マイクロコンピュータ断層撮影法を用いた小動物における非侵襲的骨格筋定量化

要約

このプロトコルでは、マイクロコンピュータ断層撮影法を使用して、小動物の骨格筋や内臓組織、脂肪組織、骨格組織などの除脂肪体重を費用対効果の高い定量化を可能にします。痩せた組織と脂肪組織を区別し、生物医学研究、特に小動物でのトランスレーショナル研究に大きな利点をもたらします。

要約

骨格筋のサイズ、質量、および組成は、疾患の進行と治療結果の理解に直接影響を与えるため、代謝および筋肉関連疾患の研究にとって重要な特性です。生きた動物の除脂肪体重、脂肪体重、骨格量を定量化することは、代謝、生理学、薬理学、および老年科学の研究において重要です。しかし、特に除脂肪体重の正確な体組成測定を行うことは、従来の評価技術に固有の制限により、依然として困難です。マイクロコンピュータ断層撮影法(マイクロCT)は、小動物モデルの内部構造を高解像度で可視化できる非侵襲的放射線技術です。標準化されたマイクロCT法は、特に老化研究中や同じ動物内の異なる時点において、より信頼性が高くインパクトのある結果を得て、トランスレーショナルリサーチを大幅に強化することができます。その可能性にもかかわらず、画像取得および解析方法の標準化の欠如は、異なる研究間での結果の比較可能性を著しく妨げています。ここでは、これらの課題に対処し、小動物モデルを含む研究の一貫性を促進するために、マイクロCTを使用したリーン質量分析のための包括的で詳細な低コストのプロトコルを提示します。

概要

サイズ、質量、および組成は、筋肉関連および代謝性疾患のメカニズムを研究するための重要な骨格筋の特性です¹。サルコペニア、悪液質、萎縮、およびミオパチーは、質量の減少、組成の変化、および^{筋肉機能の障害}という共通の表現型を共有しています2,3,4,5。しかし、生きている動物の体組成を定量化することは、依然として非常に複雑で技術的に困難です⁶。

in vivoイメージングと体組成分析の主な方法論は、デュアルエネルギーX線吸収測定法(DXA)、コンピューター断層撮影法(CT)、および磁気共鳴画像法(MRI)です。これらの方法は、主に除脂肪体重の減少につながる疾患のスクリーニングと監視に用いられます 7,8,9,10,11.DXAは、その低コストにより、体組成分析のゴールドスタンダードです。しかし、DXAはMRIやCTに比べて、筋肉や脂肪組織を空間的に分解できないという大きな欠点があります¹。

MRIは、強い磁場と電波を使用して、体の内部構造¹²の詳細な画像を生成します。CTに対する主な利点の1つは、その優れたコントラスト分解能であり、異なる軟部組織タイプ^1,13,14間の優れた鑑別を可能にします。CTとは異なり、MRIは電離放射線を使用しないため、繰り返し使用しても安全です^15,16。ただし、MRIはより高価でアクセスしにくく、スキャン時間が長くなり、メンテナンスコスト^{が高くなります13,17}。そのため、小動物分析に適したMRI装置は通常利用できません。

マイクロCTは従来のCTと似ていますが、小さな構造や生物医学研究向けに調整されています¹⁸。マイクロCTは、小動物モデルの内部構造を詳細に可視化できる、先進的な非侵襲的放射線評価技術です。マイクロCTは、X線を使用して体の内部構造の詳細な画像を作成し、さまざまな組織タイプによるX線の減衰の違いに依存しています。マイクロCTスキャン中、マウスは円形のガントリーをゆっくりと移動するテーブルに横たわります。ガントリー内では、X線管がマウスの周りを回転し、さまざまな角度からX線を放出します。反対側の検出器は、これらのX線が物体¹⁸を通過した後にこれらのX線を捕捉する。

マイクロCTスキャナーのソフトウェアは、これらの複数の角度からのデータを処理して、体の2次元断面画像(スライス)を再構築します。再構築を通じて、これらのスライスを組み合わせて、内部の解剖学的構造を包括的に表現することができます¹⁹。マイクロCTスキャンによって生成される画像は、体内のさまざまな組織によるさまざまな程度のX線減衰に基づいています。この減衰は、無線密度^20,21 を標準化するスケールであるハウンズフィールド単位 (HU) を使用して定量化されます。HU スケールは、各構造の値がわずかに異なるため、セグメンテーションの基本です。

