מודל ריפוי פצעי כוויה דמוי לוח שחמט של עכברים המבוסס על מכשיר חימום דיגיטלי

Summary

מוצג פרוטוקול יעיל להקמת מודל ריפוי פצעי כוויות בעכברים באמצעות מכשיר חימום דיגיטלי. אתרי הניסוי דמויי לוח השחמט שנוצרו על העור מאפשרים ניתוח פונקציונלי נוסף לבדיקת ריפוי הפצעים.

Abstract

פציעות כוויות חמורות הן בין המצבים הטראומטיים והמתישים ביותר מבחינה פיזית, המשפיעות כמעט על כל מערכת איברים וגורמות לתחלואה ותמותה ניכרות. בהתחשב במורכבותם ובמעורבותם של איברים מרובים, נוצרו מודלים שונים של בעלי חיים כדי לשכפל היבטים שונים של פציעות כוויות. השיטות המשמשות לייצור משטחים שרופים משתנות בין מודלים של חיות ניסוי. מחקר זה מתאר מודל צריבת עכבר פשוט, חסכוני וידידותי למשתמש ליצירת כוויות עקביות בעובי מלא באמצעות מכשיר חימום דיגיטלי. קצה המכשיר הונח על הגב של עכברים למשך 10 שניות ב-97 מעלות צלזיוס כדי ליצור כוויה דמוית לוח שחמט ולבחון ריפוי פצעים בטיפול של חבישה ניסיונית. דגימות עור נאספו לניתוח היסטולוגי, כולל צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) וצביעה של מאסון. ריפוי הפצע הוערך באמצעות ניתוח אזור הפצע ובדיקה מיקרוסקופית של חדירה דלקתית, אפיתל מחדש והיווצרות רקמת גרנולציה. מודל פציעת כוויות עכברים יכול לשמש כלי בסיסי בחקר הפתופיזיולוגיה של פגיעות תרמיות והערכת התערבויות טיפוליות.

Introduction

כוויות נחשבות לאחת הפגיעות הקריטיות בעור, הנגרמות מחשיפה לחום, חשמל, חומרים כימיים וחשיפה לקרינה ^1,2. ניתן לסווג אותו לארבע מעלות בהתאם לעומק הפציעה, החל מהאפידרמיס ועד לעובי המלא של העור, ואפילו לשרירים ולעצמות. כוויות קטנות עלולות להוביל להיווצרות צלקות ולהגביר את הסיכון לזיהום. אזור גדול של פגיעת כוויות לא רק גורם לנזק מקומי, אלא גם ממריץ הפרעות בלב, בכליות ובאיברים או מערכות אחרות בגוף באמצעות דלקת חמורה וארוכת טווח ותגובות חיסוניות, מה שמוביל להשלכות מערכתיות חמורות ותחלואה גבוהה³. רוב ניצולי פציעות הכוויות מלווים בנכויות פיזיות ארוכות טווח, מצוקה רגשית וירידה באיכות החיים ^4,5. לכן, חשוב ללמוד את התהליך הפתולוגי של כוויות ואת מנגנוני ההתחדשות של רקמה שרופה.

מעורב בתגובות חיסוניות, התחדשות רקמות והומאוסטזיס שיטתי, מחקרי מבחנה לא יכלו לחקור באופן מקיף את התהליך הפתולוגי של ריפוי פצעי כוויות. לפיכך, במהלך שני העשורים האחרונים, על מנת לחקור התערבויות טיפוליות פוטנציאליות, פותחו מודלים שונים של בעלי חיים לריפוי פצעי כוויות כדי לשכפל את המאפיינים השונים של פציעת כוויות ^6,7. פצעי כוויות מיוצרים בדרך כלל על פני הגב של חזירים, חולדות, עכברים, ארנבות ובעלי חיים אחרים לאחר הסרת שיער. זמן הצריבה יכול להימשך 3 שניות עד 30 שניות כדי ליצור נזק תרמי בעובי חלקי עד מלא עם טווח של 5% עד 30% שטח פנים כולל של הגוף (TBSA)⁸. כיום אין מודלים סטנדרטיים של שיטות אלה במחקר בבעלי חיים כוויות בשל השונות הגבוהה של הטכניקות בהן נעשה שימוש. השיטות המשמשות לייצור משטחים שרופים משתנות בין מודלים של חיות ניסוי, כולל להבת גז⁹, אמבט אתנול בוער¹⁰, צלחת/מוט מתכת בודד מחומם מראש^11,12, מים רותחים או חמים^13,14. עם זאת, הטכניקה של גרימת כוויה ועומק הכוויה המיוצר לרוב אינם עקביים ומתוארים בצורה גרועה במחקרים קודמים, וזה חיוני בקביעת חומרת הכוויה ושיטת הטיפול בכוויות.

