Micro-Computed Tomography를 사용한 소형 동물의 비침습적 골격근 정량화

요약

이 프로토콜은 마이크로 컴퓨터 단층촬영을 사용하여 작은 동물의 골격근 및 내장 조직, 지방 조직 및 골격 조직을 포함한 제지방량을 비용 효율적으로 정량화할 수 있습니다. 이는 제지방 조직과 지방 조직을 구분하며, 이는 생물 의학 연구, 특히 작은 동물을 대상으로 한 중개 연구에 상당한 이점을 제공합니다.

초록

골격근의 크기, 질량 및 구성은 질병 진행 및 치료 결과에 대한 이해에 직접적인 영향을 미치기 때문에 대사 및 근육 관련 질환을 연구하는 데 중요한 특성입니다. 살아있는 동물의 제지방, 지방 및 골격 질량을 정량화하는 것은 대사학, 생리학, 약리학 및 노인학 연구에서 중요합니다. 그러나 정확한 체성분 측정, 특히 제지방량을 측정하는 것은 기존 평가 기법의 고유한 한계로 인해 여전히 어렵습니다. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(micro-CT)은 소동물 모델의 내부 구조를 고해상도로 시각화할 수 있는 비침습적 방사선 기술입니다. 표준화된 micro-CT 방법은 특히 노화 연구 중 또는 동일한 동물 내의 다른 시점에서 보다 신뢰할 수 있고 영향력 있는 결과로 중개 연구를 크게 향상시킬 수 있습니다. 이러한 잠재력에도 불구하고 이미지 획득 및 분석 방법의 표준화 부족은 서로 다른 연구에서 결과를 비교하는 데 큰 방해가 됩니다. 여기에서는 이러한 문제를 해결하고 소동물 모델과 관련된 연구의 일관성을 촉진하기 위해 마이크로 CT를 사용한 제지방량 분석을 위한 포괄적이고 상세한 저비용 프로토콜을 제시합니다.

서문

크기, 질량 및 구성은 근육 관련 및 대사 질환 메커니즘을 연구하는 데 중요한 골격근 특성입니다¹. 근감소증(Sarcopenia), 악액질(cachexia), 위축(atrophy), 근병증(myopathies)은 질량 감소, 조성 변화, 근육 기능 손상 등의 공통된 표현형을 공유합니다 ^2,3,4,5. 그러나 살아있는 동물의 체성분을 정량화하는 것은 여전히 매우 복잡하고 기술적으로 어려운 일입니다⁶.

생체 내 이미징 및 체성분 분석을 위한 주요 방법론은 이중 에너지 X선 흡수계(DXA), 컴퓨터 단층 촬영(CT) 및 자기 공명 영상(MRI)입니다. 이러한 방법은 주로 제지방량 감소로 이어지는 질병을 선별하고 모니터링하는 데 사용됩니다 ^7,8,9,10,11. DXA는 저렴한 비용으로 인해 체성분 분석의 황금 표준입니다. 그러나 DXA는 MRI 및 CT에 비해 근육 및 지방 조직을 공간적으로 분해할 수 없다는 상당한 단점이 있습니다¹.

MRI는 강한 자기장과 전파를 사용하여 신체 내부 구조에 대한 상세한 이미지를 생성합니다¹². CT에 비해 주요 장점 중 하나는 우수한 대비 해상도로 뚜렷한 연조직 유형 ^1,13,14 간의 탁월한 차별화를 가능하게 한다는 것입니다. CT와 달리 MRI는 전리 방사선을 사용하지 않으므로 반복 사용이 더 안전합니다^15,16. 그러나 MRI는 더 비싸고 접근성이 떨어지며 스캔 시간이 길고 유지 관리 비용이 더 많이 듭니다^13,17. 따라서 소동물 분석에 적합한 MRI 기기는 일반적으로 사용할 수 없습니다.

마이크로 CT는 기존 CT와 유사하지만 소규모 구조 및 생물 의학 연구에 적합합니다¹⁸. Micro-CT는 소동물 모델의 내부 구조를 자세히 시각화할 수 있는 고급 비침습적 방사선 평가 기술입니다. Micro-CT는 X선을 사용하여 다양한 조직 유형에 따른 X선의 차등 감쇠에 의존하여 신체 내부 구조의 상세한 이미지를 생성합니다. 마이크로 CT 스캔 중에 마우스는 원형 갠트리를 통해 천천히 움직이는 테이블 위에 놓입니다. 갠트리 내부에서는 X선관이 마우스 주위를 회전하며 다양한 각도에서 X선을 방출합니다. 반대편에 있는 검출기는 이러한 X선이 신체를 통과한 후 포착합니다⁽¹⁸).

