Dijital Isıtma Cihazına Dayalı Farelerin Satranç Tahtası Benzeri Yanık Yara İyileşme Modeli

Özet

Dijital bir ısıtma cihazı kullanan farelerde bir yanık yarası iyileşme modeli oluşturmak için aerodinamik bir protokol sunulmuştur. Deri üzerinde oluşturulan satranç tahtası benzeri deney bölgeleri, yara iyileşme testi için daha fazla fonksiyonel analizi kolaylaştırır.

Özet

Ciddi yanık yaralanmaları, hemen hemen her organ sistemini etkileyen ve önemli morbidite ve mortalite ile sonuçlanan en travmatik ve fiziksel olarak zayıflatıcı durumlar arasındadır. Karmaşıklıkları ve birden fazla organın katılımı göz önüne alındığında, yanık yaralanmasının farklı yönlerini çoğaltmak için çeşitli hayvan modelleri oluşturulmuştur. Yanmış yüzeyler üretmek için kullanılan yöntemler deney hayvanı modelleri arasında farklılık gösterir. Bu çalışma, bir dijital ısıtma cihazı kullanarak tutarlı tam kalınlıkta yanıklar oluşturmak için basit, uygun maliyetli ve kullanıcı dostu bir fare yanığı modelini açıklamaktadır. Bu cihazın ucu, satranç tahtası benzeri bir yanık oluşturmak ve deneysel bir pansuman tedavisi altında yara iyileşmesini incelemek için 97 ° C'de 10 saniye boyunca farelerin sırtına uygulandı. Hematoksilen ve Eozin (H & E) boyaması ve Masson boyaması dahil olmak üzere histolojik analiz için cilt örnekleri toplandı. Yara iyileşmesi, yara alanının analizi ve inflamatuar infiltrasyon, yeniden epitelizasyon ve granülasyon dokusu oluşumunun mikroskobik incelemesi ile değerlendirildi. Fare yanığı yaralanması modeli, termal yaralanmaların patofizyolojisini incelemede ve terapötik müdahaleleri değerlendirmede temel bir araç olarak hizmet edebilir.

Giriş

Yanıklar, ısıya maruz kalma, elektrik, kimyasal maddeler ve radyasyona maruz kalmanın neden olduğu ciltteki kritik yaralanmalardan biri olarak kabul edilir ^1,2. Yaralanmanın derinliğine bağlı olarak, epidermisten cildin tam kalınlığına ve hatta kaslara ve kemiklere kadar dört dereceye kadar sınıflandırılabilir. Küçük yanıklar yara izi oluşumuna yol açabilir ve enfeksiyon riskini artırabilir. Geniş bir yanık yaralanması alanı sadece lokal hasara neden olmakla kalmaz, aynı zamanda ciddi ve uzun süreli iltihaplanma ve bağışıklık tepkileri yoluyla vücudun kalbi, böbrekleri ve diğer organ veya sistemlerindeki bozuklukları uyararak ciddi sistemik sonuçlara ve yüksek morbiditeye yol açar³. Yanık yaralanmasından kurtulanların çoğuna uzun süreli fiziksel engeller, duygusal sıkıntı ve düşük yaşam kalitesi eşlik eder ^4,5. Bu nedenle, yanıkların patolojik sürecini ve yanmış dokunun yenilenme mekanizmalarını incelemek önemlidir.

