Quantificazione non invasiva del muscolo scheletrico in piccoli animali mediante microtomografia computerizzata

Riepilogo

Questo protocollo utilizza la micro-tomografia computerizzata per consentire la quantificazione economica della massa magra, compresi il muscolo scheletrico e il tessuto viscerale, il tessuto adiposo e il tessuto scheletrico nei piccoli animali. Distingue tra tessuto magro e adiposo, il che offre vantaggi significativi per la ricerca biomedica, in particolare nella ricerca traslazionale nei piccoli animali.

Abstract

Le dimensioni, la massa e la composizione del muscolo scheletrico sono proprietà fondamentali per lo studio delle malattie metaboliche e muscolari, in quanto hanno un impatto diretto sulla comprensione della progressione della malattia e sui risultati del trattamento. Quantificare la massa magra, adiposa e scheletrica di un animale vivo è importante negli studi metabolici, fisiologici, farmacologici e geroscientifici. Tuttavia, ottenere misurazioni accurate della composizione corporea, in particolare della massa magra, rimane difficile a causa dei limiti intrinseci delle tecniche di valutazione convenzionali. La micro-tomografia computerizzata (micro-CT) è una tecnica radiologica non invasiva che consente la visualizzazione ad alta risoluzione delle strutture interne in piccoli modelli animali. Un metodo micro-CT standardizzato può migliorare significativamente la ricerca traslazionale con risultati più affidabili e di impatto, in particolare durante gli studi sull'invecchiamento o in momenti diversi all'interno dello stesso animale. Nonostante il suo potenziale, la mancanza di standardizzazione nei metodi di acquisizione e analisi delle immagini ostacola in modo significativo la comparabilità dei risultati tra i diversi studi. In questo articolo, presentiamo un protocollo completo e dettagliato a basso costo per l'analisi della massa magra utilizzando la micro-CT per affrontare queste sfide e promuovere la coerenza nella ricerca che coinvolge modelli di piccoli animali.

Introduzione

Le dimensioni, la massa e la composizione sono proprietà cruciali del muscolo scheletrico per lo studio dei meccanismi delle malattie muscolari e metaboliche¹. Sarcopenia, cachessia, atrofia e miopatie condividono fenotipi comuni: riduzione della massa, alterazione della composizione e compromissione della funzione muscolare 2,3,4,5. Tuttavia, quantificare la composizione corporea in un animale vivente rimane molto complesso e tecnicamente impegnativo⁶.

Le metodologie principali per l'imaging in vivo e l'analisi della composizione corporea sono l'assorbimetria a raggi X a doppia energia (DXA), la tomografia computerizzata (CT) e la risonanza magnetica (MRI). Questi metodi sono impiegati principalmente per lo screening e il monitoraggio delle malattie che portano alla riduzione della massa magra 7,8,9,10,11. DXA è il gold standard per l'analisi della composizione corporea grazie al suo costo inferiore. Tuttavia, la DXA presenta uno svantaggio significativo rispetto alla risonanza magnetica e alla TC: la sua incapacità di risolvere spazialmente il tessuto muscolare e adiposo¹.

La risonanza magnetica utilizza forti campi magnetici e onde radio per generare immagini dettagliate delle strutture interne del corpo¹². Uno dei suoi principali vantaggi rispetto alla TC è la sua risoluzione di contrasto superiore, che consente un'eccellente differenziazione tra diversi tipi di tessuti molli ^1,13,14. A differenza della TC, la risonanza magnetica non utilizza radiazioni ionizzanti, il che la rende più sicura per l'uso ripetuto^15,16. Tuttavia, la risonanza magnetica è più costosa e meno accessibile, con tempi di scansione più lunghi e costi di manutenzione più elevati^13,17. Pertanto, gli strumenti di risonanza magnetica adattati per l'analisi dei piccoli animali non sono solitamente disponibili.

La micro-CT è simile alla TC convenzionale ma è adattata per piccole strutture e ricerca biomedica¹⁸. La micro-CT è una tecnica di valutazione radiologica avanzata e non invasiva che consente la visualizzazione dettagliata delle strutture interne in modelli di piccoli animali. La micro-CT utilizza i raggi X per creare immagini dettagliate delle strutture interne del corpo, basandosi sull'attenuazione differenziale dei raggi X da parte di vari tipi di tessuto. Durante una scansione micro-CT, il topo giace su un tavolo che si muove lentamente attraverso un portale circolare. All'interno del gantry, un tubo a raggi X ruota attorno al topo, emettendo raggi X da varie angolazioni. I rilevatori sul lato opposto catturano questi raggi X dopo che hanno attraversato il corpo¹⁸.

