القياس الكمي للعضلات الهيكلية غير الغازية في الصغيرة باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق

Summary

يستخدم هذا البروتوكول التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لتمكين القياس الكمي الفعال من حيث التكلفة للكتلة الخالية من الدهون ، بما في ذلك العضلات الهيكلية والأنسجة الحشوية والأنسجة الدهنية والأنسجة الهيكلية في الصغيرة. يميز بين الأنسجة الخالية من الدهون والدهنية ، مما يوفر مزايا كبيرة للأبحاث الطبية الحيوية ، لا سيما في الأبحاث الانتقالية في الصغيرة.

Abstract

يعد حجم العضلات الهيكلية وكتلتها وتكوينها خصائص مهمة لدراسة الأمراض الأيضية والأمراض المرتبطة بالعضلات ، لأنها تؤثر بشكل مباشر على فهم تطور المرض ونتائج العلاج. يعد تحديد كتلة الحي الخالية من الدهون والدهن والهيكل العظمي أمرا مهما في دراسات التمثيل الغذائي وعلم وظائف الأعضاء والصيدلة وعلم الشيخوخة. ومع ذلك ، فإن الحصول على قياسات دقيقة لتكوين الجسم ، خاصة للكتلة الخالية من الدهون ، لا يزال يمثل تحديا بسبب القيود المتأصلة في تقنيات التقييم التقليدية. التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT) هو تقنية إشعاعية غير جراحية تتيح التصور عالي الدقة للهياكل الداخلية في نماذج الصغيرة. يمكن لطريقة التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة الموحدة أن تعزز بشكل كبير الأبحاث الانتقالية بنتائج أكثر موثوقية وتأثيرا ، خاصة أثناء دراسات الشيخوخة أو في نقاط زمنية مختلفة داخل نفس. على الرغم من إمكاناته ، فإن الافتقار إلى التوحيد القياسي في طرق الحصول على الصور وتحليلها يعيق بشكل كبير قابلية مقارنة النتائج عبر الدراسات المختلفة. هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا ومفصلا منخفض التكلفة لتحليل الكتلة الخالية من الدهون باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الصغير لمواجهة هذه التحديات وتعزيز الاتساق في الأبحاث التي تنطوي على نماذج الصغيرة.

Introduction

الحجم والكتلة والتكوين هي خصائص حاسمة للعضلات الهيكلية لدراسة آليات الأمراض المتعلقة بالعضلات والتمثيل الغذائي¹. تشترك ساركوبينيا ، والدنف ، والضمور ، والاعتلال العضلي في أنماط ظاهرية مشتركة: انخفاض الكتلة ، وتغيير في التكوين ، وضعف وظيفة^{العضلات 2،3،4،5}. ومع ذلك ، فإن تحديد تكوين الجسم في حي لا يزال معقدا للغاية وصعبا من الناحية الفنية⁶.

المنهجيات الأساسية للتصوير في الجسم الحي وتحليل تكوين الجسم هي قياس امتصاص الأشعة السينية ثنائي الطاقة (DXA) ، والتصوير المقطعي المحوسب (CT) ، والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI). تستخدم هذه الطرق بشكل أساسي لفحص ومراقبة الأمراض التي تؤدي إلى تقليل الكتلة الخالية من الدهون^{7،8،9،10،11}. DXA هو المعيار الذهبي لتحليل تكوين الجسم نظرا لتكلفته المنخفضة. ومع ذلك ، فإن DXA له عيب كبير مقارنة بالرنين المغناطيسي والتصوير المقطعي المحوسب: عدم قدرته على حل العضلات والأنسجة الدهنية مكانيا¹.

يستخدم التصوير بالرنين المغناطيسي مجالات مغناطيسية قوية وموجات راديو لتوليد صور مفصلة للهياكل الداخلية للجسم¹². تتمثل إحدى مزاياها الرئيسية على التصوير المقطعي المحوسب في دقة التباين الفائقة ، مما يسمح بتمييز ممتاز بين أنواع الأنسجة الرخوة^{المميزة 1،13،14}. على عكس التصوير المقطعي المحوسب ، لا يستخدم التصوير بالرنين المغناطيسي الإشعاع المؤين ، مما يجعله أكثر أمانا للاستخدام المتكرر^15،16. ومع ذلك ، فإن التصوير بالرنين المغناطيسي أغلى ثمنا وأقل سهولة ، مع أوقات فحص أطول وتكاليف صيانة أعلى^13،17. وبالتالي ، فإن أدوات التصوير بالرنين المغناطيسي التي تم تكييفها لتحليل الصغيرة لا تتوفر عادة.

