Modelo de cicatrização de feridas de queimadura semelhante a um tabuleiro de xadrez de camundongos baseado em dispositivo de aquecimento digital

Resumo

Um protocolo simplificado é apresentado para estabelecer um modelo de cicatrização de queimaduras em camundongos usando um dispositivo de aquecimento digital. Os locais experimentais semelhantes a tabuleiros de xadrez criados na pele facilitam uma análise funcional adicional para o ensaio de cicatrização de feridas.

Resumo

As queimaduras graves estão entre as condições mais traumáticas e fisicamente debilitantes, afetando quase todos os sistemas de órgãos e resultando em morbidade e mortalidade consideráveis. Dada a sua complexidade e o envolvimento de múltiplos órgãos, vários modelos animais foram criados para replicar diferentes facetas da queimadura. Os métodos usados para produzir superfícies queimadas variam entre os modelos animais experimentais. Este estudo descreve um modelo de queima de rato simples, econômico e fácil de usar para criar queimaduras consistentes de espessura total usando um dispositivo de aquecimento digital. A ponta deste dispositivo foi aplicada ao dorso de camundongos por 10 s a 97 ° C para estabelecer uma queimadura semelhante a um tabuleiro de xadrez e examinar a cicatrização de feridas sob o tratamento de um curativo experimental. Amostras de pele foram coletadas para análise histológica, incluindo coloração de hematoxilina e eosina (H&E) e coloração de Masson. A cicatrização da ferida foi avaliada por meio da análise da área da ferida e exame microscópico de infiltração inflamatória, reepitelização e formação de tecido de granulação. O modelo de lesão por queimadura em camundongos pode servir como uma ferramenta fundamental no estudo da fisiopatologia das lesões térmicas e na avaliação de intervenções terapêuticas.

Introdução

As queimaduras são consideradas uma das lesões críticas à pele, causadas pela exposição ao calor, eletricidade, materiais químicos e exposição à radiação ^1,2. Pode ser classificado em quatro graus, dependendo da profundidade da lesão, desde a epiderme até a espessura total da pele, e até mesmo os músculos e ossos. Pequenas queimaduras podem levar à formação de cicatrizes e aumentar o risco de infecção. Uma grande área de queimadura não apenas causa danos locais, mas também estimula distúrbios do coração, rins e outros órgãos ou sistemas do corpo por meio de inflamação grave e de longo prazo e respostas imunes, levando a sérias consequências sistêmicas e alta morbidade³. A maioria dos sobreviventes de queimaduras é acompanhada por deficiências físicas duradouras, sofrimento emocional e diminuição da qualidade de vida ^4,5. Portanto, é importante estudar o processo patológico das queimaduras e os mecanismos de regeneração do tecido queimado.

Envolvidos em respostas imunes, regeneração tecidual e homeostase sistemática, os estudos in vitro não puderam investigar de forma abrangente o processo patológico de cicatrização de queimaduras. Assim, nas últimas duas décadas, a fim de explorar potenciais intervenções terapêuticas, diferentes modelos animais de cicatrização de queimaduras foram desenvolvidos para replicar as várias características da queimadura ^6,7. As queimaduras geralmente são produzidas na superfície do dorso de porcos, ratos, camundongos, coelhos e outros animais após a depilação. O tempo de queima pode durar de 3 s a 30 s para formar danos térmicos de espessura parcial a total com uma faixa de 5% a 30% da área total da superfície corporal (TBSA)⁸. Atualmente, não existem modelos padronizados desses métodos em pesquisas com animais queimados devido à alta variabilidade das técnicas utilizadas. Os métodos usados para produzir superfícies queimadas variam entre os modelos animais experimentais, incluindo chama de gás⁹, banho de etanol em queima¹⁰, placa/barra metálica única pré-aquecida^11,12, fervura ou água quente^13,14. No entanto, a técnica de inflição de queimadura e a profundidade de queimadura produzida são frequentemente inconsistentes e mal descritas em estudos anteriores, o que é crucial para determinar a gravidade da queimadura e o método de tratamento da queimadura.