מחקר זה נועד לפתח מודל פשוט, חסכוני וידידותי למשתמש של כוויות עכברים ליצירת כוויות עקביות בעובי מלא בתרחישים קליניים מדומים. בפרוטוקול זה, השתמשנו במכשיר חימום דיגיטלי נוח כדי לשלוט בעומק הכוויה על ידי התאמת הטמפרטורה המופעלת על העור. ניתן להחליף את הקצה של מכשיר זה לגדלים שונים כדי לגרום לכוויות תרמיות עם טווחים משתנים של TBSA. זה מאפשר יצירת פצע כוויה דמוי לוח שחמט על גב העכבר, מה שמאפשר השוואה בין מספר טיפולים ניסיוניים וביקורת באותה חיה. צפינו ותיעדנו את תהליך סגירת הפצע. דגימות עור נאספו להערכה היסטולוגית (צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) וצביעה טריכרומית של מאסון) בשלבים שונים של ריפוי הפצע. גישה זו מפחיתה את מספר בעלי החיים המשמשים בניסוי, ולכן מפחיתה את העלויות הכלכליות תוך התאמה רבה יותר לאתיקה של בעלי חיים. מחקר זה יספק לחוקרים כלים חיוניים כדי להקל על פיתוח טיפולים חדשניים לפציעות כוויות ולחשוף את המנגנונים הפתופיזיולוגיים של ריפוי פצעי כוויות.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים במחקר זה נבדקו ואושרו על ידי הוועדה האתית של בית הספר לסטומטולוגיה של מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן (WCHSIRB-D-2024-499). עשרים וארבעה עכברים בני שמונה שבועות C57BL/6 (נקבה, משקל גוף 25-30 גרם) שימשו למחקר הנוכחי. פרטי הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת ציוד ועכבר לפני פציעת כוויה

1. רכשו את בעלי החיים ושיכנו אותם בכלובים למשך 7 ימים עם הגעתם כדי לאפשר להם להתאקלם בסביבה.
2. עקר את אזור העבודה על ידי ריסוס וניגוב עם 70% אתנול (v/v). מכסים את שולחן הניתוחים ברפידות סופגות כירורגיות סטריליות.
3. התאם את הטמפרטורה של מכשיר החימום הדיגיטלי ל-97 מעלות צלזיוס. מכשיר החימום מורכב משלושה חלקים (איור 1).
   הערה: ניתן לכוונן טמפרטורה בין 50-450 מעלות צלזיוס באמצעות בקר הטמפרטורה (איור 1A). בסיס המעמד משמש להצבת הקצה (איור 1B), הניתן לפירוק (איור 1C) כדי להחליף גדלים שונים של מכשירים. יש לחטא את הקצה ביודופור או באלכוהול.
4. להרדים את העכבר עם איזופלורן 5% ב-100% חמצן בתא אינדוקציה למשך 3 דקות (קצב זרימה: 4 ליטר לדקה) עד להאטת הנשימה. העריכו את עומק ההרדמה באמצעות בדיקת צביטה בבוהן.
   הערה: שאיפת איזופלורן עלולה להוביל לנמנום ולפגוע במערכת הלב וכלי הדם. חיוני ללבוש ציוד מגן ולטפל בו בתוך מכסה אדים באזור מאוורר היטב.
5. לאחר שהעכבר מורדם עמוק, העבירו אותו לכרית מחוממת במצב נוטה כדי לשמור על חום ולמנוע היפותרמיה במהלך ההתאוששות מההרדמה. הפחיתו את האיזופלורן ל-1. 5% חמצן לתחזוקה באמצעות חרוט אף.
6. מרחו ג'ל סיכה על שתי עיני העכבר בעזרת צמר גפן כדי למנוע ייבוש בקרנית.

2. גרימת פציעת כוויה בעובי מלא

הערה: התהליך הכללי של אינדוקציה וניתוח כוויות מוצג באיור 2.

