基于数字加热装置的小鼠棋盘样烧伤创面愈合模型

摘要

提出了一种简化的方案，用于使用数字加热设备在小鼠中建立烧伤创面愈合模型。在皮肤上创建的棋盘状实验位点有助于伤口愈合测定的进一步功能分析。

摘要

严重烧伤是最具创伤性和身体衰弱性的疾病之一，几乎影响每个器官系统，并导致相当高的发病率和死亡率。鉴于它们的复杂性和多个器官的参与，已经创建了各种动物模型来复制烧伤的不同方面。用于产生烧焦表面的方法因实验动物模型而异。本研究描述了一种简单、经济高效且用户友好的小鼠烧伤模型，用于使用数字加热设备创建一致的全层烧伤。将该装置的尖端在 97 °C 下应用于小鼠背部 10 秒，以建立棋盘状烧伤，并在实验敷料处理下检查伤口愈合情况。收集皮肤样本进行组织学分析，包括苏木精和伊红 （H&E） 染色和 Masson 染色。通过分析伤口区域和显微镜检查炎性浸润、再上皮化和肉芽组织形成来评估伤口愈合。小鼠烧伤模型可以作为研究热损伤的病理生理学和评估治疗干预的基本工具。

引言

烧伤被认为是皮肤的严重损伤之一，由热暴露、电流、化学材料和辐射暴露引起 ^1,2。根据受伤的深度，它可以分为四个度，从表皮到皮肤的整个厚度，甚至肌肉和骨骼。小面积烧伤会导致疤痕形成并增加感染的风险。大面积烧伤不仅造成局部损伤，还会通过严重和长期的炎症和免疫反应刺激身体的心脏、肾脏和其他器官或系统的疾病，导致严重的全身性后果和高发病率³。大多数烧伤幸存者都伴有长期的身体残疾、情绪困扰和生活质量下降 ^4,5。因此，研究烧伤的病理过程和烧伤组织再生的机制非常重要。

参与免疫反应、组织再生和系统稳态，体外研究无法全面调查烧伤创面愈合的病理过程。因此，在过去的二十年里，为了探索潜在的治疗干预措施，开发了不同的烧伤伤口愈合动物模型来复制烧伤的各种特征 ^6,7。烧伤伤口通常在猪、大鼠、小鼠、兔子和其他动物脱毛后的背表面产生。燃烧时间可持续 3 秒至 30 秒，形成部分至全层热损伤，范围为 5% 至 30% 的体表面积 （TBSA）⁸。由于所用技术的高度可变性，目前在烧伤动物研究中没有这些方法的标准化模型。用于产生燃烧表面的方法因实验动物模型而异，包括气体火焰⁹、燃烧乙醇浴¹⁰、预热的单金属板/棒^11,12、沸腾或热水^13,14。然而，烧伤技术和产生的烧伤深度在以前的研究中往往不一致且描述不佳，这对于确定烧伤的严重程度和烧伤治疗方法至关重要。

本研究旨在开发一种简单、经济高效且用户友好的小鼠烧伤动物模型，用于在模拟临床场景中创建一致的全层烧伤。在这个协议中，我们使用了一个方便的数字加热设备，通过调整施加在皮肤上的温度来控制烧伤的深度。该装置的尖端可以切换到不同的尺寸，以诱导具有不同范围的 TBSA 的热灼伤。这允许在小鼠的背部形成一个棋盘状的烧伤伤口，从而能够在同一只动物中比较几种实验和对照治疗。我们观察并记录了伤口闭合过程。在伤口愈合的不同阶段收集皮肤样本用于组织学评估 （苏木精和伊红 （H&E） 染色和 Masson 三色染色）。这种方法减少了实验中使用的动物数量，因此降低了经济成本，同时更符合动物伦理。这项研究将为研究人员提供必要的工具，以促进烧伤新疗法的开发，并揭示烧伤创面愈合的病理生理机制。

研究方案

本研究中的所有动物程序均由四川大学华西口腔医学院伦理委员会 （WCHSIRB-D-2024-499） 审查和批准。本研究使用 24 只 8 周龄 C57BL/6 小鼠 （雌性，体重 25-30 g）。材料 表中列出了试剂和所用设备的详细信息。