Il software dello scanner micro-CT elabora i dati da queste molteplici angolazioni per ricostruire immagini bidimensionali in sezione trasversale (fette) del corpo. Attraverso la ricostruzione, queste fette possono essere combinate per rappresentare l'anatomia interna in modo completo¹⁹. Le immagini prodotte dalle scansioni micro-CT si basano sui vari gradi di attenuazione dei raggi X da parte dei diversi tessuti all'interno del corpo. Questa attenuazione è quantificata utilizzando le unità di Hounsfield (HU), una scala che standardizza la radiodensità^20,21. La scala HU è fondamentale per la segmentazione, in quanto ogni struttura ha un valore leggermente diverso.

Nel presente articolo, abbiamo utilizzato i valori HU per distinguere con precisione tra osso, tessuto magro e tessuto adiposo¹. Facendo riferimento agli intervalli HU stabiliti, abbiamo assicurato un'analisi e un confronto precisi della composizione corporea. In questo articolo, dimostriamo come acquisire immagini utilizzando la micro-CT e la sua applicazione nella visualizzazione e nella quantificazione della massa magra, grassa e scheletrica.

Protocollo

Tutti i metodi sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Rio de Janeiro (IACUC - UFRJ; A16/23-025-20). Le scansioni sono state eseguite su topi maschi C57BL/6 di età compresa tra 6 e 22 mesi.

1. Preparazione degli animali

1. Anestetizzare i topi utilizzando isoflurano al 2% in una miscela di ossigeno erogato tramite vaporizzazione. Usa un vaporizzatore di precisione sia per l'induzione che per il mantenimento con una miscela di ossigeno al 100% utilizzando un vaporizzatore di precisione.
2. Posizionare l'animale anestetizzato supino sulla scansione micro-CT utilizzando un letto per mouse. Fissare il mouse con del nastro adesivo per ridurre al minimo il movimento durante la scansione, quindi inserirlo nel gantry.
3. Durante l'esperimento, che dura circa 10 minuti, assicurarsi che l'animale indossi una maschera per tenerlo sotto il piano anestetico mentre riceve la dose di mantenimento secondo necessità.

2. Acquisizione e ricostruzione delle immagini

1. Acquisisci scansioni micro-CT corporee utilizzando un sistema di imaging preclinico ad alta risoluzione. Cattura un totale di 1.024 proiezioni con un tempo di esposizione di 470 ms ciascuna, utilizzando una rotazione in modalità volo a una tensione di 60 kV e una corrente di 480 μA. Impostare il sistema su un ingrandimento di 1,25, con un campo visivo (FOV) di 94,72 mm per un tempo di acquisizione totale di 8,02 minuti. Acquisisci immagini con un binning di 1 x 1, con una risoluzione di 2.368 x 2.240 pixel.
   NOTA: L'attrezzatura utilizzata in questo manoscritto per le immagini micro-CT presenta limitazioni nell'ottenimento di immagini della testa a causa della sovrapposizione con la maschera anestetica. Inoltre, l'intera lunghezza della coda non viene catturata. Pertanto, abbiamo escluso l'analisi della testa e della coda (vedi sezione 3).
2. Eseguire una scansione con gli stessi parametri su un fantoccio cilindrico in acrilico (diametro: 2,5 cm, lunghezza: 11,5 cm) riempito a metà con acqua distillata per determinare l'HU per aria e acqua. Al termine delle acquisizioni, ricostruire le immagini utilizzando il software di acquisizione con impostazioni ottimizzate per la riduzione del rumore e l'algoritmo di retroproiezione filtrata (FBP). Ricostruisci in batch immagini di animali e fantocci utilizzando una dimensione del voxel isotropo di 147 μm e una matrice di 640.
3. Estrarre l'HU dell'aria e dell'acqua dal fantoccio (dati grezzi) utilizzando il software di riferimento. Converti le immagini in file DICOM e correggi i valori HU.