Este estudo tem como objetivo desenvolver um modelo animal de queimadura de camundongo simples, econômico e fácil de usar para criar queimaduras consistentes de espessura total em cenários clínicos simulados. Neste protocolo, usamos um dispositivo de aquecimento digital conveniente para controlar a profundidade da queimadura, ajustando a temperatura aplicada à pele. A ponta deste dispositivo pode ser alterada para diferentes tamanhos para induzir queimaduras térmicas com faixas variadas de TBSA. Isso permite a criação de uma queimadura semelhante a um tabuleiro de xadrez nas costas do camundongo, permitindo a comparação de vários tratamentos experimentais e de controle dentro do mesmo animal. Observamos e registramos o processo de fechamento da ferida. Amostras de pele foram colhidas para avaliação histológica (coloração de hematoxilina e eosina (H&E) e tricrômico de Masson) em diferentes estágios da cicatrização da ferida. Essa abordagem reduz o número de animais usados no experimento e, portanto, reduz os custos econômicos, sendo mais compatível com a ética animal. Este estudo fornecerá aos pesquisadores ferramentas essenciais para facilitar o desenvolvimento de novos tratamentos para queimaduras e revelar os mecanismos fisiopatológicos da cicatrização de queimaduras.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais neste estudo foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética da Escola de Estomatologia da China Ocidental, Universidade de Sichuan (WCHSIRB-D-2024-499). Vinte e quatro camundongos C57BL/6 de oito semanas de idade (fêmea, peso corporal 25-30 g) foram usados para o presente estudo. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparando o equipamento e o mouse antes da queimadura

1. Adquira os animais e aloje-os em gaiolas por 7 dias após a chegada para permitir que eles se aclimatem ao ambiente.
2. Esterilize a área de trabalho pulverizando e limpando com etanol 70% (v/v). Cubra a mesa de operação com absorventes cirúrgicos estéreis.
3. Ajuste a temperatura do dispositivo de aquecimento digital para 97 °C. O dispositivo de aquecimento consiste em três partes (Figura 1).
   NOTA: A temperatura de 50-450 °C pode ser ajustada através do controlador de temperatura (Figura 1A). A base do suporte é usada para colocar a ponta (Figura 1B), que pode ser desmontada (Figura 1C) para substituir diferentes tamanhos de instrumentos. Desinfete a ponta com iodóforo ou álcool.
4. Anestesiar o camundongo com isoflurano a 5% em oxigênio a 100% em uma câmara de indução por 3 min (taxa de fluxo: 4 L/min) até que a respiração diminua. Avalie a profundidade da anestesia usando um teste de pinça do dedo do pé.
   NOTA: A inalação de isoflurano pode causar sonolência e prejudicar o sistema cardiovascular. É essencial usar equipamento de proteção e manuseá-lo dentro de uma hotte em uma área bem ventilada.
5. Assim que o mouse estiver profundamente anestesiado, transfira-o para uma almofada aquecida em decúbito ventral para manter o calor e evitar a hipotermia durante a recuperação da anestesia. Reduza o isoflurano para 1. 5% de oxigênio para manutenção por meio de um cone nasal.
6. Aplique gel lubrificante em ambos os olhos do camundongo com um cotonete para evitar o ressecamento da córnea.

2. Induzir lesão por queimadura de espessura total

NOTA: O processo geral de indução e análise de queimaduras é mostrado na Figura 2.