本稿では、骨、除脂肪組織、脂肪組織¹を正確に区別するために、HU値を用いた。確立されたHUの範囲を参照することにより、体組成の正確な分析と比較を確保しました。ここでは、マイクロCTを使用して画像を取得する方法と、除脂肪体重、脂肪体重、骨格体重の視覚化と定量化への応用を示します。

プロトコル

すべての方法は、リオデジャネイロのリオデジャネイロ連邦大学(UFRJ)の動物施設管理および使用委員会(IACUC - UFRJ;A16/23-025-20)。スキャンは、6か月と22か月の雄C57BL/6マウスで行われました。

1.動物の調理

1. 気化によって送達される酸素の混合物中の2%イソフルランを使用してマウスに麻酔をかけます。精密気化器を使用して、100%酸素の混合物で誘導とメンテナンスの両方に精密気化器を使用します。
2. 麻酔をかけた動物を仰臥位で配置し、マウスベッドを使用してマイクロCTスキャンを行います。スキャン中の動きを最小限に抑えるためにマウスをテープで固定してから、ガントリーに挿入します。
3. 約 10 分間続く実験全体を通して、動物が必要に応じて維持用量を受けている間、動物が麻酔面の下に保持するためのマスクを着用していることを確認してください。

2. 画像の取得と再構成

1. 高解像度の前臨床イメージングシステムを使用して、身体のマイクロCTスキャンを取得します。 電圧60kV、電流480μAのフライモード回転を使用して、それぞれ470msの露光時間で合計1,024の投影をキャプチャします。 システムを1.25倍に設定すると、視野角(FOV)は94.72mm、合計取得時間は8.02分になります。1 x 1 のビニングで画像をキャプチャし、解像度は 2,368 x 2,240 ピクセルになります。
   注:この原稿でマイクロCT画像に使用されている機器は、麻酔マスクと重なるため、頭部画像の取得に制限があります。また、尾部全体の長さはキャプチャされません。したがって、ヘッドとテールの分析は除外しました(セクション3を参照)。
2. 蒸留水で半分満たされたアクリル製の円筒形ファントム(直径:2.5 cm、長さ:11.5 cm)で同じパラメータでスキャンを実行し、空気と水のHUを決定します。取得が完了したら、ノイズリダクション用に最適化された設定とFiltered Back Projection(FBP)アルゴリズムを使用して、取得ソフトウェアを使用して画像を再構築します。 147 μmの等方性ボクセルサイズ と 640マトリックスを使用して、動物画像とファントム画像の両方をバッチ再構成します。
3. 参照されたソフトウェアを使用して、ファントムから空気と水のHU(生データ)を抽出します。画像をDICOMファイルに変換し、HU値を修正します。