يشبه التصوير المقطعي المحوسب الصغير التصوير المقطعي المحوسب التقليدي ولكنه مصمم للهياكل الصغيرة والبحوث الطبية^{الحيوية 18}. التصوير المسبب للتصوير المسبب للتصوير المقطعي المحوسب هو تقنية تقييم إشعاعي متقدمة وغير جراحية تتيح التصور التفصيلي للهياكل الداخلية في نماذج الصغيرة. يستخدم التصوير المقطعي المحوسب الصغير الأشعة السينية لإنشاء صور مفصلة للهياكل الداخلية للجسم ، بالاعتماد على التوهين التفاضلي للأشعة السينية بواسطة أنواع مختلفة من الأنسجة. أثناء الفحص بالأشعة المقطعية الدقيقة ، يستلقي الفأر على طاولة تتحرك ببطء عبر جسر دائري. داخل القنطرية ، يدور أنبوب الأشعة السينية حول الفأر ، ويصدر أشعة سينية من زوايا مختلفة. تلتقط أجهزة الكشف الموجودة على الجانب الآخر هذه الأشعة السينية بعد مرورها عبر الجسم¹⁸.

يعالج برنامج الماسح الضوئي المقطعي المحوسب البيانات من هذه الزوايا المتعددة لإعادة بناء صور المقطع العرضي ثنائي الأبعاد (شرائح) الجسم. من خلال إعادة البناء ، يمكن دمج هذه الشرائح لتمثيل التشريح الداخلي بشكل شامل¹⁹. تعتمد الصور التي تنتجها فحوصات التصوير المقطعي المحوسب المجهري على درجات متفاوتة من توهين الأشعة السينية بواسطة الأنسجة المختلفة داخل الجسم. يتم قياس هذا التوهين كميا باستخدام وحدات Hounsfield (HU) ، وهو مقياس يوحد الكثافة الراديوية^20،21. يعد مقياس HU أساسيا للتجزئة ، حيث أن كل هيكل له قيمة مختلفة قليلا.

في هذه المقالة ، استخدمنا قيم HU للتمييز بدقة بين العظام والأنسجة الخالية من الدهون والأنسجة الدهنية¹. من خلال الرجوع إلى نطاقات HU المعمول بها ، تأكدنا من التحليل الدقيق ومقارنة تكوين الجسم. هنا ، نوضح كيفية الحصول على الصور باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الصغير وتطبيقه في تصور وقياس الكتلة الخالية من الدهون والدهون والهيكل العظمي.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الأساليب من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام التابعة للجامعة الفيدرالية في ريو دي جانيرو (UFRJ) ، ريو دي جانيرو (IACUC - UFRJ; A16 / 23-025-20). تم إجراء عمليات المسح على ذكور الفئران C57BL / 6 الذين تتراوح أعمارهم بين 6 و 22 شهرا.

1. تحضير

1. تخدير الفئران باستخدام 2٪ إيزوفلوران في خليط من الأكسجين يتم توصيله عن طريق التبخير. استخدم مبذارا دقيقا لكل من الحث والصيانة بمزيج من الأكسجين بنسبة 100٪ باستخدام مبخر دقيق.
2. ضع المخدر على الفحص المصغر باستخدام سرير الفأر. قم بتأمين الماوس بشريط لاصق لتقليل الحركة أثناء الفحص ثم إدخاله في القنطرية.
3. طوال التجربة ، التي تستغرق حوالي 10 دقائق ، تأكد من ارتداء لقناع لإبقائه تحت مستوى التخدير أثناء تلقي جرعة الصيانة حسب الحاجة.

