Cuantificación no invasiva del músculo esquelético en pequeños animales mediante microtomografía computarizada

Resumen

Este protocolo utiliza la tomografía microcomputarizada para permitir la cuantificación rentable de la masa magra, incluido el músculo esquelético y el tejido visceral, el tejido adiposo y el tejido esquelético en animales pequeños. Distingue entre tejido magro y adiposo, lo que ofrece ventajas significativas para la investigación biomédica, particularmente en la investigación traslacional en animales pequeños.

Resumen

El tamaño, la masa y la composición del músculo esquelético son propiedades críticas para el estudio de las enfermedades metabólicas y relacionadas con los músculos, ya que tienen un impacto directo en la comprensión de la progresión de la enfermedad y los resultados del tratamiento. La cuantificación de la masa magra, adiposa y esquelética de un animal vivo es importante en los estudios metabólicos, fisiológicos, farmacológicos y gerocientíficos. Sin embargo, la obtención de mediciones precisas de la composición corporal, especialmente de la masa magra, sigue siendo un desafío debido a las limitaciones inherentes de las técnicas de evaluación convencionales. La microtomografía computarizada (micro-TC) es una técnica radiológica no invasiva que permite la visualización de alta resolución de estructuras internas en modelos de animales pequeños. Un método estandarizado de micro-TC puede mejorar significativamente la investigación traslacional con resultados más confiables e impactantes, particularmente durante estudios de envejecimiento o en diferentes momentos dentro del mismo animal. A pesar de su potencial, la falta de estandarización en los métodos de adquisición y análisis de imágenes dificulta significativamente la comparabilidad de los resultados entre diferentes estudios. En este artículo, presentamos un protocolo completo y detallado de bajo costo para el análisis de masa magra utilizando micro-CT para abordar estos desafíos y promover la consistencia en la investigación con modelos de animales pequeños.

Introducción

El tamaño, la masa y la composición son propiedades cruciales del músculo esquelético para estudiar los mecanismos de las enfermedades musculares y metabólicas¹. La sarcopenia, la caquexia, la atrofia y las miopatías comparten fenotipos comunes: reducción de la masa, alteración de la composición y deterioro de la función muscular 2,3,4,5. Sin embargo, la cuantificación de la composición corporal en un animal vivo sigue siendo muy compleja y técnicamente desafiante⁶.

Las principales metodologías para la obtención de imágenes in vivo y el análisis de la composición corporal son la absorciometría de rayos X (DXA) de doble energía, la tomografía computarizada (TC) y la resonancia magnética (RMN). Estos métodos se emplean principalmente para detectar y controlar enfermedades que conducen a la reducción de la masa magra 7,8,9,10,11. DXA es el estándar de oro para el análisis de la composición corporal debido a su menor costo. Sin embargo, la DXA tiene una desventaja significativa en comparación con la resonancia magnética y la tomografía computarizada: su incapacidad para resolver espacialmente el músculo y el tejido adiposo¹.

La resonancia magnética utiliza fuertes campos magnéticos y ondas de radio para generar imágenes detalladas de las estructuras internas del cuerpo¹². Una de sus principales ventajas sobre la TC es su resolución de contraste superior, lo que permite una excelente diferenciación entre distintos tipos de tejidos blandos ^1,13,14. A diferencia de la TC, la RM no utiliza radiación ionizante, lo que la hace más segura para el uso repetido^15,16. Sin embargo, la resonancia magnética es más costosa y menos accesible, con tiempos de exploración más largos y mayores costos de mantenimiento^13,17. Por lo tanto, los instrumentos de resonancia magnética adaptados para el análisis de animales pequeños no suelen estar disponibles.

La micro-TC es similar a la TC convencional, pero adaptada para pequeñas estructuras e investigación biomédica¹⁸. La micro-TC es una técnica de evaluación radiológica avanzada y no invasiva que permite la visualización detallada de las estructuras internas en modelos de animales pequeños. La microtomografía computarizada utiliza rayos X para crear imágenes detalladas de las estructuras internas del cuerpo, basándose en la atenuación diferencial de los rayos X por varios tipos de tejidos. Durante una microtomografía computarizada, el ratón se acuesta sobre una mesa que se mueve lentamente a través de un pórtico circular. Dentro del pórtico, un tubo de rayos X gira alrededor del ratón, emitiendo rayos X desde varios ángulos. Los detectores en el lado opuesto capturan estos rayos X después de que pasan a través del cuerpo¹⁸.