3. 画像解析

1. ファイルのアップロード
   注:マイクロCTは、画像を時間的および空間的にキャプチャし、画像シーケンスを生成する技術です。したがって、単一の画像ではなく、フォルダ全体を開く必要があります。
   1. インターフェイスの左上の領域で、灰色がかった青色で強調表示された 3Dスライサー メニューを見つけます。 [データの追加 ] () をクリックします。
   2. 2 つのオプションを含むウィンドウが表示されたら、最初のオプション [ 追加するディレクトリを選択] を選択します。
   3. 対象の動物DICOM画像シリーズを含むフォルダに移動し、クリックします。このアクションにより、ソフトウェア内のフォルダが開き、すべての画像を同時に表示できるようになります。
   4. 3つの画面にまたがって表示される画像を観察します。各スクリーンは、冠状、矢状、横方向の異なる解剖面を表しており、それぞれ緑、黄、赤の色で識別されます。
2. セグメンテーション
   1. 上部のタブ(モジュール)でセグメントエディタ()を見つけてクリックします。
   2. 緑色の「 + 追加 」ボタンをクリックしてセグメントを作成し、HU 範囲を定義します。
   3. 骨、除脂肪組織、脂肪組織のセグメントを作成するには、それぞれ 3 回クリックします。
   4. 各セグメントをダブルクリックして、目的の設定に従って名前を付け、色を付けます。
   5. ウィンドウの左側にある しきい値 機能を使用して、各セグメントの HU 範囲を設定します。これを行うには、 Threshold Range 機能 を見つけて、各組織タイプのHU値を入力します:除脂肪組織(-29〜225 HU)、脂肪組織(-190〜-30 HU)、骨(500〜5,000 HU)。 「適用 」ボタンをクリックします。
      注: HU 値の比較については、 補足図 S1 を参照してください。
   6. 組織タイプごとにセグメンテーションプロセスを繰り返します。
   7. 「 3D を表示 」をクリックして、3D レンダリングを生成します。
      注: レンダリングは、ディスプレイの青い象限に表示されます。
3. 画像のクリーニング
   注:セグメンテーションと3Dレンダリングの後、無関係なアイテムは、除脂肪組織、脂肪組織、および骨の体積測定に含まれないように除外する必要があります。これらのアーティファクトを除去することは、正確な分析を確保するために不可欠です。
   1. セグメンテーションメニューで「はさみ」ツール()を見つけます。
   2. 解剖面または3Dレンダリングのいずれかを選択して、削除するオブジェクトをより鮮明に表示します。
      1. 解剖学的平面を使用している場合は、平面の色付きのバーにある ビューの最大化 ボタン () をクリックします。解剖面ウィンドウ内で、マウスのスクロールボタンを使用して、CTスキャンを前後に移動します。
         注: 各ウィンドウは個別にスクロールできます。
      2. 3D レンダリングでは、マウスの左ボタンを使用して任意の軸に沿って回転し、マウスの右ボタンを使用してズームインします。
         メモ: キーボードの矢印キーを使用して、画像を回転させることもできます。
   3. はさみツールを選択した状態で、不要なオブジェクトの周りのセグメンテーションを強調表示し、それを囲んで画像から削除します。オブジェクトは自動的に削除されます。
      注: [ 内部消去] 操作が選択されていることを確認します。使用する機器が、ビーズ、麻酔薬、手術機器など、非生物学的画像の画像を生成する場合は、それを削除することが重要です。さらに、解剖学的領域が完全に取得されていない場合は、実験間の再現性を確保するために、完全に取得されていないこれらの領域を除去するための解剖学的参照を確立することが基本です。不要なオブジェクトは、各平面で削除する必要があります。
   4. ビューのレイアウトの復元アイコン () をクリックすると、選択したウィンドウに関係なく、4 つのウィンドウが表示された画面に戻ります。
   5. オブジェクトを削除する必要があるすべてのウィンドウに対して、このプロセスを繰り返します。
4. セグメンテーションボリューム
   1. セグメンテーション後、ドロップダウンメニューにある 定量化 機能を使用して、セグメントの体積を定量化します。
      注: このアクションでは、すべてのセグメンテーションが表示される必要があります。
   2. Quantification |セグメント統計。[適用]をクリックし、ソフトウェアが各セグメンテーションの値を表示するテーブルを生成するのを待ちます。ソフトウェアは、セグメンテーションごとに2つのボリューム値を提供します:Labelmap(LM)とClosed Surface(CS)です。
      注:LM値は、ボクセルの数に単一のボクセルのボリュームを掛けたものを使用して、セグメントボリュームを計算するのに一般的に適しています。CS Valueは、平滑化されたサーフェスモデルを利用し、三角形のサーフェス要素に基づいて体積を統合します。CSは解剖学的輪郭により密接に位置合わせされており、正確な測定に推奨されます。
   3. 新しい動物からデータをアップロードするには、 ファイル メニューでシーンを保存して閉じます。
5. 伍長構成分析
   1. ソフトウェアが提供するcm³ の体積測定値を使用して、これらの体積を組織質量に変換し、各組織タイプに適切な密度を適用します。国際放射線単位測定委員会²²で指定されている組織密度は、0.95 g/cm³(脂肪組織)、1.05 g/cm³(除脂肪組織)、1.92 g/cm³(骨格組織)²です。
      1. 組織質量を計算するには、ソフトウェアから取得した体積(cm³)にそれぞれの組織密度(g/cm³)を掛けます。
         脂肪組織質量:体積_{セグメンテーション} x 0.95 =_脂肪質量
         リーン組織質量:体積_{セグメンテーション} x 1.05 =_除脂肪質量
         骨格組織の質量: ボリューム_{セグメンテーション} X 1.92 =_骨格の質量
         総質量:質量_脂肪 +_痩せた 質量_+骨格の質量=_質量合計
6. 骨の長さ測定
   注:特定の分析で骨の長さによって組織質量を補正するには、特定の骨の長さを取得する必要があります。
   1. [セグメント エディタ]メニューに戻ります。脂肪組織とリーン組織のセグメンテーションを非表示にするには、各セグメントの横にある目のアイコン()をクリックします。
      注:骨格組織に対応するセグメンテーションのみを表示したままにする必要があります。
   2. メインメニューの上隅にある 「Toggle Markups/Toolbar ()」オプションを選択します。これにより、メインメニューのすぐ下にセカンダリメニューが開きます。 [新規ラインの作成 ] ボタン () を見つけます。
   3. [新しい線を作成]ボタンをクリックした後、3D再構成に移動し、測定する骨を特定します。
      注:推奨される骨は脛骨または大腿骨²²です。
   4. 骨が特定されたら、骨の一方の端を左クリックし、組織のもう一方の端をもう一度クリックします。このアクションにより、ソフトウェアはボーンサイズを計算できます。
      注:一貫した測定のために、各動物に同じ骨の解剖学的領域を選択してください。たとえば、大腿骨頭は大腿骨の一方の端として使用され、外側顆は大腿骨のもう一方の端として使用されます。
7. データ分析と正規化
   注:質量データは、セクション3.5で説明されているように取得し、そのまま使用できます。あるいは、除脂肪体重、脂肪量、および骨量を2つの方法で正規化できます。
   1. 画像が取得された日の組織の質量と動物の体重の比率を計算します。
      体重への正規化:_除脂肪 体重÷体重
   2. 質量と骨のサイズ(大腿骨や脛骨など)の比率を計算します。
      大腿骨への正規化:マス_リーン ÷サイズ大_腿骨
      脛骨への正規化:マス_リーン ÷サイズ_脛骨
      注:正規化パラメータは、実験的な問題に基づいて選択されます。骨のサイズの変化が予想される場合(例:骨のリモデリングを比較する場合)、体重による正規化が推奨されます(項目3.7.1)。さらに、実験問題で体重の変化が予想される場合、長骨サイズは推奨される正規化パラメータです(項目3.7.2)。

