Modèle de cicatrisation des brûlures en forme d’échiquier de souris basé sur un dispositif de chauffage numérique

Résumé

Un protocole simplifié est présenté pour établir un modèle de cicatrisation des brûlures chez la souris à l’aide d’un appareil de chauffage numérique. Les sites expérimentaux en forme d’échiquier créés sur la peau facilitent une analyse fonctionnelle plus poussée pour le test de cicatrisation des plaies.

Résumé

Les brûlures graves sont parmi les affections les plus traumatisantes et les plus débilitantes, affectant presque tous les systèmes organiques et entraînant une morbidité et une mortalité considérables. Compte tenu de leur complexité et de l’implication de plusieurs organes, divers modèles animaux ont été créés pour reproduire différentes facettes des brûlures. Les méthodes utilisées pour produire des surfaces brûlées varient selon les modèles animaux expérimentaux. Cette étude décrit un modèle simple, rentable et convivial de brûlure chez la souris pour créer des brûlures constantes sur toute l’épaisseur à l’aide d’un appareil de chauffage numérique. La pointe de cet appareil a été appliquée sur le dos de souris pendant 10 s à 97 °C pour établir une brûlure semblable à un échiquier et examiner la cicatrisation des plaies sous le traitement d’un pansement expérimental. Des échantillons de peau ont été prélevés pour une analyse histologique, y compris la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) et la coloration de Masson. La cicatrisation de la plaie a été évaluée par l’analyse de la zone de la plaie et l’examen microscopique de l’infiltration inflammatoire, de la réépithélialisation et de la formation de tissu de granulation. Le modèle des brûlures chez la souris peut servir d’outil fondamental dans l’étude de la physiopathologie des lésions thermiques et l’évaluation des interventions thérapeutiques.

Introduction

Les brûlures sont considérées comme l’une des blessures critiques de la peau, causées par l’exposition à la chaleur, à l’électricité, aux produits chimiques et à l’exposition aux radiations ^1,2. Il peut être classé en quatre degrés en fonction de la profondeur de la blessure, allant de l’épiderme à toute l’épaisseur de la peau, et même des muscles et des os. De petites brûlures peuvent entraîner la formation de cicatrices et augmenter le risque d’infection. Une grande partie des brûlures cause non seulement des dommages locaux, mais stimule également des troubles du cœur, des reins et d’autres organes ou systèmes du corps par le biais d’une inflammation et de réponses immunitaires graves et à long terme, entraînant des conséquences systémiques graves et une morbidité élevée³. La plupart des survivants de brûlures s’accompagnent d’incapacités physiques durables, de détresse émotionnelle et d’une diminution de la qualité de vie ^4,5. Par conséquent, il est important d’étudier le processus pathologique des brûlures et les mécanismes de régénération des tissus brûlés.

Impliquées dans les réponses immunitaires, la régénération des tissus et l’homéostasie systématique, les études in vitro n’ont pas pu étudier de manière exhaustive le processus pathologique de cicatrisation des brûlures. Ainsi, au cours des deux dernières décennies, afin d’explorer des interventions thérapeutiques potentielles, différents modèles animaux de cicatrisation des brûlures ont été développés pour reproduire les diverses caractéristiques des brûlures ^6,7. Les brûlures sont généralement produites sur la surface du dos des porcs, des rats, des souris, des lapins et d’autres animaux après l’épilation. Le temps de combustion peut durer de 3 s à 30 s pour former des dommages thermiques de partie à pleine épaisseur avec une plage de 5 % à 30 % de la surface totale du corps (TBSA)⁸. Il n’existe actuellement aucun modèle normalisé de ces méthodes dans la recherche sur les animaux brûlés en raison de la grande variabilité des techniques utilisées. Les méthodes utilisées pour produire des surfaces brûlées varient selon les modèles d’animaux expérimentaux, y compris la flamme de gaz⁹, le bain d’éthanol^{brûlant 10}, la plaque ou la barre métallique unique préchauffée^11,12, l’eau bouillante ou chaude^13,14. Cependant, la technique d’infliction des brûlures et la profondeur de la brûlure produite sont souvent incohérentes et mal décrites dans les études précédentes, ce qui est crucial pour déterminer la gravité de la brûlure et la méthode de traitement des brûlures.