3. Analisi delle immagini

1. Caricamento di un file
   NOTA: La micro-CT è una tecnica che cattura le immagini temporalmente e spazialmente, generando una sequenza di immagini. Pertanto, è necessario aprire l'intera cartella piuttosto che una singola immagine.
   1. Nell'area in alto a sinistra dell'interfaccia, trova il menu 3D Slicer , evidenziato in un colore grigio-blu. Fare clic su Aggiungi dati ().
   2. Quando viene visualizzata una finestra con due opzioni, selezionare la prima opzione: Scegli directory da aggiungere.
   3. Passare alla cartella contenente la serie di immagini DICOM degli animali di destinazione e fare clic su di essa. Questa azione aprirà la cartella all'interno del software, consentendo di visualizzare tutte le immagini contemporaneamente.
   4. Osserva le immagini visualizzate su tre schermi. Ogni schermo rappresenta un diverso piano anatomico: coronale, sagittale e trasversale, identificato rispettivamente dai colori verde, giallo e rosso.
2. Segmentazione
   1. Individua l'Editor segmenti () nella scheda superiore (Moduli) e fai clic su di esso.
   2. Fare clic sul pulsante verde + Aggiungi per creare segmenti, definendo l'intervallo HU.
   3. Crea segmenti per osso, tessuto magro e tessuto adiposo facendo clic 3 volte ciascuno.
   4. Fare doppio clic su ciascun segmento per nominarlo e colorarlo in base alle impostazioni desiderate.
   5. Impostare l'intervallo HU per ciascun segmento utilizzando la funzione Soglia, situata sul lato sinistro della finestra. A tale scopo, trovare la funzione Intervallo di soglia e inserire i valori HU per ogni tipo di tessuto: tessuto magro (da -29 a 225 HU); tessuto adiposo (da -190 a -30 HU); osso (da 500 a 5.000 HU). Fare clic sul pulsante Applica.
      NOTA: Fare riferimento alla Figura S1 supplementare per il confronto dei valori HU.
   6. Ripetere il processo di segmentazione per ogni tipo di tessuto.
   7. Fare clic su Mostra 3D per generare un rendering 3D.
      NOTA: Il rendering apparirà nel quadrante blu del display.
3. Pulizia dell'immagine
   NOTA: Dopo la segmentazione e il rendering 3D, gli elementi estranei devono essere esclusi per garantire che non vengano inclusi nelle misurazioni volumetriche del tessuto magro, del tessuto adiposo e dell'osso. La rimozione di questi artefatti è essenziale per garantire un'analisi accurata.
   1. Individua lo strumento "Forbici" () nel menu Segmentazione .
   2. Scegli il piano anatomico o il rendering 3D per una visione più chiara dell'oggetto da rimuovere.
      1. Se si utilizza un piano anatomico, fare clic sul pulsante di ingrandimento della vista () sulla barra colorata del piano. All'interno della finestra del piano anatomico, utilizzare il pulsante di scorrimento del mouse per navigare avanti o indietro nella TAC.
         NOTA: Ogni finestra può scorrere in modo indipendente.
      2. Per il rendering 3D, utilizzare il pulsante sinistro del mouse per ruotare lungo qualsiasi asse e il pulsante destro del mouse per ingrandire.
         NOTA: I tasti freccia sulla tastiera possono anche ruotare l'immagine.
   3. Con lo strumento Forbici selezionato, evidenziate la segmentazione attorno all'oggetto indesiderato e circondatelo per rimuoverlo dall'immagine. Il software elimina automaticamente l'oggetto.
      NOTA: Assicurarsi che l'opzione Cancella all'interno sia selezionata. Se l'apparecchiatura utilizzata genera immagini per qualsiasi immagine non biologica, come il microsfone, l'anestetico o l'attrezzatura chirurgica, è importante rimuoverla. Inoltre, se un'area anatomica non è completamente ottenuta, è fondamentale stabilire un riferimento anatomico per rimuovere queste aree che non sono completamente ottenute per garantire la ripetibilità tra gli esperimenti. Gli oggetti indesiderati devono essere rimossi su ogni piano.
   4. Fare clic sull'icona Ripristina layout vista () per tornare alla schermata con le quattro finestre, indipendentemente dalla finestra selezionata.
   5. Ripetere la procedura per tutte le finestre in cui l'oggetto deve essere rimosso.
4. Volume di segmentazione
   1. Dopo la segmentazione, quantifica i volumi dei segmenti utilizzando la funzione di quantificazione che si trova nel menu a discesa.
      NOTA: Tutte le segmentazioni devono essere visibili per questa azione.
   2. Passa a Quantificazione | Statistiche dei segmenti. Fare clic su Applica e attendere che il software generi una tabella che visualizzi i valori per ogni segmentazione. Il software fornisce due valori di volume per ogni segmentazione: Labelmap (LM) e Closed Surface (CS).
      NOTA: Il valore LM è generalmente adatto per il calcolo dei volumi dei segmenti, utilizzando il numero di voxel moltiplicato per il volume di un singolo voxel. CS Value utilizza un modello di superficie levigata e integra il volume basato su elementi di superficie triangolari. Il CS si allinea più strettamente con i contorni anatomici ed è consigliato per misurazioni accurate.
   3. Per caricare i dati di un nuovo animale, salvare e chiudere la scena nel menu file .
5. Analisi della composizione corporea
   1. Utilizzare le misure di volume fornite dal software in cm³ per convertire questi volumi in massa tissutale e applicare la densità appropriata per ogni tipo di tessuto. Utilizzare le seguenti densità tissutali specificate dalla Commissione internazionale per le unità e le misure di radiazione²²: 0,95 g/cm³ (tessuto adiposo), 1,05 g/cm³ (tessuto magro) e 1,92 g/cm³ (tessuto scheletrico)².
      1. Per calcolare la massa tissutale, moltiplicare il volume (cm³) ottenuto dal software per la rispettiva densità tissutale (g/cm³):
         Massa del tessuto adiposo:_{Segmentazione del} volume X 0,95 = Massa_adiposa
         Massa tissutale magra:_{Segmentazione del} volume X 1,05 = Massa_magra
         Massa del tessuto scheletrico:_{Segmentazione del} volume X 1,92 = Massa_scheletrica
         Massa totale: Massa_adiposa + Massa_magra + Massa_scheletrica = Massa_totale
6. Misurazione della lunghezza ossea
   NOTA: Per correggere la massa tissutale in base alla lunghezza ossea per alcune analisi, è necessario ottenere lunghezze ossee specifiche.
   1. Torna al menu Editor segmenti . Nascondi le segmentazioni del tessuto adiposo e del tessuto magro facendo clic sull'icona a forma di occhio () accanto a ciascun segmento.
      NOTA: Solo la segmentazione corrispondente al tessuto scheletrico deve rimanere visibile.
   2. Seleziona l'opzione Attiva/disattiva marcature/barra degli strumenti () nell'angolo superiore del menu principale. Si aprirà un menu secondario appena sotto il menu principale. Individuare il pulsante Crea nuova linea ().
   3. Dopo aver cliccato sul pulsante Crea nuova linea , navigare fino alla ricostruzione 3D e identificare l'osso da misurare.
      NOTA: Le ossa consigliate sono la tibia o il femore²².
   4. Una volta identificato l'osso, fare clic con il pulsante sinistro del mouse su un'estremità dell'osso e di nuovo sull'altra estremità del tessuto. Questa azione consente al software di calcolare la dimensione dell'osso.
      NOTA: Per misurazioni coerenti, selezionare la stessa regione anatomica dell'osso per ogni animale. Ad esempio, la testa del femore viene utilizzata come un'estremità e il condilo laterale come l'altra estremità del femore.
7. Analisi e normalizzazione dei dati
   NOTA: I dati sulla massa possono essere ottenuti come spiegato nella sezione 3.5 e utilizzati così come sono. In alternativa, la massa magra, grassa e ossea può essere normalizzata in due modi.
   1. Calcola il rapporto tra la massa del tessuto e il peso dell'animale il giorno in cui vengono ottenute le immagini.
      Normalizzazione al peso: Massa_magra ÷ Peso corporeo
   2. Calcola il rapporto tra massa e dimensioni dell'osso (ad esempio, femore o tibia).
      Normalizzazione al femore: massa_magra ÷ Dimensioni_{del femore}
      Normalizzazione della tibia: Massa_magra ÷ Dimensione_{della tibia}
      NOTA: I parametri di normalizzazione vengono scelti in base alla domanda sperimentale. Se sono previsti cambiamenti nelle dimensioni dell'osso (ad esempio: quando si confronta il rimodellamento osseo) si suggerisce la normalizzazione in base al peso corporeo (item 3.7.1). Inoltre, se nella domanda sperimentale sono previste variazioni del peso corporeo, la dimensione dell'osso lungo è il parametro di normalizzazione suggerito (item 3.7.2).