1. 烧伤前准备设备和鼠标

1. 购买动物并在抵达后将它们关在笼子里 7 天，让它们适应环境。
2. 通过喷涂和用 70% 乙醇 （v/v） 擦拭对工作区域进行消毒。用无菌手术吸水垫盖住手术台。
3. 将数字加热设备的温度调节至 97 °C。 加热装置由三部分组成（图 1）。
   注意:50-450 °C 的温度可以通过温度控制器调节（图 1A）。支架底座用于放置尖端（图 1B），可以拆卸（图 1C）以更换不同尺寸的仪器。用碘伏或酒精消毒尖端。
4. 在诱导室中用 5% 异氟醚的 100% 氧气溶液麻醉小鼠 3 分钟（流速:4 L/min），直到呼吸减慢。使用脚趾捏试验评估麻醉深度。
   注意:吸入异氟醚可能会导致嗜睡并损害心血管系统。必须佩戴防护设备并在通风良好的通风橱内处理。
5. 鼠标深度麻醉后，将其转移到俯卧位的加热垫上，以保持温暖并防止在麻醉恢复期间出现体温过低。将异氟醚减少到 1.5% 氧气， 用于通过 鼻锥进行维护。
6. 用棉签将润滑凝胶涂抹在小鼠的双眼上，以防止角膜干燥。

2. 诱发全层烧伤

注意:烧伤诱导和分析的一般过程如图 2 所示。

1. 用电动剃须刀从脖子到尾巴在大约 5 厘米长和 4 厘米宽的区域上剃掉鼠标的皮肤。轻轻工作，以免剃须时伤到皮肤（图 3C）。
2. 使用棉签涂抹器在剃光的皮肤区域涂抹脱毛霜 3 分钟（图 3D）。
   注意:避免将脱毛霜涂抹在鼠标的其他部位，以防止灼伤，因为灼伤很难察觉。如果使用超过 5 分钟，乳膏会引起皮疹。最佳疗效的确切持续时间因产品而异，应由作员确定。
3. 使用湿纱布擦去乳霜，直到未检测到乳霜和头发。用洗必泰磨砂膏消毒手术区域，然后用 70% 乙醇 （v/v） 消毒，每次 3 次。用无菌纱布清洁并擦干该区域。
4. 使用直径为 9 毫米的消毒 1 mL 移液器吸头（图 3A）蘸取消毒墨水以准确定位所需的伤口部位。小鼠背侧皮肤的特征是地形不均匀。定义小鼠脊髓以外的伤口区域对于确保可重复性至关重要。
5. 用先前修剪的无菌窗帘覆盖皮肤，留下手术区域（图 3）。戴上耐热手套并检查数字加热设备的温度。在燃烧诱导之前和之后，用 70% 乙醇 （v/v） 对设备的尖端进行消毒。
6. 将加热装置的尖端应用于定位伤口部位的中心（97°C，持续 10 秒），以创建六个直径为 4 毫米的圆形伤口（图 3B）。相邻烧伤之间的间隔为 0.5-1 厘米。根据实验设计确定燃烧次数。
   注意:烧伤主要由热传导引起;因此，无需对棒施加压力，即在烧伤诱导时通过重力使其与皮肤接触。实验设计有 6 次烧伤。这是根据我们使用的设备和鼠标背的面积可以构建的最大烧伤伤口数量。在此基础上可以实现同一实验组的多次重复。

3. 烧伤后的护理和测量

1. 将冰敷在烧伤伤口上 5 分钟，以减少疼痛管理的潜在疼痛（图 3G）。
2. 关闭异氟醚，烧伤后取下鼻锥。将鼠标转移到加热垫上，直到鼠标正常移动（例如，不蹲下或颤抖）。
3. 将每只鼠标放在恢复笼中，以防止它们相互刮伤。向每个颗粒中加入 5-10 滴饮用水来软化一些食物颗粒，并将它们放在笼子地板上，以便于喂食。
   注意: 通过喷涂和用 70% 乙醇擦拭（vol/vol）对笼子进行消毒。应定期更换垫料以保持小鼠温暖并吸收尿液。
4. 每天两次在尾部位置皮下注射丁丙诺啡 （0.1 mg/kg），总共 3 天，确保注射之间至少 8 小时。
5. 烧伤诱导 24 小时后，用蘸有盐水的无菌纱布清洁所有伤口。用纱布吸干皮肤，并使用注射器涂抹少量抗菌凝胶（TKH 水凝胶）以覆盖烧伤伤口^12,14。此后在第 3 天、第 7 天和第 10 天重复此过程。
6. 使用透气、透明的敷料覆盖伤口。敷料的大小应覆盖伤口周围约 1 厘米，并且不应覆盖未脱毛的区域。
   注意:至少每 2 天更换一次伤口敷料。长期使用敷料而不更换敷料可能会导致伤口感染并形成脓液，从而导致伤口愈合延迟。
7. 在整个随访期间，每 2-3 天测量一次体重。通常，应处死减轻初始体重 15%-20% 的小鼠并从实验中移除。