Cette étude vise à développer un modèle animal de brûlure de souris simple, rentable et convivial pour créer des brûlures cohérentes sur toute l’épaisseur dans des scénarios cliniques simulés. Dans ce protocole, nous avons utilisé un appareil de chauffage numérique pratique pour contrôler la profondeur de la brûlure en ajustant la température appliquée à la peau. L’extrémité de cet appareil peut être commutée à différentes tailles pour induire des brûlures thermiques avec différentes plages de TBSA. Cela permet de créer une brûlure semblable à un échiquier sur le dos de la souris, ce qui permet de comparer plusieurs traitements expérimentaux et de contrôle au sein d’un même animal. Nous avons observé et enregistré le processus de fermeture de la plaie. Des échantillons de peau ont été prélevés pour une évaluation histologique (coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) et coloration trichrome de Masson) à différents stades de la cicatrisation de la plaie. Cette approche réduit le nombre d’animaux utilisés dans l’expérience et, par conséquent, réduit les coûts économiques tout en étant plus compatible avec l’éthique animale. Cette étude fournira aux chercheurs des outils essentiels pour faciliter la mise au point de nouveaux traitements pour les brûlures et révéler les mécanismes physiopathologiques de la cicatrisation des brûlures.

Protocole

Toutes les procédures animales de cette étude ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique de l’École de stomatologie de l’Ouest de la Chine de l’Université du Sichuan (WCHSIRB-D-2024-499). Vingt-quatre souris C57BL/6 âgées de huit semaines (femelles, poids corporel de 25 à 30 g) ont été utilisées pour la présente étude. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation de l’équipement et de la souris avant les brûlures

1. Acquérez les animaux et hébergez-les dans des cages pendant 7 jours à leur arrivée pour leur permettre de s’acclimater à l’environnement.
2. Stérilisez la zone de travail en pulvérisant et en essuyant avec de l’éthanol à 70 % (v/v). Couvrez la table d’opération avec des tampons absorbants chirurgicaux stériles.
3. Réglez la température de l’appareil de chauffage numérique à 97 °C. Le dispositif de chauffage se compose de trois parties (Figure 1).
   REMARQUE : La température de 50 à 450 °C peut être réglée à l’aide du régulateur de température (Figure 1A). La base du support sert à placer l’embout (Figure 1B), qui peut être démonté (Figure 1C) pour remplacer différentes tailles d’instruments. Désinfectez l’embout avec de l’iodophore ou de l’alcool.
4. Anesthésier la souris avec de l’isoflurane à 5 % dans de l’oxygène à 100 % dans une chambre d’induction pendant 3 min (débit : 4 L/min) jusqu’à ce que la respiration ait ralenti. Évaluez la profondeur de l’anesthésie à l’aide d’un test de pincement des orteils.
   REMARQUE : L’inhalation d’isoflurane peut entraîner de la somnolence et endommager le système cardiovasculaire. Il est essentiel de porter un équipement de protection et de le manipuler à l’intérieur d’une hotte dans un endroit bien ventilé.
5. Une fois que la souris est profondément anesthésiée, transférez-la sur un coussin chauffant en position couchée pour maintenir la chaleur et prévenir l’hypothermie pendant la récupération de l’anesthésie. Réduire l’isoflurane à 1. 5 % d’oxygène pour l’entretien via un cône nasal.
6. Appliquez du gel lubrifiant sur les deux yeux de la souris à l’aide d’un coton-tige pour éviter le dessèchement de la cornée.

2. Induire des brûlures sur toute l’épaisseur

REMARQUE : Le processus général d’induction et d’analyse de la brûlure est illustré à la figure 2.