El software del escáner de micro-CT procesa los datos desde estos múltiples ángulos para reconstruir imágenes bidimensionales de corte transversal (cortes) del cuerpo. A través de la reconstrucción, estos cortes pueden combinarse para representar la anatomía interna de manera integral¹⁹. Las imágenes producidas por las microtomografías computarizadas se basan en los diversos grados de atenuación de los rayos X por parte de los diferentes tejidos del cuerpo. Esta atenuación se cuantifica utilizando las Unidades de Hounsfield (HU), escala que estandariza la radiodensidad^20,21. La escala HU es fundamental para la segmentación, ya que cada estructura tiene un valor ligeramente diferente.

En el presente artículo, utilizamos los valores de HU para diferenciar con precisión entre hueso, tejido magro y tejido adiposo¹. Al hacer referencia a los rangos de HU establecidos, garantizamos un análisis y una comparación precisos de la composición corporal. En este trabajo, demostramos cómo adquirir imágenes utilizando micro-CT y su aplicación en la visualización y cuantificación de la masa magra, grasa y esquelética.

Protocolo

Todos los métodos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Federal de Río de Janeiro (UFRJ), Río de Janeiro (IACUC - UFRJ; A16/23-025-20). Las exploraciones se realizaron en ratones machos C57BL/6 de 6 y 22 meses de edad.

1. Preparación animal

1. Anestesiar ratones con isoflurano al 2% en una mezcla de oxígeno suministrado a través de la vaporización. Utilice un vaporizador de precisión tanto para la inducción como para el mantenimiento con una mezcla de 100% de oxígeno utilizando un vaporizador de precisión.
2. Coloque el animal anestesiado en decúbito supino en la microtomografía computarizada con una cama de ratón. Asegure el mouse con cinta adhesiva para minimizar el movimiento durante el escaneo y luego insértelo en el pórtico.
3. A lo largo del experimento, que dura aproximadamente 10 minutos, asegúrese de que el animal use una máscara para mantenerlo bajo el plano anestésico mientras recibe la dosis de mantenimiento según sea necesario.

2. Adquisición y reconstrucción de imágenes

1. Adquiera microtomografías computarizadas corporales utilizando un sistema de imágenes preclínicas de alta resolución. Capture un total de 1.024 proyecciones con un tiempo de exposición de 470 ms cada una, utilizando una rotación en modo mosca a un voltaje de 60 kV y una corriente de 480 μA. Ajuste el sistema a un aumento de 1,25, lo que da como resultado un campo de visión (FOV) de 94,72 mm para un tiempo de adquisición total de 8,02 min. Capture imágenes con un agrupamiento de 1 x 1, lo que da como resultado una resolución de 2.368 x 2.240 píxeles.
   NOTA: El equipo utilizado en este manuscrito para las imágenes de micro-TC presenta limitaciones en la obtención de imágenes de la cabeza debido a la superposición con la máscara anestésica. Además, no se captura toda la longitud de la cola. Por lo tanto, se excluyó el análisis de la cabeza y la cola (ver sección 3).
2. Realice un escaneo con los mismos parámetros en un maniquí cilíndrico acrílico (diámetro: 2,5 cm, longitud: 11,5 cm) medio lleno de agua destilada para determinar la unidad de manipulación de aire y agua. Una vez finalizadas las adquisiciones, reconstruya las imágenes utilizando el software de adquisición con ajustes optimizados para la reducción de ruido y el algoritmo de retroproyección filtrada (FBP). Reconstrucción por lotes de imágenes de animales y fantasmas utilizando un tamaño de vóxel isótropo de 147 μm y una matriz de 640.
3. Extraiga la unidad de fuerza de aire y agua del maniquí (datos sin procesar) utilizando el software de referencia. Convierta las imágenes en archivos DICOM y corrija los valores de HU.