2. الحصول على الصور وإعادة بنائها

1. الحصول على فحوصات التصوير المقطعي المحوسب المجهري للجسم باستخدام نظام تصوير قبل السريري عالي الدقة. التقط ما مجموعه 1,024 إسقاطا بزمن تعرض يبلغ 470 مللي ثانية لكل منها، باستخدام دوران وضع الطيران بجهد 60 كيلو فولت وتيار 480 ميكرو أمبير. اضبط النظام على تكبير 1.25 ، مما ينتج عنه مجال رؤية 94.72 مم (FOV) لوقت اقتناء إجمالي يبلغ 8.02 دقيقة. التقط الصور بتجميع 1 × 1 ، مما ينتج عنه دقة 2,368 × 2,240 بكسل.
   ملاحظة: تمثل المعدات المستخدمة في هذه المخطوطة لصور التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة قيودا في الحصول على صور الرأس بسبب التداخل مع قناع التخدير. بالإضافة إلى ذلك ، لا يتم التقاط طول الذيل بالكامل. وبالتالي ، استبعدنا تحليل الرأس والذيل (انظر القسم 3).
2. قم بإجراء مسح بنفس المعلمات على شبح أسطواني أكريليك (قطر: 2.5 سم ، الطول: 11.5 سم) نصف مملوء بالماء المقطر لتحديد HU للهواء والماء. عند الانتهاء من عمليات الاستحواذ ، أعد بناء الصور باستخدام برنامج الاستحواذ مع الإعدادات المحسنة لتقليل الضوضاء وخوارزمية الإسقاط الخلفي المصفى (FBP). إعادة بناء كل من الصور الحيوانية والوهمية باستخدام حجم فوكسل متناحي الخواص 147 ميكرومتر ومصفوفة 640.
3. استخرج الهواء والماء HU من الشبح (البيانات الأولية) باستخدام البرنامج المشار إليه. قم بتحويل الصور إلى ملفات DICOM وتصحيح قيم HU.