마이크로 CT 스캐너의 소프트웨어는 이러한 여러 각도의 데이터를 처리하여 신체의 2차원 단면 이미지(조각)를 재구성합니다. 재구성을 통해 이러한 조각들을 결합하여 내부 해부학을 포괄적으로 나타낼 수 있다¹⁹. 마이크로 CT 스캔에 의해 생성된 이미지는 신체 내 다양한 조직에 의한 다양한 X선 감쇠 정도를 기반으로 합니다. 이 감쇠는 방사선 밀도^20,21을 표준화하는 척도인 Hounsfield Units(HU)를 사용하여 정량화됩니다. HU 스케일은 각 구조가 약간 다른 값을 가지기 때문에 세분화의 기본입니다.

본 논문에서는 HU 값을 사용하여 뼈, 야윈 조직 및 지방 조직을 정확하게 구별했습니다¹. 확립된 HU 범위를 참조하여 신체 구성을 정확하게 분석하고 비교할 수 있었습니다. 여기에서는 제지방, 지방 및 골격 질량을 시각화하고 정량화하는 데 micro-CT를 사용하여 이미지를 획득하는 방법과 그 응용 프로그램을 보여줍니다.

프로토콜

모든 방법은 리우데자네이루 연방대학교(UFRJ), 리우데자네이루(IACUC - UFRJ; A16/23-025-20). 스캔은 6개월 및 22개월 된 수컷 C57BL/6 마우스에서 수행되었습니다.

1. 동물 준비

1. 기화를 통해 전달되는 산소 혼합물에 2% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취합니다. 정밀 기화기를 사용하여 100% 산소를 혼합하여 유도 및 유지 보수를 위해 정밀 기화기를 사용하십시오.
2. 마취된 동물을 마우스 베드를 사용하여 마이크로 CT 스캔에 누운 자세로 놓습니다. 스캔 중 움직임을 최소화하기 위해 테이프로 마우스를 고정한 다음 갠트리에 삽입합니다.
3. 약 10분 동안 진행되는 실험 내내 동물이 마스크를 착용하여 마취 평면 아래에 머물도록 하는 동시에 필요에 따라 유지 용량을 투여합니다.

2. 이미지 획득 및 재구성

1. 고해상도 전임상 이미징 시스템을 사용하여 신체 마이크로 CT 스캔을 획득합니다. 60kV의 전압과 480μA의 전류에서 플라이 모드 회전을 사용하여 각각 470ms의 노출 시간으로 총 1,024개의 투영을 캡처합니다. 시스템을 1.25 배율로 설정하면 94.72mm의 시야각(FOV)이 생성되고 총 획득 시간은 8.02분입니다. 1 x 1의 비닝으로 이미지를 캡처하면 2,368 x 2,240픽셀의 해상도가 됩니다.
   참고: 이 원고에 사용된 마이크로 CT 이미지용 장비는 마취 마스크와 겹치기 때문에 머리 이미지를 얻는 데 제한이 있습니다. 또한 전체 꼬리 길이는 캡처되지 않습니다. 따라서 머리와 꼬리 분석은 제외했습니다(섹션 3 참조).
2. 증류수가 반쯤 채워진 아크릴 원통형 팬텀(직경: 2.5cm, 길이: 11.5cm)에서 동일한 매개변수로 스캔을 수행하여 공기와 물의 HU를 측정합니다. 획득이 완료되면 노이즈 감소 및 FBP(Filtered Back Projection) 알고리즘에 최적화된 설정으로 획득 소프트웨어를 사용하여 이미지를 재구성합니다. 147μm 등방성 복셀 크기와 640 매트릭스를 사용하여 동물 이미지와 팬텀 이미지를 모두 일괄 재구성합니다.
3. 참조된 소프트웨어를 사용하여 팬텀(원시 데이터)에서 공기와 물 HU를 추출합니다. 이미지를 DICOM 파일로 변환하고 HU 값을 수정합니다.

