Mikro Bilgisayarlı Tomografi Kullanılarak Küçük Hayvanlarda Non-İnvaziv İskelet Kası Miktar Tayini

Özet

Bu protokol, küçük hayvanlarda iskelet kası ve iç organ dokusu, yağ dokusu ve iskelet dokusu dahil olmak üzere yağsız kütlenin uygun maliyetli bir şekilde ölçülmesini sağlamak için mikro bilgisayarlı tomografi kullanır. Biyomedikal araştırmalar için, özellikle küçük hayvanlarda yapılan translasyonel araştırmalarda önemli avantajlar sunan yağsız ve yağ dokusu arasında ayrım yapar.

Özet

İskelet kası boyutu, kütlesi ve bileşimi, hastalığın ilerlemesinin ve tedavi sonuçlarının anlaşılmasını doğrudan etkilediğinden, metabolik ve kaslarla ilgili hastalıkları incelemek için kritik özelliklerdir. Canlı bir hayvanın yağsız, yağ ve iskelet kütlesinin ölçülmesi metabolik, fizyolojik, farmakolojik ve gerobilim çalışmalarında önemlidir. Bununla birlikte, özellikle yağsız kütle olmak üzere doğru vücut kompozisyonu ölçümleri elde etmek, geleneksel değerlendirme tekniklerinin doğasında bulunan sınırlamalar nedeniyle zor olmaya devam etmektedir. Mikro bilgisayarlı tomografi (mikro-BT), küçük hayvan modellerinde iç yapıların yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlayan non-invaziv bir radyolojik tekniktir. Standartlaştırılmış bir mikro-BT yöntemi, özellikle yaşlanma çalışmaları sırasında veya aynı hayvan içindeki farklı zaman noktalarında daha güvenilir ve etkili sonuçlarla translasyonel araştırmayı önemli ölçüde artırabilir. Potansiyeline rağmen, görüntü elde etme ve analiz yöntemlerinde standardizasyon eksikliği, sonuçların farklı çalışmalarda karşılaştırılabilirliğini önemli ölçüde engellemektedir. Burada, bu zorlukları ele almak ve küçük hayvan modellerini içeren araştırmalarda tutarlılığı teşvik etmek için mikro-CT kullanarak yağsız kütle analizi için kapsamlı ve ayrıntılı, düşük maliyetli bir protokol sunuyoruz.

Giriş

Boyut, kütle ve bileşim, kasla ilgili ve metabolik hastalık mekanizmalarını incelemek için çok önemli iskelet kası özellikleridir¹. Sarkopeni, kaşeksi, atrofi ve miyopatiler ortak fenotipleri paylaşır: kütlede azalma, bileşimde değişiklik ve bozulmuş kas fonksiyonu 2,3,4,5. Bununla birlikte, canlı bir hayvanda vücut kompozisyonunun ölçülmesi oldukça karmaşık ve teknik olarak zorlayıcı olmaya devam etmektedir⁶.

İn vivo görüntüleme ve vücut kompozisyonu analizi için birincil metodolojiler, çift enerjili X-ışını absorbsiyometrisi (DXA), bilgisayarlı tomografi (BT) ve manyetik rezonans görüntülemedir (MRI). Bu yöntemler öncelikle yağsız kütle azalmasına yol açan hastalıkları taramak ve izlemek için kullanılır 7,8,9,10,11. DXA, düşük maliyeti nedeniyle vücut kompozisyonu analizi için altın standarttır. Bununla birlikte, DXA'nın MRI ve BT'ye kıyasla önemli bir dezavantajı vardır: kas ve yağ dokusunu uzamsal olarak çözememesi¹.

MRG, vücudun iç yapılarının ayrıntılı görüntülerini oluşturmak için güçlü manyetik alanlar ve radyo dalgaları kullanır¹². BT'ye göre en önemli avantajlarından biri, farklı yumuşak doku tipleri^arasında mükemmel ayrım sağlayan üstün kontrast çözünürlüğüdür ^1,13,14. BT'den farklı olarak, MRG iyonlaştırıcı radyasyon kullanmaz, bu da tekrarlanan kullanım için daha güvenli hale getirir^15,16. Bununla birlikte, MRG, daha uzun tarama süreleri ve daha yüksek bakım maliyetleri ile daha pahalı ve daha az erişilebilirdir^13,17. Bu nedenle, küçük hayvan analizi için uyarlanmış MRI cihazları genellikle mevcut değildir.