3. تحليل الصور

1. تحميل ملف
   ملاحظة: التصوير المسبب للتصوير المقطعي المحوسب هو تقنية تلتقط الصور زمانيا ومكانيا، وتولد تسلسل للصور. لذلك ، من الضروري فتح المجلد بأكمله بدلا من صورة واحدة.
   1. في الجزء العلوي الأيسر من الواجهة ، ابحث عن قائمة 3D Slicer ، مظللة باللون الأزرق الرمادي. انقر فوق إضافة بيانات ().
   2. عند ظهور نافذة بها خياران، حدد الخيار الأول: اختر الدليل المراد إضافته.
   3. انتقل إلى المجلد الذي يحتوي على سلسلة صور DICOM للحيوان المستهدف وانقر فوقه. سيؤدي هذا الإجراء إلى فتح المجلد داخل البرنامج ، مما يسمح بعرض جميع الصور في وقت واحد.
   4. راقب الصور المعروضة عبر ثلاث شاشات. تمثل كل شاشة مستوى تشريحي مختلفا: إكليلي ، وهمي ، وعرضي ، يتم تحديده بالألوان الأخضر والأصفر والأحمر ، على التوالي.
2. تجزئه
   1. حدد موقع محرر الشرائح () في علامة التبويب العلوية (الوحدات النمطية) ، وانقر فوقه.
   2. انقر فوق الزر الأخضر + إضافة لإنشاء شرائح ، وتحديد نطاق HU.
   3. قم بإنشاء شرائح للعظام والأنسجة الخالية من الدهون والأنسجة الدهنية بالنقر فوق 3 أضعاف لكل منها.
   4. انقر نقرا مزدوجا فوق كل مقطع لتسميته وتلوينه وفقا للإعدادات المطلوبة.
   5. اضبط نطاق HU لكل مقطع باستخدام الدالة Threshold الموجودة على الجانب الأيسر من النافذة. للقيام بذلك ، ابحث عن وظيفة نطاق العتبة وأدخل قيم HU لكل نوع من أنواع الأنسجة: الأنسجة الخالية من الدهون (-29 إلى 225 HU) ؛ الأنسجة الدهنية (-190 إلى -30 HU) ؛ العظام (500 إلى 5,000 HU). انقر فوق الزر تطبيق.
      ملاحظة: راجع الشكل التكميلي S1 لمقارنات قيمة HU.
   6. كرر عملية التجزئة لكل نوع من أنواع الأنسجة.
   7. انقر على إظهار 3D لإنشاء عرض ثلاثي الأبعاد.
      ملاحظة: سيظهر العرض في الربع الأزرق للشاشة.
3. تنظيف الصورة
   ملاحظة: بعد التجزئة والعرض ثلاثي الأبعاد ، يجب استبعاد العناصر الدخيلة لضمان عدم تضمينها في القياسات الحجمية للأنسجة الخالية من الدهون والأنسجة الدهنية والعظام. تعد إزالة هذه القطع الأثرية أمرا ضروريا لضمان التحليل الدقيق.
   1. حدد موقع أداة "المقص" () في قائمة التجزئة .
   2. اختر إما المستوى التشريحي أو العرض ثلاثي الأبعاد للحصول على رؤية أوضح للكائن المراد إزالته.
      1. إذا كنت تستخدم مستوى تشريحي، فانقر فوق زر تكبير العرض () على الشريط الملون للطائرة. داخل نافذة المستوى التشريحي ، استخدم زر تمرير الماوس للتنقل للأمام أو للخلف خلال التصوير المقطعي المحوسب.
         ملاحظة: يمكن تمرير كل نافذة بشكل مستقل.
      2. للعرض ثلاثي الأبعاد، استخدم زر الماوس الأيسر للتدوير على طول أي محور وزر الماوس الأيمن للتكبير.
         ملاحظة: يمكن لمفاتيح الأسهم الموجودة على لوحة المفاتيح أيضا تدوير الصورة.
   3. مع تحديد أداة المقص ، قم بتمييز التجزئة حول الكائن غير المرغوب فيه وقم بتطويقه لإزالته من الصورة. يقوم البرنامج بحذف الكائن تلقائيا.
      ملاحظة: تأكد من تحديد عملية المسح بالداخل . إذا كانت المعدات المستخدمة تولد صورا لأي صورة غير بيولوجية ، مثل الخرزة أو التخدير أو المعدات الجراحية ، فمن المهم إزالتها. بالإضافة إلى ذلك ، إذا لم يتم الحصول على أي منطقة تشريحية بالكامل ، فمن الضروري إنشاء مرجع تشريحي لإزالة هذه المناطق التي لم يتم الحصول عليها بالكامل لضمان التكرار بين التجارب. يجب إزالة الكائنات غير المرغوب فيها في كل مستوى.
   4. انقر فوق أيقونة تخطيط طريقة عرض الاستعادة () للعودة إلى الشاشة مع النوافذ الأربعة، بغض النظر عن النافذة المحددة.
   5. كرر العملية لجميع النوافذ التي يحتاج فيها الكائن إلى الإزالة.
4. حجم التجزئة
   1. بعد التجزئة، حدد أحجام المقاطع باستخدام وظيفة القياس الكمي الموجودة في القائمة المنسدلة.
      ملاحظة: يجب أن تكون جميع الشرائح مرئية لهذا الإجراء.
   2. انتقل إلى القياس الكمي | إحصائيات القطاعات. انقر فوق تطبيق ، وانتظر حتى يقوم البرنامج بإنشاء جدول يعرض قيما لكل تجزئة. يوفر البرنامج قيمتين لوحدة التخزين لكل تجزئة: Labelmap (LM) و Closed Surface (CS).
      ملاحظة: قيمة LM مناسبة بشكل عام لحساب أحجام المقاطع ، باستخدام عدد فوكسل مضروبا في حجم فوكسل واحد. تستخدم CS Value نموذج سطح أملس وتدمج الحجم بناء على عناصر السطح الثلاثية. يتماشى CS بشكل وثيق مع الخطوط التشريحية ويوصى به لإجراء قياسات دقيقة.
   3. لتحميل بيانات من جديد، احفظ المشهد وأغلقه في قائمة الملف .
5. تحليل تكوين الجسم
   1. استخدم قياسات الحجم التي يوفرها البرنامج بسم³ لتحويل هذه الأحجام إلى كتلة الأنسجة وتطبيق الكثافة المناسبة لكل نوع من أنواع الأنسجة. استخدم كثافات الأنسجة التالية التي حددتها اللجنة الدولية لوحدات الإشعاع^{والقياسات 22}: 0.95 جم / سم مكعب (الأنسجة الدهنية) ، و 1.05 جم / سم مكعب (الأنسجة الخالية من الدهون) ، و 1.92 جم / سم مكعب (الأنسجة الهيكلية) ².
      1. لحساب كتلة الأنسجة ، اضرب الحجم (سم مكعب) الذي تم الحصول عليه من البرنامج في كثافة الأنسجة المعنية (جم / سم مكعب):
         كتلة الأنسجة الدهنية:_تجزئة الحجم × 0.95 =_{الدهون الجماعية}
         كتلة الأنسجة الخالية من الدهون:_تجزئة الحجم × 1.05 =_{الكتلة العجاف}
         كتلة الأنسجة الهيكلية:_تجزئة الحجم × 1.92 =_الهيكل العظمي الشامل
         الكتلة الإجمالية:_الدهون الكتلية +_{الكتلة الهزيلة} +_{الهيكل العظمي} الشامل =_إجمالي الكتلة
6. قياس طول العظام
   ملاحظة: لتصحيح كتلة الأنسجة حسب طول العظام لبعض التحليلات ، من الضروري الحصول على أطوال عظام محددة.
   1. ارجع إلى قائمة محرر الشرائح . قم بإخفاء الأنسجة الدهنية وتجزئة الأنسجة الخالية من الدهون بالنقر فوق رمز العين () بجوار كل جزء.
      ملاحظة: يجب أن يظل التجزئة المقابلة للأنسجة الهيكلية مرئية فقط.
   2. حدد خيار تبديل العلامات / شريط الأدوات () في الزاوية العلوية من القائمة الرئيسية. سيؤدي هذا إلى فتح قائمة ثانوية أسفل القائمة الرئيسية مباشرة. حدد موقع زر إنشاء سطر جديد ().
   3. بعد النقر فوق الزر "إنشاء خط جديد " ، انتقل إلى إعادة بناء 3D وحدد العظم المراد قياسه.
      ملاحظة: العظام الموصى بها هي الساق أو عظم الفخذ²².
   4. بمجرد تحديد العظم ، انقر بزر الماوس الأيسر على أحد طرفي العظم ومرة أخرى على الطرف الآخر من الأنسجة. يسمح هذا الإجراء للبرنامج بحساب حجم العظام.
      ملاحظة: للحصول على قياسات متسقة ، حدد نفس المنطقة التشريحية من العظم لكل. على سبيل المثال ، يتم استخدام رأس الفخذ كطرف واحد واللقمة الجانبية كطرف آخر من عظم الفخذ.
7. تحليل البيانات وتطبيعها
   ملاحظة: يمكن الحصول على البيانات الجماعية كما هو موضح في القسم 3.5 واستخدامها كما هي. بدلا من ذلك ، يمكن تطبيع كتلة العظام الخالية من الدهون والدهون بطريقتين.
   1. احسب النسبة بين كتلة الأنسجة ووزن في يوم الحصول على الصور.
      التطبيع للوزن:_{الكتلة العجاف} ÷ وزن الجسم
   2. احسب النسبة بين الكتلة وحجم العظام (على سبيل المثال ، عظم الفخذ أو الساق).
      التطبيع لعظم الفخذ: كتلة_العجاف ÷ حجم_{عظم الفخذ}
      التطبيع إلى الساق:_{الكتلة العجاف} ÷ حجم_الساق
      ملاحظة: يتم اختيار معلمات التسوية بناء على السؤال التجريبي. إذا كانت هناك تغييرات متوقعة في حجم العظام (على سبيل المثال: عند مقارنة إعادة تشكيل العظام) يقترح التطبيع حسب وزن الجسم (البند 3.7.1). بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت التغييرات في وزن الجسم متوقعة في سؤالك التجريبي ، فإن حجم العظم الطويل هو معلمة التطبيع المقترحة (البند 3.7.2).

