottocutanea in posizione caudale due volte al giorno per un totale di 3 giorni, assicurando almeno 8 ore tra le iniezioni.
5. Pulire tutte le ferite con una garza sterile inumidita con soluzione fisiologica dopo 24 ore di induzione dell'ustione. Tamponare la pelle con una garza e applicare una piccola quantità di gel antibatterico (TKH hydrogel) utilizzando una siringa per coprire la ferita da ustione^12,14. Ripetere questa procedura nei giorni 3, 7 e 10 successivi.
6. Utilizzare una medicazione traspirante e trasparente per coprire le ferite. La dimensione della medicazione dovrebbe coprire circa 1 cm intorno alla ferita e non dovrebbe coprire l'area senza depilazione.
   NOTA: Cambiare la medicazione della ferita almeno una volta ogni 2 giorni. L'uso prolungato della medicazione senza sostituzione può portare a un'infezione della ferita con formazione di pus, con conseguente ritardo nella guarigione della ferita.
7. Durante il periodo di follow-up, misurare il peso ogni 2-3 giorni. In generale, i topi che perdono il 15%-20% del loro peso corporeo iniziale dovrebbero essere sacrificati e rimossi dall'esperimento.

4. Raccolta delle ferite

1. A 0, 3, 7, 10 e 14 giorni, contrassegnare la ferita con la punta di una pipetta sterile da 1 ml e registrarla con una fotocamera digitale.
2. Eutanasia dei topi mediante sovradosaggio di anestesia e lussazione cervicale (seguendo protocolli istituzionalmente approvati).
   NOTA: Prestare attenzione durante la lussazione cervicale per evitare una trazione eccessiva, che potrebbe danneggiare le ferite del dorso.
3. Con le forbici, isolare il sito della ferita e la pelle circostante, compresa la muscolatura sottostante (1 cm x 1 cm). Preparare almeno tre campioni per ogni gruppo.
4. Fissare i campioni di pelle in paraformaldeide al 4% (PFA) per 24 ore e conservare a 4 °C. Il volume fissativo deve essere 30 volte il volume del tessuto ^15,16.
   NOTA: Il PFA è pericoloso. Assicurarsi di lavorare in un'area ben ventilata e utilizzare dispositivi di protezione adeguati.

5. Valutazione della guarigione delle ferite

1. Lavare due volte il tessuto della ferita con PBS e stenderlo con carta da filtro, che deve essere tagliata a una dimensione appropriata (Figura 2H). A causa della presenza di un certo contenuto mucoso all'interno dello strato di tessuto sottocutaneo, aderisce alla superficie della carta da filtro senza movimento o arricciamento dei tessuti.
   1. Mettere la carta da filtro e il campione in una cassetta di fazzoletto per la disidratazione della paraffina per ottenere campioni di tessuto relativamente lisci e quindi incorporare il tessuto^15,16. Conservare i campioni a 4 °C.
      NOTA: Allungare il tessuto il più possibile ed evitare qualsiasi piegatura, poiché queste pieghe diventeranno permanenti dopo il fissaggio.
2. Tagliare i campioni inclusi in paraffina in sezioni di 5 μm di spessore e colorare i vetrini tramite H&E e la tricromia di Masson per valutare l'entità del tessuto di granulazione, la formazione di angiogenesi e la deposizione di collagene, fornendo prove per valutare le diverse fasi e la progressione della guarigione della ferita^17,18.
3. Acquisizione di immagini di tutti i campioni utilizzando un microscopio con obiettivo 40x.
4. Utilizzare un software compatibile per analizzare la sezione della pelle macchiata, compresa l'epidermide, il derma, il tessuto sottocutaneo e le condizioni muscolari.

Risultati

In questo protocollo, il dispositivo di riscaldamento digitale ha creato ferite da ustione simili a quelle di una scacchiera con una durata di combustione di 10 s a 97 °C (Figura 1). La punta del dispositivo è realizzata in rame puro, noto per la sua eccellente conduzione del calore e le sue capacità di riscaldamento rapido. L'impugnatura tenuta dallo sperimentatore è realizzata in policarbonato, che fornisce resistenza al calore e non infiammabilità. R...

Discussione

Per gli studi sulle ustioni, i modelli in vitro si concentrano tipicamente sugli effetti inibitori di agenti antimicrobici locali o antibiotici sui batteri associati alle ustioni, come Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa¹⁹, nonché sull'impatto di vari biomateriali (come elastina, seta e medicazioni in idrogel^14,20) su cellule infiammatorie post-ustione (come neutrofil...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette tip	KIRGEN,USA	KG1333	Used to locate burn wound sites
3 M Tegaderm film	3M,USA	1624WCN 6 cm x 7 cm	For the wound cover after burn induction
4% paraformaldehyde(PFA)	Biosharp,China	BL539A	Used to fix the skin samples
Buprenorphine	Sigma-Aldrich,USA	PHR8955-50MG	For the pain management of the mice
C57BL/6 mice	Chengdu Dashuo experimental animal company,China	none	For the establishment of burn model
Depilatory cream	Veet,China	—	For the dorsum hair removal of the mice
Digital Heating Device	Shenzhen Kapper Technology Company,China	No.936D	For the burn induction of the mice
Electric shaver	AUX,China	AUX-A5	For the dorsum hair removal of the mice
Filter paper	—	—	Used to unfold of the skin samples
GraphPad software	—	GraphPad prism 9.5.0	For the analysis of burn wound area
Heat-resistant gloves	—	—	Used to hold the digital heating device tip
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Solarbio,China	G1120	For the histological analysis of the slides
ImageJ software	—	ImageJ 1.54f	For the analysis of burn wound area
Isoflurane	RWD,China	R510-22-10	For the anesthesia of the mice
Masson's Trichrome Stain Kit	Solarbio,China	G1340	For the histological analysis of the slides
Microscope	Olympus,Japan	VS200 ASW	Used to scan the H&E and Masson stained slides
Tissue cassette	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD,China	31050102W	For tissue paraffin dehydration and paraffin embedding