Mikro-BT, konvansiyonel BT'ye benzer, ancak küçük yapılar ve biyomedikal araştırmalar için uyarlanmıştır¹⁸. Mikro-BT, küçük hayvan modellerinde iç yapıların ayrıntılı olarak görüntülenmesini sağlayan gelişmiş, invaziv olmayan bir radyolojik değerlendirme tekniğidir. Mikro-BT, X-ışınlarının çeşitli doku tiplerine göre diferansiyel zayıflamasına dayanarak, vücudun iç yapılarının ayrıntılı görüntülerini oluşturmak için X-ışınlarını kullanır. Mikro-BT taraması sırasında, fare dairesel bir portal boyunca yavaşça hareket eden bir masanın üzerinde yatar. Portalın içinde, bir X-ışını tüpü farenin etrafında dönerek çeşitli açılardan X-ışınları yayar. Karşı taraftaki dedektörler bu X-ışınlarını vücuttan geçtikten sonra yakalar¹⁸.

Mikro-CT tarayıcının yazılımı, vücudun iki boyutlu kesit görüntülerini (dilimlerini) yeniden oluşturmak için bu çoklu açılardan gelen verileri işler. Rekonstrüksiyon yoluyla, bu dilimler iç anatomiyi kapsamlı bir şekilde temsil etmek için birleştirilebilir¹⁹. Mikro-BT taramaları tarafından üretilen görüntüler, vücuttaki farklı dokular tarafından değişen derecelerde X-ışını zayıflamasına dayanmaktadır. Bu zayıflama, radyo yoğunluğunu^20,21'i standartlaştıran bir ölçek olan Hounsfield Birimleri (HU) kullanılarak ölçülür. HU ölçeği, her yapının biraz farklı bir değeri olduğu için segmentasyon için temeldir.

Bu makalede, kemik, yağsız doku ve yağ dokusu^1'i doğru bir şekilde ayırt etmek için HU değerlerini kullandık. Yerleşik HU aralıklarına atıfta bulunarak, vücut kompozisyonunun hassas bir şekilde analiz edilmesini ve karşılaştırılmasını sağladık. Burada, mikro-CT ve yağsız, yağ ve iskelet kütlesinin görselleştirilmesi ve ölçülmesinde uygulanması kullanılarak görüntülerin nasıl elde edileceğini gösteriyoruz.

Protokol

Tüm yöntemler, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Rio de Janeiro (IACUC - UFRJ; A16/23-025-20). Taramalar, 6 ve 22 aylık erkek C57BL / 6 fareleri üzerinde gerçekleştirildi.

1. Hayvan hazırlama

1. Buharlaştırma yoluyla verilen bir oksijen karışımında% 2 izofluran kullanarak fareleri uyuşturun. Hassas bir buharlaştırıcı kullanarak %100 oksijen karışımı ile hem indüksiyon hem de bakım için hassas bir buharlaştırıcı kullanın.
2. Anestezi uygulanmış hayvanı bir fare yatağı kullanarak mikro-BT taramasına sırtüstü yatırın. Tarama sırasında hareketi en aza indirmek için fareyi bantla sabitleyin ve ardından portala yerleştirin.
3. Yaklaşık 10 dakika süren deney boyunca, gerektiğinde idame dozunu alırken hayvanın anestezik düzlemin altında tutmak için bir maske taktığından emin olun.