İmmün yanıtlar, doku rejenerasyonu ve sistematik homeostaz ile ilgili olan in vitro çalışmalar, yanık yarası iyileşmesinin patolojik sürecini kapsamlı bir şekilde araştıramamıştır. Bu nedenle, son yirmi yılda, potansiyel terapötik müdahaleleri araştırmak için, yanık yaralanmasının çeşitli özelliklerini çoğaltmak için farklı yanık yarası iyileştirici hayvan modelleri geliştirilmiştir ^6,7. Yanık yaraları genellikle epilasyondan sonra domuzların, sıçanların, farelerin, tavşanların ve diğer hayvanların sırt yüzeyinde üretilir. Yanma süresi, %5 ila %30 toplam vücut yüzey alanı (TBSA) aralığında kısmi ila tam kalınlıkta termal hasar oluşturmak için 3 s ila 30 s ^sürebilir8. Kullanılan tekniklerin yüksek değişkenliği nedeniyle şu anda yanık hayvan araştırmalarında bu yöntemlerin standart bir modeli bulunmamaktadır. Yanmış yüzeyler üretmek için kullanılan yöntemler, gaz alevi⁹, yanan etanol banyosu¹⁰, önceden ısıtılmış tek metal plaka/çubuk^11,12, kaynar veya sıcak su^13,14 dahil olmak üzere deney hayvanı modelleri arasında farklılık gösterir. Bununla birlikte, yanık oluşturma tekniği ve üretilen yanık derinliği genellikle tutarsızdır ve önceki çalışmalarda yetersiz tanımlanmıştır, bu da yanığın ciddiyetini ve yanık tedavisi yöntemini belirlemede çok önemlidir.

Bu çalışma, simüle edilmiş klinik senaryolarda tutarlı tam kalınlıkta yanıklar oluşturmak için basit, uygun maliyetli ve kullanıcı dostu bir fare yanığı hayvan modeli geliştirmeyi amaçlamaktadır. Bu protokolde, cilde uygulanan sıcaklığı ayarlayarak yanık derinliğini kontrol etmek için uygun bir dijital ısıtma cihazı kullandık. Bu cihazın ucu, farklı TBSA aralıkları ile termal yanıklara neden olmak için farklı boyutlara değiştirilebilir. Bu, farenin sırtında satranç tahtası benzeri bir yanık yarası oluşturulmasına izin vererek, aynı hayvan içindeki çeşitli deneysel ve kontrol tedavilerinin karşılaştırılmasını sağlar. Yara kapatma sürecini gözlemledik ve kayıt altına aldık. Yara iyileşmesinin farklı aşamalarında histolojik değerlendirme (Hematoksilen ve Eozin (H&E) boyaması ve Masson trikrom boyaması) için deri örnekleri alındı. Bu yaklaşım, deneyde kullanılan hayvan sayısını azaltır ve bu nedenle, hayvan etiği ile daha uyumlu olurken ekonomik maliyetleri düşürür. Bu çalışma, araştırmacılara yanık yaralanması için yeni tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştırmak ve yanık yarası iyileşmesinin patofizyolojik mekanizmalarını ortaya çıkarmak için gerekli araçları sağlayacaktır.

Protokol

Bu çalışmadaki tüm hayvan prosedürleri, Sichuan Üniversitesi Batı Çin Stomatoloji Okulu Etik Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (WCHSIRB-D-2024-499). Bu çalışma için yirmi dört sekiz haftalık C57BL / 6 faresi (dişi, vücut ağırlığı 25-30 g) kullanıldı. Reaktiflerin ve kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Yanık yaralanmasından önce ekipman ve farenin hazırlanması