النتائج

يضمن الوضع التشريحي المناسب للحيوان المخدر على طاولة التصوير نتائج مسح متسقة وقابلة للتكرار ، مما يسلط الضوء على فعالية الحصول على البيانات في تحقيق نتائج موثوقة. يعد التخدير المناسب للحيوانات في جميع أنحاء التصوير ، بما في ذلك أنظمة توصيل الغاز المتخصصة والمبخرات ، أم...

Discussion

يعد التقييم من خلال التصوير المقطعي طريقة فعالة وغير جراحية للحصول على معلومات مفصلة عن تكوين الجسم. يقدم التصوير المقطعي المحوسب الصغير ، على وجه الخصوص ، مقاييس نتائج قيمة للدراسات قبل السريرية. في مجال العظام ، فإن التصوير المقطعي المحوسب الصغير له استخدامات مختلفة ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3DSlicer, version 5.6.2	3D Slicer platform		A free and open-source software for image analysis and scientific visualization.
Amide, version 1.0.1	Amide platform		A free and open-source software used for correcting the Hounsfield Unit values in the processed DICOM images.
Amira, version 4.1	Thermo Fisher Scientific		Used to extract air and water Hounsfield Unit values from the phantom's raw data and to convert images into DICOM files.
Isoforine	Cristália		Isoflurane is a non-flammable liquid anesthetic agent for use in general inhalation anesthesia by vaporization.
Triumph XO subsystem	Gamma Medica-Ideas Flex		Advanced imaging subsystem designed for preclinical small animal imaging, offering high-resolution CT and PET capabilities for quantitative and qualitative analysis.