2. Görüntü elde etme ve yeniden yapılandırma

1. Yüksek çözünürlüklü bir klinik öncesi görüntüleme sistemi kullanarak vücut mikro-BT taramaları elde edin. 60 kV voltajda ve 480 μA akımda sinek modu dönüşü kullanarak her biri 470 ms pozlama süresiyle toplam 1.024 projeksiyon yakalayın. Sistemi 1,25 büyütmeye ayarlayarak 94,72 mm görüş alanı (FOV) elde ederek toplam 8,02 dakikalık çekim süresi elde edin. 2.368 x 2.240 piksel çözünürlükle sonuçlanan 1 x 1 gruplama ile görüntüler yakalayın.
   NOT: Bu yazıda mikro-BT görüntüleri için kullanılan ekipman, anestezik maske ile örtüşme nedeniyle kafa görüntülerinin elde edilmesinde sınırlamalar sunmaktadır. Ek olarak, tüm kuyruk uzunluğu yakalanmaz. Bu nedenle, baş ve kuyruk analizini hariç tuttuk (bkz. bölüm 3).
2. Hava ve su için HU'yu belirlemek için yarı damıtılmış su ile doldurulmuş akrilik silindirik bir fantom (çap: 2,5 cm, uzunluk: 11,5 cm) üzerinde aynı parametrelerle bir tarama yapın. Alımların tamamlanmasının ardından, gürültü azaltma için optimize edilmiş ayarlara ve Filtreli Geri Projeksiyon (FBP) algoritmasına sahip edinme yazılımını kullanarak görüntüleri yeniden oluşturun. 147 μm izotropik voksel boyutu ve 640 matris kullanarak hem hayvan hem de hayalet görüntüleri toplu olarak yeniden oluşturun.
3. Referans verilen yazılımı kullanarak fantomdan (ham veriler) hava ve su HU'sunu çıkarın. Görüntüleri DICOM dosyalarına dönüştürün ve HU değerlerini düzeltin.