1. Hayvanları edinin ve çevreye alışmalarını sağlamak için varışta 7 gün boyunca kafeslerde barındırın.
2. Çalışma alanını %70 etanol (h/h) püskürterek ve silerek sterilize edin. Ameliyat masasını steril cerrahi emici pedlerle örtün.
3. Dijital ısıtma cihazının sıcaklığını 97 °C'ye ayarlayın. Isıtma cihazı üç parçadan oluşur (Şekil 1).
   NOT: 50-450 °C arasındaki sıcaklık, sıcaklık kontrolörü aracılığıyla ayarlanabilir (Şekil 1A). Stand tabanı, farklı alet boyutlarını değiştirmek için sökülebilen (Şekil 1C) ucu (Şekil 1B) yerleştirmek için kullanılır. Ucu iyodofor veya alkolle dezenfekte edin.
4. Fareyi% 100 oksijen içinde% 5 izofluran ile bir indüksiyon odasında 3 dakika (akış hızı: 4 L / dak) solunum yavaşlayana kadar uyuşturun. Ayak parmağınızı sıkıştırma testi kullanarak anestezi derinliğini değerlendirin.
   NOT: İzofluranın solunması uyuşukluğa neden olabilir ve kardiyovasküler sisteme zarar verebilir. Koruyucu ekipman giymek ve iyi havalandırılan bir alanda çeker ocak içinde kullanmak çok önemlidir.
5. Fare derin bir şekilde uyuşturulduktan sonra, anesteziden iyileşme sırasında sıcaklığı korumak ve hipotermiyi önlemek için yüzüstü pozisyonda ısıtılmış bir pede aktarın. İzofluranı 1'e düşürün. Burun konisi ile bakım için %5 oksijen.
6. Korneanın kurumasını önlemek için farenin her iki gözüne pamuklu çubukla kayganlaştırıcı jel uygulayın.

2. Tam kalınlıkta yanık yaralanmasına neden olmak

NOT: Yanma indüksiyonu ve analizinin genel süreci Şekil 2'de gösterilmiştir.

1. Farenin derisini elektrikli tıraş makinesi ile boyundan kuyruğa kadar yaklaşık 5 cm uzunluğunda ve 4 cm genişliğinde bir alanda tıraş edin. Tıraş sırasında cilde zarar vermemek için nazikçe çalışın (Şekil 3C).
2. Tıraşlı cilt bölgesine 3 dakika boyunca tüy dökücü krem uygulamak için pamuk uçlu bir aplikatör kullanın (Şekil 3D).
   NOT: Tespit edilmesi zor olabilecek yanıkları önlemek için tüy dökücü kremi farenin diğer kısımlarına uygulamaktan kaçının. Krem 5 dakikadan fazla kullanıldığında deri döküntülerine neden oldu. Optimum etkinlik için kesin süre ürünler arasında değişir ve operatör tarafından belirlenmelidir.
3. Krem ve saç algılanmayana kadar nemli gazlı bez kullanarak kremi silin. Cerrahi alanı klorheksidin ovma ve ardından her biri üç kez% 70 etanol (h / v) ile dezenfekte edin. Alanı steril gazlı bezle temizleyin ve kurulayın.
4. İstenen yara bölgelerini doğru bir şekilde belirlemek için sterilize edilmiş mürekkebe batırılmış 1 mm çapında (Şekil 9A) sterilize edilmiş 3 mL'lik bir pipet ucu kullanın. Murin sırt derisi, düzensiz bir topografya ile karakterizedir. Farelerin omuriliğinden ayrı olarak yara bölgesini tanımlamak, tekrarlanabilirliği sağlamak için çok önemlidir.
5. Cildi önceden kesilmiş steril bir örtü ile örtün ve cerrahi alanı serbest bırakın (Şekil 3). Isıya dayanıklı eldivenler giyin ve dijital ısıtma cihazının sıcaklığını kontrol edin. Yanma indüksiyonundan önce ve sonra, cihazın ucunu %70 etanol (h/h) ile sterilize edin.
6. Isıtma cihazının ucunu bulunan yara bölgelerinin ortasına (10 saniye boyunca 97 °C) uygulayın ve 4 mm çapında altı yuvarlak yara oluşturun (Şekil 3B). Bitişik yanıklar arasındaki aralık 0,5-1 cm'dir. Deneysel tasarıma göre yanık sayısını belirleyin.
   NOT: Yanık esas olarak ısı iletiminden kaynaklanır; Bu nedenle, çubuğa baskı uygulamak, yani yanık indüksiyonu sırasında yerçekimi ile cilt ile temas halinde tutmak gereksizdir. Deney tasarımı için altı yanık vardı. Bu, kullandığımız cihaza ve fare sırtının bulunduğu bölgeye göre oluşturulabilecek maksimum yanık yarası sayısıdır. Bu temelde aynı deney grubunun birden fazla kopyası elde edilebilir.