1. Raspe a pele do mouse com um barbeador elétrico em uma área de aproximadamente 5 cm de comprimento e 4 cm de largura do pescoço à cauda. Trabalhe suavemente para evitar ferir a pele ao fazer a barba (Figura 3C).
2. Use um aplicador com ponta de algodão para aplicar creme depilatório na área da pele raspada por 3 min (Figura 3D).
   NOTA: Evite aplicar o creme depilatório em outras partes do mouse para evitar queimaduras, que podem ser difíceis de detectar. O creme causou erupções cutâneas se usado por mais de 5 min. A duração exata para a eficácia ideal varia entre os produtos e deve ser determinada pelo operador.
3. Limpe o creme com gaze úmida até que o creme e o cabelo não sejam detectados. Desinfetar a área cirúrgica com clorexidina esfoliante seguida de etanol a 70% (v/v) três vezes cada. Limpe e seque a área com gaze estéril.
4. Empregue uma ponta de pipeta esterilizada de 1 mL com um diâmetro de 9 mm (Figura 3A) embebida em tinta esterilizada para identificar com precisão os locais de ferimento desejados. A pele dorsal murina é caracterizada por uma topografia irregular. Definir a área da ferida além da medula espinhal de camundongos é essencial para garantir a repetibilidade.
5. Cubra a pele com um campo estéril previamente aparado, deixando a área cirúrgica livre (Figura 3). Coloque luvas resistentes ao calor e verifique a temperatura do dispositivo de aquecimento digital. Antes e após a indução da queimadura, higienize a ponta do aparelho com etanol 70% (v/v).
6. Aplique a ponta do dispositivo de aquecimento no centro dos locais da ferida localizada (97 ° C por 10 s) para criar seis feridas redondas com um diâmetro de 4 mm (Figura 3B). O intervalo entre as queimaduras adjacentes é de 0,5-1 cm. Determine o número de queimaduras de acordo com o projeto experimental.
   NOTA: A queimadura é causada principalmente pela condução de calor; portanto, não é necessário exercer pressão sobre a haste, ou seja, mantê-la em contato com a pele por gravidade durante a indução da queimadura. Houve seis queimaduras para o delineamento experimental. Este é o número máximo de queimaduras que podem ser construídas de acordo com o dispositivo que usamos e a área do dorso do camundongo. Múltiplas réplicas do mesmo grupo experimental podem ser alcançadas com base nisso.

3. Cuidados e medição pós-queimadura

1. Aplique gelo na ferida queimada por 5 minutos para reduzir a dor potencial para o controle da dor (Figura 3G).
2. Desligue o isoflurano e remova o cone do nariz após a queimadura. Transfira o mouse para uma almofada de aquecimento até que o mouse se mova normalmente (por exemplo, não agachado ou tremendo).
3. Coloque cada rato em uma gaiola de recuperação para evitar que eles se arranhem. Amoleça alguns pellets de comida adicionando 5 a 10 gotas de água potável a cada pellet e coloque-os no chão da gaiola para facilitar a alimentação.
   NOTA: Esterilização das gaiolas por pulverização e limpeza com etanol a 70% (vol/vol). A roupa de cama deve ser substituída regularmente para manter os ratos aquecidos e absorver a urina.
4. Administre buprenorfina (0,1 mg/kg) por via subcutânea em localização caudal duas vezes ao dia por um total de 3 dias, garantindo pelo menos 8 h entre as injeções.
5. Limpe todas as feridas com gaze estéril umedecida com solução salina após 24 h de indução de queimadura. Seque a pele com gaze e aplique uma pequena quantidade de gel antibacteriano (hidrogel TKH) usando uma seringa para cobrir a queimadura^12,14. Repita este procedimento nos dias 3, 7 e 10 seguintes.
6. Use um curativo respirável e transparente para cobrir as feridas. O tamanho do curativo deve cobrir cerca de 1 cm ao redor da ferida e não deve cobrir a área sem depilação.
   NOTA: Troque o curativo pelo menos uma vez a cada 2 dias. O uso prolongado do curativo sem substituição pode levar à infecção da ferida com formação de pus, resultando em atraso na cicatrização da ferida.
7. Durante todo o período de acompanhamento, meça o peso a cada 2-3 dias. Geralmente, os camundongos que perdem 15% a 20% de seu peso corporal inicial devem ser sacrificados e removidos do experimento.