1. Rasez la peau de la souris avec un rasoir électrique sur une zone d’environ 5 cm de long et 4 cm de large du cou à la queue. Travaillez doucement pour éviter de blesser la peau lors du rasage (Figure 3C).
2. À l’aide d’un applicateur à embout cotonnier, appliquez une crème dépilatoire sur la peau rasée pendant 3 min (Figure 3D).
   REMARQUE : Évitez d’appliquer la crème dépilatoire sur d’autres parties de la souris pour éviter les brûlures, qui peuvent être difficiles à détecter. La crème a provoqué des éruptions cutanées si elle est utilisée pendant plus de 5 minutes. La durée précise pour une efficacité optimale varie d’un produit à l’autre et doit être déterminée par l’opérateur.
3. Essuyez la crème à l’aide d’une gaze humide jusqu’à ce que la crème et les cheveux ne soient plus détectés. Désinfectez la zone chirurgicale avec un gommage à la chlorhexidine suivi d’éthanol à 70 % (v/v) trois fois chacun. Nettoyez et séchez la zone avec de la gaze stérile.
4. Utilisez une pointe de pipette stérilisée de 1 ml d’un diamètre de 9 mm (figure 3A) trempée dans de l’encre stérilisée pour localiser avec précision les sites de blessure souhaités. La peau dorsale murine est caractérisée par une topographie inégale. Définir la zone de la plaie en dehors de la moelle épinière des souris est essentiel pour assurer la répétabilité.
5. Couvrez la peau avec un champ stérile préalablement coupé, en laissant la zone chirurgicale libre (Figure 3). Mettez des gants résistants à la chaleur et vérifiez la température de l’appareil de chauffage numérique. Avant et après l’induction de la brûlure, désinfectez l’extrémité de l’appareil avec de l’éthanol à 70 % (v/v).
6. Appliquez l’extrémité de l’appareil de chauffage au centre des sites de plaie localisés (97 °C pendant 10 s) pour créer six plaies rondes d’un diamètre de 4 mm (Figure 3B). L’intervalle entre les brûlures adjacentes est de 0,5 à 1 cm. Déterminer le nombre de brûlures selon le plan d’expérience.
   REMARQUE : La brûlure est causée principalement par la conduction thermique ; Par conséquent, il n’est pas nécessaire d’exercer une pression sur la tige, c’est-à-dire de la maintenir en contact avec la peau par gravité pendant l’induction de la brûlure. Il y a eu six brûlures pour le plan expérimental. Il s’agit du nombre maximum de brûlures qui peuvent être construites en fonction de l’appareil que nous avons utilisé et de la zone du dos de la souris. Sur cette base, plusieurs répétitions du même groupe expérimental peuvent être réalisées.

3. Soins et mesures post-brûlure

1. Appliquez de la glace sur la brûlure pendant 5 minutes pour réduire la douleur potentielle pour la gestion de la douleur (figure 3G).
2. Éteignez l’isoflurane et retirez le cône nasal après la brûlure. Transférez la souris sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle se déplace normalement (par exemple, qu’elle ne soit pas accroupie ou qu’elle ne tremble pas).
3. Placez chaque souris dans une cage de récupération pour éviter qu’elles ne se griffent les unes les autres. Ramollissez quelques granulés de nourriture en ajoutant 5 à 10 gouttes d’eau potable à chaque granulés et placez-les sur le sol de la cage pour faciliter l’alimentation.
   REMARQUE : Stériliser les cages par pulvérisation et essuyage avec de l’éthanol à 70 % (vol/vol). La litière doit être remplacée régulièrement pour garder les souris au chaud et pour absorber l’urine.
4. Administrer la buprénorphine (0,1 mg/kg) par voie sous-cutanée dans une zone caudale deux fois par jour pendant un total de 3 jours, en veillant à ce qu’il y ait au moins 8 heures entre les injections.
5. Nettoyez toutes les plaies avec de la gaze stérile imbibée de solution saline après 24 h d’induction de la brûlure. Épongez la peau avec de la gaze et appliquez une petite quantité de gel antibactérien (hydrogel TKH) à l’aide d’une seringue pour couvrir la brûlure^12,14. Répétez cette procédure les jours 3, 7 et 10 par la suite.
6. Utilisez un pansement respirant et transparent pour couvrir les plaies. La taille du pansement doit couvrir environ 1 cm autour de la plaie et ne doit pas couvrir la zone sans épilation.
   REMARQUE : Changez le pansement au moins une fois tous les 2 jours. L’utilisation prolongée du pansement sans remplacement peut entraîner une infection de la plaie avec formation de pus, entraînant un retard de cicatrisation de la plaie.
7. Tout au long de la période de suivi, mesurez le poids tous les 2-3 jours. En général, les souris qui perdent 15 à 20 % de leur poids corporel initial doivent être sacrifiées et retirées de l’expérience.