4. 伤口收集

1. 在第 0 、 3 、 7 、 10 和 14 天，用无菌 1 mL 移液器吸头的尖端标记伤口，并用数码相机记录。
2. 通过过量的麻醉和宫颈脱位对小鼠实施安乐死（遵循机构批准的方案）。
   注意:颈椎脱位时要小心，避免过度拉扯，这可能会损坏背侧伤口。
3. 用剪刀隔离伤口部位和周围皮肤，包括下面的肌肉组织 （1 cm x 1 cm）。每组至少准备三个样品。
4. 将皮肤标本在 4% 多聚甲醛 （PFA） 中固定 24 小时，并在 4 °C 下储存。 固定体积必须为组织体积^15,16 的 30 倍。
   注意:PFA 是危险的。确保在通风良好的地方工作并使用适当的防护设备。

5. 伤口愈合评估

1. 用 PBS 清洗伤口组织两次，并用滤纸铺开，应将其修剪成合适的尺寸（图 2H）。由于皮下组织层中存在一些粘液内容物，它粘附在滤纸表面而不会移动或组织卷曲。
   1. 将滤纸和样品放入组织盒中进行石蜡脱水，得到相对光滑的组织样品，然后包埋组织^15,16。将样品储存在 4 °C。
      注意:尽可能拉伸组织并避免任何折叠，因为这些褶皱在固定后会变成永久性的。
2. 将石蜡包埋的样品切成 5 μm 厚的切片，并通过 H&E 和 Masson 三色染色载玻片，以评估肉芽组织的程度、血管生成形成和胶原蛋白沉积，为评估伤口愈合的不同阶段和进展提供证据^17,18。
3. 使用具有 40 倍物镜的显微镜捕获所有样品的图像。
4. 使用兼容的软件分析染色的皮肤切片，包括表皮、真皮、皮下组织和肌肉状况。

结果

在该方案中，通过数字加热装置在 97 °C 下创建棋盘状烧伤伤口，烧伤持续时间为 10 秒（图 1）。该设备的尖端由纯铜制成，以其出色的导热和快速加热能力而闻名。实验者握住的手柄由聚碳酸酯材料制成，具有耐热性和不易燃性。与预热的单金属板/棒或沸腾或热水方法相比，该设备表现出卓越的安全性能，并减少了小鼠的麻醉时间，从而缩短了整...

讨论

对于烧伤研究，体外模型通常关注局部抗菌剂或抗生素对烧伤相关细菌的抑制作用，例如金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌 ¹⁹，以及各种生物材料（如弹性蛋白、丝绸和水凝胶敷料^14,20 的影响） 对烧伤后炎症细胞（如中性粒细胞、巨噬细胞）或干细胞（如间充质干细胞）的影响。这些实验通...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette tip	KIRGEN,USA	KG1333	Used to locate burn wound sites
3 M Tegaderm film	3M,USA	1624WCN 6 cm x 7 cm	For the wound cover after burn induction
4% paraformaldehyde(PFA)	Biosharp,China	BL539A	Used to fix the skin samples
Buprenorphine	Sigma-Aldrich,USA	PHR8955-50MG	For the pain management of the mice
C57BL/6 mice	Chengdu Dashuo experimental animal company,China	none	For the establishment of burn model
Depilatory cream	Veet,China	—	For the dorsum hair removal of the mice
Digital Heating Device	Shenzhen Kapper Technology Company,China	No.936D	For the burn induction of the mice
Electric shaver	AUX,China	AUX-A5	For the dorsum hair removal of the mice
Filter paper	—	—	Used to unfold of the skin samples
GraphPad software	—	GraphPad prism 9.5.0	For the analysis of burn wound area
Heat-resistant gloves	—	—	Used to hold the digital heating device tip
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Solarbio,China	G1120	For the histological analysis of the slides
ImageJ software	—	ImageJ 1.54f	For the analysis of burn wound area
Isoflurane	RWD,China	R510-22-10	For the anesthesia of the mice
Masson's Trichrome Stain Kit	Solarbio,China	G1340	For the histological analysis of the slides
Microscope	Olympus,Japan	VS200 ASW	Used to scan the H&E and Masson stained slides
Tissue cassette	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD,China	31050102W	For tissue paraffin dehydration and paraffin embedding