3. Análisis de imágenes

1. Subir un archivo
   NOTA: La micro-TC es una técnica que captura imágenes temporal y espacialmente, generando una secuencia de imágenes. Por lo tanto, es necesario abrir toda la carpeta en lugar de una sola imagen.
   1. En el área superior izquierda de la interfaz, busque el menú 3D Slicer , resaltado en un color azul grisáceo. Haga clic en Agregar datos ().
   2. Cuando aparezca una ventana con dos opciones, seleccione la primera opción: Elegir directorio para agregar.
   3. Navegue a la carpeta que contiene la serie de imágenes DICOM del animal objetivo y haga clic en ella. Esta acción abrirá la carpeta dentro del software, lo que permitirá ver todas las imágenes simultáneamente.
   4. Observe las imágenes que se muestran en tres pantallas. Cada pantalla representa un plano anatómico diferente: coronal, sagital y transversal, identificados por los colores verde, amarillo y rojo, respectivamente.
2. Segmentación
   1. Localice el Editor de segmentos () en la pestaña superior (Módulos) y haga clic en él.
   2. Haga clic en el botón verde + Agregar para crear segmentos, definiendo el rango de HU.
   3. Cree segmentos para hueso, tejido magro y tejido adiposo haciendo clic 3 veces cada uno.
   4. Haga doble clic en cada segmento para nombrarlo y colorearlo de acuerdo con la configuración deseada.
   5. Establezca el rango de HU para cada segmento utilizando la función Umbral, ubicada en el lado izquierdo de la ventana. Para ello, busque la función Umbral de rango e introduzca los valores de HU para cada tipo de tejido: tejido magro (-29 a 225 HU); tejido adiposo (-190 a -30 HU); hueso (500 a 5.000 HU). Haga clic en el botón Aplicar.
      NOTA: Consulte la Figura Suplementaria S1 para comparar los valores de HU.
   6. Repita el proceso de segmentación para cada tipo de tejido.
   7. Haga clic en Mostrar 3D para generar una representación 3D.
      NOTA: La representación aparecerá en el cuadrante azul de la pantalla.
3. Limpieza de la imagen
   NOTA: Después de la segmentación y la representación en 3D, se deben excluir los elementos superfluos para garantizar que no se incluyan en las mediciones volumétricas de tejido magro, tejido adiposo y hueso. La eliminación de estos artefactos es esencial para garantizar un análisis preciso.
   1. Localice la herramienta "Tijeras" () en el menú Segmentación .
   2. Elija el plano anatómico o el renderizado 3D para obtener una visión más clara del objeto que se va a eliminar.
      1. Si utiliza un plano anatómico, haga clic en el botón maximizar vista () en la barra de color del avión. Dentro de la ventana del plano anatómico, use el botón de desplazamiento del mouse para navegar hacia adelante o hacia atrás a través de la tomografía computarizada.
         NOTA: Cada ventana puede desplazarse de forma independiente.
      2. Para el renderizado 3D, utilice el botón izquierdo del ratón para rotar a lo largo de cualquier eje y el botón derecho del ratón para acercar.
         NOTA: Las teclas de flecha del teclado también pueden rotar la imagen.
   3. Con la herramienta Tijeras seleccionada, resalte la segmentación alrededor del objeto no deseado y rodéelo para eliminarlo de la imagen. El software elimina el objeto automáticamente.
      NOTA: Asegúrese de que la operación Borrar dentro esté seleccionada. Si el equipo utilizado genera imágenes para cualquier imagen no biológica, como el cordón, el anestésico o el equipo quirúrgico, es importante extraerlo. Además, si alguna zona anatómica no se obtiene en su totalidad, es fundamental establecer una referencia anatómica para eliminar estas áreas que no se han obtenido en su totalidad para garantizar la repetibilidad entre experimentos. Los objetos no deseados deben eliminarse en cada plano.
   4. Haga clic en el icono de restauración de diseño de vista () para volver a la pantalla con las cuatro ventanas, independientemente de la ventana seleccionada.
   5. Repita el proceso para todas las ventanas en las que sea necesario eliminar el objeto.
4. Volumen de segmentación
   1. Después de la segmentación, cuantifique los volúmenes de los segmentos utilizando la función de cuantificación que se encuentra en el menú desplegable.
      NOTA: Todas las segmentaciones deben estar visibles para esta acción.
   2. Vaya a Cuantificación | Estadísticas de segmentos. Haga clic en Aplicar y espere a que el software genere una tabla que muestre los valores de cada segmentación. El software proporciona dos valores de volumen para cada segmentación: Labelmap (LM) y Closed Surface (CS).
      NOTA: El valor LM es generalmente adecuado para calcular volúmenes de segmentos, utilizando el número de vóxeles multiplicado por el volumen de un solo vóxel. CS Value utiliza un modelo de superficie suavizada e integra el volumen en función de elementos de superficie triangulares. El CS se alinea más estrechamente con los contornos anatómicos y se recomienda para mediciones precisas.
   3. Para cargar datos de un nuevo animal, guarde y cierre la escena en el menú de archivos .
5. Análisis de la composición corporal
   1. Utilice las mediciones de volumen proporcionadas por el software en cm³ para convertir estos volúmenes en masa de tejido y aplicar la densidad adecuada para cada tipo de tejido. Utilice las siguientes densidades de tejido especificadas por la Comisión Internacional de Unidades y Medidas de Radiación²²: 0,95 g/cm³ (tejido adiposo), 1,05 g/cm³ (tejido magro) y 1,92 g/cm³ (tejido esquelético)².
      1. Para calcular la masa de tejido, multiplique el volumen (cm³) obtenido del software por la densidad de tejido respectiva (g/cm³):
         Masa de tejido_{adiposo: Segmentación de} volumen X 0,95 = Masa_adiposa
         Masa de tejido magro:_{Segmentación de} volumen X 1,05 = Masa_magra
         Masa de tejido esquelético:_{Segmentación de} volumen X 1,92 = Masa_esquelética
         Masa total: Masa_adiposa + Masa_magra + Masa_esquelética = Masa_total
6. Medición de la longitud ósea
   NOTA: Para corregir la masa tisular por longitud ósea para ciertos análisis, es necesario obtener longitudes óseas específicas.
   1. Vuelva al menú Editor de segmentos . Oculte las segmentaciones de tejido adiposo y tejido magro haciendo clic en el icono del ojo () junto a cada segmento.
      NOTA: Solo debe permanecer visible la segmentación correspondiente al tejido esquelético.
   2. Seleccione la opción Alternar marcas/barra de herramientas () en la esquina superior del menú principal. Esto abrirá un menú secundario justo debajo del menú principal. Localice el botón crear nueva línea ().
   3. Después de hacer clic en el botón crear nueva línea , navegue hasta la reconstrucción 3D e identifique el hueso que se va a medir.
      NOTA: Los huesos recomendados son la tibia o el fémur²².
   4. Una vez identificado el hueso, haga clic con el botón izquierdo en un extremo del hueso y nuevamente en el otro extremo del tejido. Esta acción permite al software calcular el tamaño del hueso.
      NOTA: Para obtener mediciones consistentes, seleccione la misma región anatómica del hueso para cada animal. Por ejemplo, la cabeza femoral se utiliza como un extremo y el cóndilo lateral como el otro extremo del fémur.
7. Análisis y normalización de datos
   NOTA: Los datos de masa se pueden obtener como se explica en la sección 3.5 y se pueden utilizar tal cual. Alternativamente, la masa magra, grasa y ósea se pueden normalizar de dos maneras.
   1. Calcular la relación entre la masa de tejido y el peso del animal el día en que se obtienen las imágenes.
      Normalización al peso: Masa_magra ÷ Peso corporal
   2. Calcula la relación entre la masa y el tamaño del hueso (por ejemplo, fémur o tibia).
      Normalización al fémur:_{Masa magra} ÷ Tamaño_fémur
      Normalización a tibia:_{Masa inclinada} ÷ Tamaño de_{la tibia}
      NOTA: Los parámetros de normalización se eligen en función de la pregunta experimental. Si se esperan cambios en el tamaño óseo (por ejemplo: al comparar el remodelado óseo) se sugiere la normalización por peso corporal (ítem 3.7.1). Además, si se esperan cambios en el peso corporal en su pregunta experimental, el tamaño del hueso largo es el parámetro de normalización sugerido (ítem 3.7.2).