3. Yanık sonrası bakım ve ölçüm

1. Ağrı yönetimi için potansiyel ağrıyı azaltmak için yanık yarasına 5 dakika boyunca buz uygulayın (Şekil 3G).
2. İzofluranı kapatın ve yanık yaralanmasından sonra burun konisini çıkarın. Fare normal şekilde hareket edene kadar (örn. çömelmiş veya titrememiş) fareyi bir ısıtma yastığına aktarın.
3. Birbirlerini çizmelerini önlemek için her fareyi bir kurtarma kafesine yerleştirin. Her bir pelete 5-10 damla içme suyu ekleyerek bazı gıda peletlerini yumuşatın ve beslemeyi kolaylaştırmak için kafes tabanına yerleştirin.
   NOT: Kafeslerin püskürtülerek ve %70 etanol (hacim/hacim) ile silinerek sterilize edilmesi. Fareleri sıcak tutmak ve idrarı emmek için yatak takımları düzenli olarak değiştirilmelidir.
4. Buprenorfini (0.1 mg / kg) toplam 3 gün boyunca günde iki kez kaudal bir yerde deri altından uygulayın ve enjeksiyonlar arasında en az 8 saat sağlayın.
5. 24 saat yanık indüksiyonundan sonra tüm yaraları tuzlu su ile nemlendirilmiş steril gazlı bezle temizleyin. Cildi gazlı bezle kurulayın ve yanık yarasını kapatmak için bir şırınga kullanarak az miktarda antibakteriyel jel (TKH hidrojel) uygulayın^12,14. Bu prosedürü daha sonra 3, 7 ve 10. günlerde tekrarlayın.
6. Yaraları kapatmak için nefes alabilen, şeffaf bir pansuman kullanın. Pansumanın boyutu yaranın etrafını yaklaşık 1 cm kaplamalı ve epilasyon yapılmadan alanı kapatmamalıdır.
   NOT: Yara örtüsünü en az 2 günde bir değiştirin. Pansumanın değiştirilmeden uzun süre kullanılması, irin oluşumu ile yara enfeksiyonuna yol açarak yara iyileşmesinin gecikmesine neden olabilir.
7. Takip süresi boyunca, ağırlığı her 2-3 günde bir ölçün. Genel olarak, başlangıçtaki vücut ağırlığının %15-20'sini kaybeden fareler kurban edilmeli ve deneyden çıkarılmalıdır.

4. Yara toplama

1. 0, 3, 7, 10 ve 14. günlerde, yarayı steril 1 mL pipet ucunun ucuyla işaretleyin ve bir dijital kamera ile kaydedin.
2. Fareleri aşırı dozda anestezi ve servikal çıkık ile ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
   NOT: Sırt yaralarına zarar verebilecek aşırı çekmeyi önlemek için servikal çıkık sırasında dikkatli olun.
3. Makasla, alttaki kas sistemi (1 cm x 1 cm) dahil olmak üzere yara bölgesini ve çevresindeki cildi izole edin. Her grup için en az üç numune hazırlayın.
4. Deri örneklerini 24 saat boyunca %4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyin ve 4 °C'de saklayın. Fiksatif hacim, doku hacminin^15,16 30 katı olmalıdır.
   NOT: PFA tehlikelidir. İyi havalandırılan bir alanda çalıştığınızdan emin olun ve uygun koruyucu ekipman kullanın.