Risultati

Il corretto posizionamento anatomico dell'animale sedato sul tavolo di imaging garantisce risultati di scansione coerenti e riproducibili, evidenziando l'efficacia dell'acquisizione dei dati nel raggiungimento di risultati affidabili. Un'adeguata sedazione degli animali durante l'imaging, compresi i sistemi specializzati di erogazione del gas e i vaporizzatori, è fondamentale per valutazioni anatomiche precise (Figura 1).

Discussione

La valutazione attraverso la tomografia è un metodo efficace e non invasivo per ottenere informazioni dettagliate sulla composizione corporea. La micro-CT, in particolare, offre preziose misure di esito per gli studi preclinici. In campo osseo, la micro-CT ha diversi utilizzi, in quanto particolarmente interessanti sono l'analisi della microarchitettura²³ e del rimodellamento osseo²⁴. La valutazione della morfologia della struttura biologi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3DSlicer, version 5.6.2	3D Slicer platform		A free and open-source software for image analysis and scientific visualization.
Amide, version 1.0.1	Amide platform		A free and open-source software used for correcting the Hounsfield Unit values in the processed DICOM images.
Amira, version 4.1	Thermo Fisher Scientific		Used to extract air and water Hounsfield Unit values from the phantom's raw data and to convert images into DICOM files.
Isoforine	Cristália		Isoflurane is a non-flammable liquid anesthetic agent for use in general inhalation anesthesia by vaporization.
Triumph XO subsystem	Gamma Medica-Ideas Flex		Advanced imaging subsystem designed for preclinical small animal imaging, offering high-resolution CT and PET capabilities for quantitative and qualitative analysis.