3. Görüntü analizi

1. Dosya yükleme
   NOT: Mikro-CT, görüntüleri zamansal ve mekansal olarak yakalayan ve bir görüntü dizisi oluşturan bir tekniktir. Bu nedenle, tek bir görüntü yerine tüm klasörü açmak gerekir.
   1. Arayüzün sol üst kısmında, grimsi mavi renkle vurgulanan 3B Dilimleyici menüsünü bulun. Veri Ekle'ye () tıklayın.
   2. İki seçenekli bir pencere göründüğünde, ilk seçeneği belirleyin: Eklenecek Dizini seçin.
   3. Hedef hayvan DICOM görüntüleri serisini içeren klasöre gidin ve üzerine tıklayın. Bu eylem, klasörü yazılım içinde açarak tüm görüntülerin aynı anda görüntülenmesine izin verecektir.
   4. Üç ekranda görüntülenen görüntüleri gözlemleyin. Her ekran farklı bir anatomik düzlemi temsil eder: sırasıyla yeşil, sarı ve kırmızı renklerle tanımlanan koronal, sagital ve enine.
2. Segmentasyon
   1. Üst sekmede (Modüller) Segment Düzenleyici'yi () bulun ve üzerine tıklayın.
   2. HU aralığını tanımlayan segmentler oluşturmak için yeşil + Ekle düğmesini tıklayın.
   3. Her birine 3 kez tıklayarak kemik, yağsız doku ve yağ dokusu için segmentler oluşturun.
   4. İstenen ayarlara göre adlandırmak ve renklendirmek için her segmente çift tıklayın.
   5. Pencerenin sol tarafında bulunan Eşik işlevini kullanarak her segment için HU aralığını ayarlayın. Bunu yapmak için, Eşik Aralığı işlevini bulun ve her doku tipi için HU değerlerini girin: Yağsız doku (-29 ila 225 HU); yağ dokusu (-190 ila -30 HU); kemik (500 ila 5.000 HU). Uygula düğmesine tıklayın.
      NOT: HU değeri karşılaştırmaları için Ek Şekil S1'e bakın.
   6. Her doku tipi için segmentasyon işlemini tekrarlayın.
   7. Bir 3B görüntü oluşturma oluşturmak için 3B'yi Göster'i tıklatın.
      NOT: Görüntü oluşturma, ekranın mavi çeyreğinde görünecektir.
3. Görüntüyü temizleme
   NOT: Segmentasyon ve 3D işlemeden sonra, yağsız doku, yağ dokusu ve kemiğin hacimsel ölçümlerine dahil edilmediklerinden emin olmak için yabancı öğeler hariç tutulmalıdır. Doğru analizi sağlamak için bu eserlerin kaldırılması çok önemlidir.
   1. Segmentasyon menüsünde "Makas" aracını () bulun.
   2. Kaldırılacak nesnenin daha net bir görünümü için anatomik düzlemi veya 3B oluşturmayı seçin.
      1. Anatomik bir düzlem kullanıyorsanız, düzlemin renkli çubuğundaki görünümü büyüt düğmesine () tıklayın. Anatomik düzlem penceresinin içinde, CT taramasında ileri veya geri gitmek için fare kaydırma düğmesini kullanın.
         NOT: Her pencere bağımsız olarak kaydırılabilir.
      2. 3D oluşturma için, herhangi bir eksen boyunca döndürmek için farenin sol düğmesini ve yakınlaştırmak için farenin sağ düğmesini kullanın.
         NOT: Klavyedeki ok tuşları da görüntüyü döndürebilir.
   3. Makas aracı seçiliyken, istenmeyen nesnenin etrafındaki segmentasyonu vurgulayın ve görüntüden kaldırmak için daire içine alın. Yazılım nesneyi otomatik olarak siler.
      NOT: İçini Sil işleminin seçili olduğundan emin olun. Kullanılan ekipman, boncuk, anestezik veya cerrahi ekipman gibi biyolojik olmayan herhangi bir görüntü için görüntü oluşturuyorsa, bunun çıkarılması önemlidir. Ek olarak, herhangi bir anatomik alan tamamen elde edilemezse, deneyler arasında tekrarlanabilirliği sağlamak için tam olarak elde edilemeyen bu alanları çıkarmak için anatomik bir referans oluşturmak esastır. İstenmeyen nesneler her düzlemde kaldırılmalıdır.
   4. Seçilen pencereden bağımsız olarak dört pencereli ekrana dönmek için görünüm düzenini geri yükle simgesini () tıklatın.
   5. Nesnenin kaldırılması gereken tüm pencereler için işlemi tekrarlayın.
4. Segmentasyon hacmi
   1. Segmentasyondan sonra, açılır menüde bulunan niceleme işlevini kullanarak segmentlerin hacimlerini ölçün.
      NOT: Bu eylem için tüm segmentasyonların görünür olması gerekir.
   2. Nicelemeye gidin | Segment İstatistikleri. Uygula'ya tıklayın ve yazılımın her segmentasyon için değerleri görüntüleyen bir tablo oluşturmasını bekleyin. Yazılım, her segmentasyon için iki hacim değeri sağlar: Labelmap (LM) ve Kapalı Yüzey (CS).
      NOT: LM Değeri genellikle tek bir vokselin hacmiyle çarpılan voksel sayısını kullanarak segment hacimlerini hesaplamak için uygundur. CS Value, düzleştirilmiş bir yüzey modeli kullanır ve üçgen yüzey elemanlarına dayalı hacmi entegre eder. CS, anatomik konturlarla daha yakından hizalanır ve doğru ölçümler için önerilir.
   3. Yeni bir hayvandan veri yüklemek için, dosya menüsünde sahneyi kaydedin ve kapatın.
5. Kurumsal kompozisyon analizi
   1. Bu hacimleri doku kütlesine dönüştürmek için yazılımın sağladığı hacim ölçümlerini cm³ cinsinden kullanın ve her doku tipi için uygun yoğunluğu uygulayın. Uluslararası Radyasyon Birimleri ve Ölçümleri Komisyonu²² tarafından belirtilen aşağıdaki doku yoğunluklarını kullanın: 0,95 g/cm³ (yağ dokusu), 1,05 g/cm³ (yağsız doku) ve 1,92 g/cm³ (iskelet dokusu)².
      1. Doku kütlesini hesaplamak için, yazılımdan elde edilen hacmi (cm³) ilgili doku yoğunluğu (g/cm³) ile çarpın:
         Yağ Dokusu Kütlesi: Hacim_{segmentasyonu} X 0.95 = Kütle_yağ
         Yağsız Doku Kütlesi: Hacim_{segmentasyonu} X 1.05 = Kütle_yağsız
         İskelet Dokusu Kütlesi: Hacim_{segmentasyonu} X 1.92 = Kütle_iskeleti
         Toplam Kütle: Kütle_yağ + Kütle_yağsız + Kütle_iskeleti = Kütle_Toplamı
6. Kemik uzunluğu ölçümü
   NOT: Belirli analizler için doku kütlesini kemik uzunluğuna göre düzeltmek için, belirli kemik uzunlukları elde etmek gerekir.
   1. Segment Düzenleyici menüsüne dönün. Her segmentin yanındaki göz simgesine () tıklayarak yağ dokusu ve yağsız doku segmentasyonlarını gizleyin.
      NOT: Sadece iskelet dokusuna karşılık gelen segmentasyon görünür kalmalıdır.
   2. Ana menünün üst köşesindeki İşaretlemeleri/Araç Çubuğunu Değiştir () seçeneğini seçin. Bu, ana menünün hemen altında ikincil bir menü açacaktır. Yeni satır oluştur düğmesini () bulun.
   3. Yeni çizgi oluştur düğmesine tıkladıktan sonra, 3D rekonstrüksiyona gidin ve ölçülecek kemiği belirleyin.
      NOT: Önerilen kemikler tibia veya femur^22'dir.
   4. Kemik tanımlandıktan sonra, kemiğin bir ucuna ve dokunun diğer ucuna tekrar sol tıklayın. Bu eylem, yazılımın kemik boyutunu hesaplamasına izin verir.
      NOT: Tutarlı ölçümler için, her hayvan için kemiğin aynı anatomik bölgesini seçin. Örneğin, femur başı uyluk kemiğinin bir ucu ve lateral kondil uyluk kemiğinin diğer ucu olarak kullanılır.
7. Veri analizi ve normalleştirme
   NOT: Toplu veri, bölüm 3.5'te açıklandığı şekilde elde edilebilir ve olduğu gibi kullanılabilir. Alternatif olarak, yağsız, yağ ve kemik kütlesi iki şekilde normalleştirilebilir.
   1. Görüntülerin elde edildiği günkü doku kütlesi ile hayvanın ağırlığı arasındaki oranı hesaplayın.
      Kiloya normalleştirme: Kütle_yağsız ÷ Vücut ağırlığı
   2. Kütle ve kemik boyutu arasındaki oranı hesaplayın (örneğin, femur veya tibia).
      Femura normalizasyon: Kütle_yağsız ÷ Boy_femur
      Tibiaya normalizasyon: Kütle_yağsız ÷ Boyut_tibia
      NOT: Normalleştirme parametreleri deneysel soruya göre seçilmiştir. Kemik boyutunda değişiklikler bekleniyorsa (örneğin: kemik yeniden şekillenmesini karşılaştırırken) vücut ağırlığına göre normalizasyon önerilir (madde 3.7.1). Ek olarak, deneysel sorunuzda vücut ağırlığında değişiklikler bekleniyorsa, uzun kemik boyutu önerilen normalizasyon parametresidir (madde 3.7.2).