1. לגלח את עור העכבר בעזרת מכונת גילוח חשמלית על שטח באורך של כ -5 ס"מ ורוחב של 4 ס"מ מהצוואר ועד הזנב. עבוד בעדינות כדי למנוע פציעה של העור בעת הגילוח (איור 3C).
2. השתמש באפליקטור עם קצה כותנה כדי למרוח קרם הסרת שיער על אזור העור המגולח למשך 3 דקות (איור 3D).
   הערה: הימנע ממריחת קרם האפילציה על חלקים אחרים של העכבר כדי למנוע כוויות, שעלולות להיות קשות לזיהוי. הקרם גרם לפריחות בעור בשימוש במשך יותר מ-5 דקות. משך הזמן המדויק ליעילות אופטימלית משתנה בין המוצרים וצריך להיקבע על ידי המפעיל.
3. נגבו את הקרם בעזרת גזה לחה עד שלא מזהים קרם ושיער. חיטוי אזור הניתוח עם קרצוף כלורהקסידין ואחריו 70% אתנול (v/v) שלוש פעמים כל אחד. יש לנקות ולייבש את האזור בעזרת גזה סטרילית.
4. השתמש בקצה פיפטה מעוקר של 1 מ"ל בקוטר 9 מ"מ (איור 3A) טבול בדיו מעוקר כדי לאתר במדויק את אתרי הפציעה הרצויים. עור הגב של העכבר מאופיין בטופוגרפיה לא אחידה. הגדרת אזור הפצע בנפרד מחוט השדרה של עכברים חיונית כדי להבטיח חזרתיות.
5. כסו את העור בווילון סטרילי שנגזז בעבר, והשאירו את אזור הניתוח פנוי (איור 3). לבש כפפות עמידות בחום ובדוק את הטמפרטורה של מכשיר החימום הדיגיטלי. לפני ואחרי השראת כוויה, יש לחטא את קצה המכשיר עם 70% אתנול (v/v).
6. מרחו את קצה מכשיר החימום על מרכז אתרי הפצע הממוקמים (97 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות) כדי ליצור שישה פצעים עגולים בקוטר של 4 מ"מ (איור 3B). המרווח בין כוויות סמוכות הוא 0.5-1 ס"מ. קבע את מספר הכוויות בהתאם לתכנון הניסוי.
   הערה: הכוויה נגרמת בעיקר על ידי הולכת חום; לכן, אין צורך להפעיל לחץ על המוט, כלומר לשמור אותו במגע עם העור על ידי כוח הכבידה בזמן השראת כוויה. היו שש כוויות לתכנון הניסוי. זהו המספר המקסימלי של פצעי כוויות שניתן לבנות בהתאם למכשיר בו השתמשנו ואזור הגב של העכבר. ניתן להשיג שכפולים מרובים של אותה קבוצת ניסוי על בסיס זה.

3. טיפול ומדידה לאחר כוויה

1. מרחו קרח על פצע הכוויה למשך 5 דקות כדי להפחית כאב פוטנציאלי לטיפול בכאב (איור 3G).
2. כבה את האיזופלורן, והסר את חרוט האף לאחר פציעת הכוויה. העבר את העכבר לכרית חימום עד שהעכבר זז כרגיל (למשל, לא כפוף או רועד).
3. הנח כל עכבר בכלוב התאוששות כדי למנוע מהם לשרוט אחד את השני. רככו כמה כדורי מזון על ידי הוספת 5-10 טיפות מי שתייה לכל כדור והניחו אותם על רצפת הכלוב כדי להקל על ההאכלה.
   הערה: עיקור הכלובים על ידי ריסוס וניגוב עם 70% אתנול (נפח/נפח). יש להחליף את המצעים באופן קבוע כדי לשמור על חום העכברים ולספוג שתן.
4. יש לתת בופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג) תת עורי במקום זנב פעמיים ביום למשך 3 ימים בסך הכל, תוך הקפדה על לפחות 8 שעות בין הזריקות.
5. נקה את כל הפצעים עם גזה סטרילית לחה במי מלח לאחר 24 שעות של השראת כוויה. יש למרוח את העור בגזה ולמרוח כמות קטנה של ג'ל אנטיבקטריאלי (הידרוג'ל TKH) באמצעות מזרק לכיסוי פצע הכוויה^12,14. חזור על הליך זה בימים 3, 7 ו-10 לאחר מכן.
6. השתמש בתחבושת נושמת ושקופה כדי לכסות את הפצעים. גודל התחבושת צריך לכסות כ-1 ס"מ סביב הפצע ולא לכסות את האזור ללא הסרת שיער.
   הערה: החלף את חבישת הפצע לפחות אחת ליומיים. שימוש ממושך בתחבושת ללא החלפה עלול להוביל לזיהום בפצע עם היווצרות מוגלה, וכתוצאה מכך לעיכוב בריפוי הפצע.
7. לאורך כל תקופת המעקב, יש למדוד את המשקל כל 2-3 ימים. באופן כללי, עכברים שמאבדים 15%-20% ממשקל גופם ההתחלתי צריכים להיות מוקרבים ולהוציא אותם מהניסוי.