4. Coleta de feridas

1. Aos 0, 3, 7, 10 e 14 dias, marque a ferida com a ponta de uma ponta de pipeta estéril de 1 mL e registre-a com uma câmera digital.
2. Eutanasiar os camundongos por overdose de anestesia e luxação cervical (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
   NOTA: Tenha cuidado durante a luxação cervical para evitar puxões excessivos, que podem danificar as feridas do dorso.
3. Com uma tesoura, isole o local da ferida e a pele circundante, incluindo a musculatura subjacente (1 cm x 1 cm). Prepare-se para pelo menos três amostras para cada grupo.
4. Fixe as amostras de pele em paraformaldeído (PFA) a 4% por 24 h e armazene a 4 ° C. O volume do fixador deve ser 30 vezes o volume do tecido^15,16.
   NOTA: O PFA é perigoso. Certifique-se de trabalhar em uma área bem ventilada e use equipamentos de proteção adequados.

5. Avaliação da cicatrização de feridas

1. Lave o tecido da ferida duas vezes com PBS e espalhe-o com papel de filtro, que deve ser aparado em um tamanho apropriado (Figura 2H). Devido à presença de algum conteúdo mucoso na camada de tecido subcutâneo, ele adere à superfície do papel de filtro sem movimento ou ondulação do tecido.
   1. Coloque o papel de filtro e a amostra em um de tecido para desidratação com parafina para obter amostras de tecido relativamente lisas e, em seguida, incorpore o tecido^15,16. Armazenar amostras a 4 °C.
      NOTA: Estique o tecido o máximo possível e evite qualquer dobra, pois essas dobras se tornarão permanentes após a fixação.
2. Corte as amostras embebidas em parafina em seções de 5 μm de espessura e core as lâminas via H&E e tricrômico de Masson para avaliar a extensão do tecido de granulação, formação de angiogênese e deposição de colágeno, fornecendo evidências para avaliar os diferentes estágios e a progressão da cicatrização da ferida^17,18.
3. Capture imagens de todas as amostras usando um microscópio com objetiva de 40x.
4. Use um software compatível para analisar a seção da pele manchada, incluindo epiderme, derme, tecido subcutâneo e condição muscular.

Resultados

Neste protocolo, queimaduras semelhantes a tabuleiros de xadrez foram criadas com uma duração de queimadura de 10 s a 97 °C pelo dispositivo de aquecimento digital (Figura 1). A ponta do dispositivo é feita de cobre puro, conhecido por sua excelente condução de calor e capacidade de aquecimento rápido. A empunhadura segurada pelo experimentador é feita de material de policarbonato, que fornece resistência ao calor e não inflamabilidade. Em compara?...

Discussão

Para estudos de queimaduras, os modelos in vitro geralmente se concentram nos efeitos inibitórios de agentes antimicrobianos locais ou antibióticos em bactérias associadas a queimaduras, como Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa¹⁹, bem como no impacto de vários biomateriais (como elastina, seda e curativos de hidrogel^14,20) em células inflamatórias pós-queimadura...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette tip	KIRGEN,USA	KG1333	Used to locate burn wound sites
3 M Tegaderm film	3M,USA	1624WCN 6 cm x 7 cm	For the wound cover after burn induction
4% paraformaldehyde(PFA)	Biosharp,China	BL539A	Used to fix the skin samples
Buprenorphine	Sigma-Aldrich,USA	PHR8955-50MG	For the pain management of the mice
C57BL/6 mice	Chengdu Dashuo experimental animal company,China	none	For the establishment of burn model
Depilatory cream	Veet,China	—	For the dorsum hair removal of the mice
Digital Heating Device	Shenzhen Kapper Technology Company,China	No.936D	For the burn induction of the mice
Electric shaver	AUX,China	AUX-A5	For the dorsum hair removal of the mice
Filter paper	—	—	Used to unfold of the skin samples
GraphPad software	—	GraphPad prism 9.5.0	For the analysis of burn wound area
Heat-resistant gloves	—	—	Used to hold the digital heating device tip
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Solarbio,China	G1120	For the histological analysis of the slides
ImageJ software	—	ImageJ 1.54f	For the analysis of burn wound area
Isoflurane	RWD,China	R510-22-10	For the anesthesia of the mice
Masson's Trichrome Stain Kit	Solarbio,China	G1340	For the histological analysis of the slides
Microscope	Olympus,Japan	VS200 ASW	Used to scan the H&E and Masson stained slides
Tissue cassette	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD,China	31050102W	For tissue paraffin dehydration and paraffin embedding