Resultados

La posición anatómica adecuada del animal sedado en la mesa de imágenes garantiza resultados de exploración consistentes y reproducibles, lo que pone de manifiesto la eficacia de la adquisición de datos para lograr resultados fiables. La sedación adecuada de los animales a lo largo de las imágenes, incluidos los sistemas especializados de administración de gas y los vaporizadores, es fundamental para evaluaciones anatómicas precisas (Figura 1).

...

Discusión

La evaluación mediante tomografía es un método eficaz y no invasivo para obtener información detallada sobre la composición corporal. La micro-TC, en particular, ofrece valiosas medidas de resultado para los estudios preclínicos. En el campo óseo, la micro-TC tiene diferentes usos, siendo especialmente interesantes el análisis de la microarquitectura²³ y el remodelado óseo²⁴. La evaluación de la morfología de la estructura bioló...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3DSlicer, version 5.6.2	3D Slicer platform		A free and open-source software for image analysis and scientific visualization.
Amide, version 1.0.1	Amide platform		A free and open-source software used for correcting the Hounsfield Unit values in the processed DICOM images.
Amira, version 4.1	Thermo Fisher Scientific		Used to extract air and water Hounsfield Unit values from the phantom's raw data and to convert images into DICOM files.
Isoforine	Cristália		Isoflurane is a non-flammable liquid anesthetic agent for use in general inhalation anesthesia by vaporization.
Triumph XO subsystem	Gamma Medica-Ideas Flex		Advanced imaging subsystem designed for preclinical small animal imaging, offering high-resolution CT and PET capabilities for quantitative and qualitative analysis.