4. איסוף פצעים

1. בגיל 0, 3, 7, 10 ו-14 ימים, סמנו את הפצע בקצה קצה פיפטה סטרילי של 1 מ"ל, והקליטו אותו במצלמה דיגיטלית.
2. המתת חסד של העכברים על ידי מנת יתר של הרדמה ופריקת צוואר הרחם (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד).
   הערה: היזהר במהלך פריקת צוואר הרחם כדי למנוע משיכה מוגזמת, שעלולה לפגוע בפצעי הגב.
3. בעזרת מספריים, בודד את מקום הפצע והעור שמסביב, כולל השרירים הבסיסיים (1 ס"מ על 1 ס"מ). התכוננו לפחות לשלוש דגימות לכל קבוצה.
4. יש לקבע את דגימות העור ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 24 שעות ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. נפח הקיבוע חייב להיות פי 30 מנפח הרקמה^15,16.
   הערה: PFA מסוכן. הקפידו לעבוד באזור מאוורר היטב והשתמשו בציוד מגן מתאים.

5. הערכת ריפוי פצעים

1. שטפו את רקמת הפצע פעמיים עם PBS ומרחו אותה עם נייר פילטר, אותו יש לקצץ לגודל מתאים (איור 2H). בשל נוכחותו של תוכן רירי כלשהו בתוך שכבת הרקמה התת עורית, הוא נצמד למשטח נייר הסינון ללא תנועה או סלסול רקמות.
   1. הכניסו את נייר הסינון והדגימה לקלטת טישו להתייבשות פרפין כדי לקבל דגימות רקמה חלקות יחסית ולאחר מכן הטמיעו את הרקמה^15,16. יש לאחסן דגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: מתחו את הרקמה ככל האפשר והימנעו מכל קיפול, מכיוון שהקפלים הללו יהפכו לקבועים לאחר הקיבוע.
2. חותכים את הדגימות המשובצות בפרפין למקטעים בעובי של 5 מיקרומטר ומכתימים שקופיות באמצעות H&E וטריכרום של מאסון להערכת היקף רקמת הגרנולציה, היווצרות אנגיוגנזה ושקיעת קולגן, ומספקים ראיות להערכת השלבים השונים והתקדמות ריפוי הפצע^17,18.
3. צלם תמונות של כל הדגימות באמצעות מיקרוסקופ עם מטרה של פי 40.
4. השתמש בתוכנה תואמת כדי לנתח את קטע העור המוכתם, כולל האפידרמיס, הדרמיס, הרקמה התת עורית ומצב השרירים.

תוצאות

בפרוטוקול זה, פצעי כוויה דמויי לוח שחמט נוצרו עם משך צריבה של 10 שניות ב-97 מעלות צלזיוס על ידי התקן החימום הדיגיטלי (איור 1). קצה המכשיר עשוי מנחושת טהורה, הידועה בהולכת החום המצוינת וביכולות החימום המהירות שלה. האחיזה המוחזקת על ידי הנסיין עשויה מחומר פוליק...

Discussion

עבור מחקרי כוויות, מודלים במבחנה מתמקדים בדרך כלל בהשפעות המעכבות של חומרים אנטי-מיקרוביאליים מקומיים או אנטיביוטיקה על חיידקים הקשורים לכוויות, כגון Staphylococcus aureus ו-Pseudomonas aeruginosa¹⁹, כמו גם בהשפעה של חומרים ביולוגיים שונים (כמו אלסטין, משי וחבישו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette tip	KIRGEN,USA	KG1333	Used to locate burn wound sites
3 M Tegaderm film	3M,USA	1624WCN 6 cm x 7 cm	For the wound cover after burn induction
4% paraformaldehyde(PFA)	Biosharp,China	BL539A	Used to fix the skin samples
Buprenorphine	Sigma-Aldrich,USA	PHR8955-50MG	For the pain management of the mice
C57BL/6 mice	Chengdu Dashuo experimental animal company,China	none	For the establishment of burn model
Depilatory cream	Veet,China	—	For the dorsum hair removal of the mice
Digital Heating Device	Shenzhen Kapper Technology Company,China	No.936D	For the burn induction of the mice
Electric shaver	AUX,China	AUX-A5	For the dorsum hair removal of the mice
Filter paper	—	—	Used to unfold of the skin samples
GraphPad software	—	GraphPad prism 9.5.0	For the analysis of burn wound area
Heat-resistant gloves	—	—	Used to hold the digital heating device tip
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Solarbio,China	G1120	For the histological analysis of the slides
ImageJ software	—	ImageJ 1.54f	For the analysis of burn wound area
Isoflurane	RWD,China	R510-22-10	For the anesthesia of the mice
Masson's Trichrome Stain Kit	Solarbio,China	G1340	For the histological analysis of the slides
Microscope	Olympus,Japan	VS200 ASW	Used to scan the H&E and Masson stained slides
Tissue cassette	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD,China	31050102W	For tissue paraffin dehydration and paraffin embedding