5. Yara iyileşmesi değerlendirmesi

1. Yara dokusunu PBS ile iki kez yıkayın ve uygun bir boyuta kesilmesi gereken filtre kağıdı ile yayın (Şekil 2H). Deri altı doku tabakası içinde bir miktar mukoza içeriğinin bulunması nedeniyle, filtre kağıdının yüzeyine hareket etmeden veya doku kıvrılmadan yapışır.
   1. Nispeten pürüzsüz doku örnekleri elde etmek için filtre kağıdını ve örneği parafin dehidrasyonu için bir doku kasetine koyun ve ardından dokuyu^{gömün 15,16}. Numuneleri 4 °C'de saklayın.
      NOT: Dokuyu mümkün olduğunca gerin ve herhangi bir katlanmadan kaçının, çünkü bu kıvrımlar fiksasyondan sonra kalıcı hale gelecektir.
2. Parafine gömülü numuneleri 5 μm kalınlığında bölümlere kesin ve granülasyon dokusunun derecesini, anjiyogenez oluşumunu ve kollajen birikimini değerlendirmek için H&E ve Masson'un trikrom yoluyla slaytları boyayın, farklı aşamaları ve yara iyileşmesinin ilerlemesini değerlendirmek için kanıt sağlayın^17,18.
3. 40x objektifli bir mikroskop kullanarak tüm örneklerin görüntülerini yakalayın.
4. Epidermis, dermis, deri altı dokusu ve kas durumu dahil olmak üzere lekeli cilt bölümünü analiz etmek için uyumlu yazılım kullanın.

Sonuçlar

Bu protokolde dijital ısıtma cihazı tarafından 97 °C'de 10 sn yanma süresi ile satranç tahtası benzeri yanık yaraları oluşturulmuştur (Şekil 1). Cihazın ucu, mükemmel ısı iletimi ve hızlı ısıtma özellikleri ile bilinen saf bakırdan yapılmıştır. Deneyci tarafından tutulan tutuş, ısı direnci ve yanmazlık sağlayan polikarbonat malzemeden yapılmıştır. Önceden ısıtılmış tek metal plaka/çubuk veya kaynar veya sıcak su y...

Tartışmalar

Yanık çalışmaları için, in vitro modeller tipik olarak lokal antimikrobiyal ajanların veya antibiyotiklerin Staphylococcus aureus ve Pseudomonas aeruginosa¹⁹ gibi yanıklarla ilişkili bakteriler üzerindeki inhibitör etkilerine ve ayrıca çeşitli biyomalzemelerin (elastin, ipek ve hidrojel pansumanlar gibi) etkisine odaklanır^14,20) yanık sonrası inflamatuar hücrele...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette tip	KIRGEN,USA	KG1333	Used to locate burn wound sites
3 M Tegaderm film	3M,USA	1624WCN 6 cm x 7 cm	For the wound cover after burn induction
4% paraformaldehyde(PFA)	Biosharp,China	BL539A	Used to fix the skin samples
Buprenorphine	Sigma-Aldrich,USA	PHR8955-50MG	For the pain management of the mice
C57BL/6 mice	Chengdu Dashuo experimental animal company,China	none	For the establishment of burn model
Depilatory cream	Veet,China	—	For the dorsum hair removal of the mice
Digital Heating Device	Shenzhen Kapper Technology Company,China	No.936D	For the burn induction of the mice
Electric shaver	AUX,China	AUX-A5	For the dorsum hair removal of the mice
Filter paper	—	—	Used to unfold of the skin samples
GraphPad software	—	GraphPad prism 9.5.0	For the analysis of burn wound area
Heat-resistant gloves	—	—	Used to hold the digital heating device tip
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Solarbio,China	G1120	For the histological analysis of the slides
ImageJ software	—	ImageJ 1.54f	For the analysis of burn wound area
Isoflurane	RWD,China	R510-22-10	For the anesthesia of the mice
Masson's Trichrome Stain Kit	Solarbio,China	G1340	For the histological analysis of the slides
Microscope	Olympus,Japan	VS200 ASW	Used to scan the H&E and Masson stained slides
Tissue cassette	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD,China	31050102W	For tissue paraffin dehydration and paraffin embedding