Sonuçlar

Sedasyonlu hayvanın görüntüleme masasına uygun anatomik olarak konumlandırılması, tutarlı ve tekrarlanabilir tarama sonuçları sağlayarak güvenilir sonuçlar elde etmede veri toplama etkinliğini vurgular. Özel gaz dağıtım sistemleri ve buharlaştırıcılar dahil olmak üzere görüntüleme boyunca uygun hayvan sedasyonu, kesin anatomik değerlendirmeler için esastır (Şekil 1).

Şekil 2

Tartışmalar

Tomografi ile değerlendirme, ayrıntılı vücut kompozisyonu bilgisi elde etmek için etkili ve non-invaziv bir yöntemdir. Özellikle mikro-BT, klinik öncesi çalışmalar için değerli sonuç ölçümleri sunar. Kemik alanında, mikro-BT'nin farklı kullanımları vardır, çünkü mikro-mimariyi²³ ve kemik yeniden modellemesini²⁴ analiz etmek özellikle ilginçtir. İç biyolojik yapının morfolojisinin değerlendirilmesi biyomedika...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3DSlicer, version 5.6.2	3D Slicer platform		A free and open-source software for image analysis and scientific visualization.
Amide, version 1.0.1	Amide platform		A free and open-source software used for correcting the Hounsfield Unit values in the processed DICOM images.
Amira, version 4.1	Thermo Fisher Scientific		Used to extract air and water Hounsfield Unit values from the phantom's raw data and to convert images into DICOM files.
Isoforine	Cristália		Isoflurane is a non-flammable liquid anesthetic agent for use in general inhalation anesthesia by vaporization.
Triumph XO subsystem	Gamma Medica-Ideas Flex		Advanced imaging subsystem designed for preclinical small animal imaging, offering high-resolution CT and PET capabilities for quantitative and qualitative analysis.