4. Collecte de la plaie

1. À 0, 3, 7, 10 et 14 jours, marquez la plaie avec la pointe d’une pointe de pipette stérile de 1 ml et notez-la avec un appareil photo numérique.
2. Euthanasier les souris par surdose d’anesthésie et luxation cervicale (selon les protocoles approuvés par l’établissement).
   REMARQUE : Soyez prudent pendant la luxation cervicale pour éviter une traction excessive, qui pourrait endommager les plaies dorsales.
3. À l’aide de ciseaux, isolez le site de la plaie et la peau environnante, y compris la musculature sous-jacente (1 cm x 1 cm). Préparez-vous à recevoir au moins trois échantillons pour chaque groupe.
4. Fixer les échantillons de peau dans du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pendant 24 h et les conserver à 4 °C. Le volume fixateur doit être 30 fois le volume tissulaire^15,16.
   REMARQUE : Le PFA est dangereux. Assurez-vous de travailler dans un endroit bien ventilé et d’utiliser un équipement de protection approprié.

5. Évaluation de la cicatrisation des plaies

1. Lavez le tissu de la plaie deux fois avec du PBS et étalez-le avec du papier filtre, qui doit être coupé à une taille appropriée (Figure 2H). En raison de la présence d’un certain contenu muqueux dans la couche de tissu sous-cutané, il adhère à la surface du papier filtre sans mouvement ni enroulement des tissus.
   1. Mettez le papier filtre et l’échantillon dans une cassette de tissu pour la déshydratation de la paraffine afin d’obtenir des échantillons de tissu relativement lisses, puis encastrez le tissu^15,16. Conserver les échantillons à 4 °C.
      REMARQUE : Étirez le tissu autant que possible et évitez tout pliage, car ces plis deviendront permanents après la fixation.
2. Coupez les échantillons enrobés de paraffine en sections de 5 μm d’épaisseur et colorez les lames via H&E et trichrome de Masson pour évaluer l’étendue du tissu de granulation, la formation de l’angiogenèse et le dépôt de collagène, fournissant des preuves pour évaluer les différentes étapes et la progression de la cicatrisation de la plaie^17,18.
3. Capturez des images de tous les échantillons à l’aide d’un microscope avec un objectif 40x.
4. Utilisez un logiciel compatible pour analyser la section de peau tachée, y compris l’épiderme, le derme, le tissu sous-cutané et l’état musculaire.

Résultats

Dans ce protocole, des brûlures semblables à celles d’un échiquier ont été créées avec une durée de combustion de 10 s à 97 °C par le dispositif de chauffage numérique (Figure 1). L’embout de l’appareil est en cuivre pur, connu pour son excellente conduction thermique et ses capacités de chauffage rapide. La poignée tenue par l’expérimentateur est en polycarbonate, qui offre une résistance à la chaleur et une ininflammabilité. Par ra...

Discussion

Pour les études sur les brûlures, les modèles in vitro se concentrent généralement sur les effets inhibiteurs des agents antimicrobiens locaux ou des antibiotiques sur les bactéries associées aux brûlures, telles que Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa¹⁹, ainsi que sur l’impact de divers biomatériaux (comme l’élastine, la soie et les pansements d’hydrogel^14,20

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette tip	KIRGEN,USA	KG1333	Used to locate burn wound sites
3 M Tegaderm film	3M,USA	1624WCN 6 cm x 7 cm	For the wound cover after burn induction
4% paraformaldehyde(PFA)	Biosharp,China	BL539A	Used to fix the skin samples
Buprenorphine	Sigma-Aldrich,USA	PHR8955-50MG	For the pain management of the mice
C57BL/6 mice	Chengdu Dashuo experimental animal company,China	none	For the establishment of burn model
Depilatory cream	Veet,China	—	For the dorsum hair removal of the mice
Digital Heating Device	Shenzhen Kapper Technology Company,China	No.936D	For the burn induction of the mice
Electric shaver	AUX,China	AUX-A5	For the dorsum hair removal of the mice
Filter paper	—	—	Used to unfold of the skin samples
GraphPad software	—	GraphPad prism 9.5.0	For the analysis of burn wound area
Heat-resistant gloves	—	—	Used to hold the digital heating device tip
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Solarbio,China	G1120	For the histological analysis of the slides
ImageJ software	—	ImageJ 1.54f	For the analysis of burn wound area
Isoflurane	RWD,China	R510-22-10	For the anesthesia of the mice
Masson's Trichrome Stain Kit	Solarbio,China	G1340	For the histological analysis of the slides
Microscope	Olympus,Japan	VS200 ASW	Used to scan the H&E and Masson stained slides
Tissue cassette	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD,China	31050102W	For tissue paraffin dehydration and paraffin embedding