結果

イメージングテーブル上で鎮静剤を投与した動物を解剖学的に適切に配置することで、一貫した再現性のあるスキャン結果が得られ、信頼性の高い結果を得るためのデータ取得の有効性が強調されます。特殊なガス供給システムや気化器など、イメージング全体を通じて動物に適切な鎮静剤を投与することは、正確な解剖学的評価の基本です(図1

ディスカッション

トモグラフィーによる評価は、詳細な体組成情報を得るための効果的で非侵襲的な方法です。特にマイクロCTは、前臨床試験に貴重なアウトカム指標を提供します。骨分野では、マイクロアーキテクチャ²³と骨リモデリング²⁴の分析が特に興味深いため、マイクロCTはさまざまな用途を持っています。内部生物学的構造の形態を評価?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3DSlicer, version 5.6.2	3D Slicer platform		A free and open-source software for image analysis and scientific visualization.
Amide, version 1.0.1	Amide platform		A free and open-source software used for correcting the Hounsfield Unit values in the processed DICOM images.
Amira, version 4.1	Thermo Fisher Scientific		Used to extract air and water Hounsfield Unit values from the phantom's raw data and to convert images into DICOM files.
Isoforine	Cristália		Isoflurane is a non-flammable liquid anesthetic agent for use in general inhalation anesthesia by vaporization.
Triumph XO subsystem	Gamma Medica-Ideas Flex		Advanced imaging subsystem designed for preclinical small animal imaging, offering high-resolution CT and PET capabilities for quantitative and qualitative analysis.