3. 이미지 분석

1. 파일 업로드
   참고: Micro-CT는 이미지를 시간적, 공간적으로 캡처하여 이미지 시퀀스를 생성하는 기술입니다. 따라서 단일 이미지가 아닌 전체 폴더를 열어야 합니다.
   1. 인터페이스의 왼쪽 상단 영역에서 회청색으로 강조 표시된 3D 슬라이서 메뉴를 찾습니다. 데이터 추가 ()를 클릭합니다.
   2. 두 가지 옵션이 있는 창이 나타나면 첫 번째 옵션인 추가할 디렉토리 선택을 선택합니다.
   3. 대상 동물 DICOM 이미지 시리즈가 포함된 폴더로 이동하여 클릭합니다. 이 작업은 소프트웨어 내의 폴더를 열어 모든 이미지를 동시에 볼 수 있도록 합니다.
   4. 세 개의 화면에 표시되는 이미지를 관찰합니다. 각 화면은 서로 다른 해부학적 평면을 나타냅니다: 관상동맥, 시상면, 횡면은 각각 녹색, 노란색 및 빨간색으로 식별됩니다.
2. 세분화
   1. 상단 탭(모듈)에서 세그먼트 편집기()를 찾아 클릭합니다.
   2. 녹색 + 추가 버튼을 클릭하여 HU 범위를 정의하는 세그먼트를 만듭니다.
   3. 뼈, 야윈 조직 및 지방 조직에 대한 세그먼트를 각각 3번씩 클릭하여 만듭니다.
   4. 각 세그먼트를 두 번 클릭하여 원하는 설정에 따라 이름을 지정하고 색상을 지정합니다.
   5. 창 왼쪽에 있는 임계값 기능을 사용하여 각 세그먼트의 HU 범위를 설정합니다. 이렇게 하려면 임계값 범위 기능을 찾아 각 조직 유형에 대한 HU 값을 입력합니다: 린 조직(-29 - 225 HU), 지방 조직(-190 - -30 HU), 뼈(500 - 5,000 HU). 적용 버튼을 클릭합니다.
      참고: HU 값 비교는 보충 그림 S1 을 참조하십시오.
   6. 각 조직 유형에 대해 분할 과정을 반복합니다.
   7. 3D 표시를 클릭하여 3D 렌더링을 생성합니다.
      알림: 렌더링은 디스플레이의 파란색 사분면에 나타납니다.
3. 이미지 정리
   참고: 세분화 및 3D 렌더링 후에는 제지방 조직, 지방 조직 및 뼈의 체적 측정에 포함되지 않도록 관련 없는 항목을 제외해야 합니다. 정확한 분석을 위해서는 이러한 아티팩트를 제거하는 것이 필수적입니다.
   1. Segmentation 메뉴에서 "Scissors" 도구()를 찾습니다.
   2. 해부학적 평면 또는 3D 렌더링을 선택하여 제거할 개체를 더 명확하게 볼 수 있습니다.
      1. 해부학적 평면을 사용하는 경우 평면의 색상 막대에서 최대화 보기 버튼()을 클릭합니다. 해부학적 평면 창 내에서 마우스 스크롤 버튼을 사용하여 CT 스캔을 앞뒤로 이동합니다.
         참고: 각 창은 독립적으로 스크롤할 수 있습니다.
      2. 3D 렌더링의 경우 마우스 왼쪽 버튼을 사용하여 축을 따라 회전하고 마우스 오른쪽 버튼을 사용하여 확대합니다.
         참고: 키보드의 화살표 키를 사용하여 이미지를 회전할 수도 있습니다.
   3. 가위 도구를 선택한 상태에서 원하지 않는 개체 주위의 분할을 강조 표시하고 둘러싸서 이미지에서 제거합니다. 소프트웨어가 개체를 자동으로 삭제합니다.
      참고: Erase Inside 작업이 선택되어 있는지 확인하십시오. 사용된 장비가 비드, 마취제 또는 수술 장비와 같은 비생물학적 이미지에 대한 이미지를 생성하는 경우 이를 제거하는 것이 중요합니다. 또한 해부학적 영역이 완전히 얻어지지 않은 경우 실험 간의 반복성을 보장하기 위해 완전히 얻어지지 않은 이러한 영역을 제거하기 위해 해부학적 참조를 설정하는 것이 중요합니다. 각 평면에서 원하지 않는 물체를 제거해야 합니다.
   4. 복원 보기 레이아웃 아이콘()을 클릭하면 선택한 창에 관계없이 4개의 창이 있는 화면으로 돌아갑니다.
   5. 개체를 제거해야 하는 모든 창에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
4. 세분화 볼륨
   1. 세분화 후, 드롭다운 메뉴에 있는 quantification 함수를 사용하여 세그먼트의 부피를 정량화합니다.
      참고: 이 작업에는 모든 세분화가 표시되어야 합니다.
   2. Quantification(수량화) | 세그먼트 통계. Apply(적용)를 클릭하고 소프트웨어가 각 세분화에 대한 값을 표시하는 테이블을 생성할 때까지 기다립니다. 소프트웨어는 각 분할에 대해 Labelmap(LM)과 닫힌 표면(CS)의 두 가지 부피 값을 제공합니다.
      참고: LM Value는 일반적으로 복셀 수에 단일 복셀의 부피를 곱한 값을 사용하여 세그먼트 부피를 계산하는 데 적합합니다. CS Value는 평활화된 곡면 모델을 활용하고 삼각형 곡면 요소를 기반으로 체적을 통합합니다. CS는 해부학적 윤곽과 더 밀접하게 정렬되며 정확한 측정을 위해 권장됩니다.
   3. 새 동물에서 데이터를 업로드하려면 파일 메뉴에서 장면을 저장하고 닫습니다.
5. 체구 구성 분석
   1. 소프트웨어에서 제공하는 부피 측정(cm³ )을 사용하여 이러한 부피를 조직 질량으로 변환하고 각 조직 유형에 적절한 밀도를 적용합니다. 국제 방사선 단위 및 측정 위원회²²에서 지정한 0.95g/cm³(지방 조직), 1.05g/cm³(야윈 조직) 및 1.92g/cm³(골격 조직)² 조직 밀도를 사용합니다.
      1. 조직 질량을 계산하려면 소프트웨어에서 얻은 부피(cm³)에 각 조직 밀도(g/cm³)를 곱합니다.
         지방 조직 질량 : 부피_분할 X 0.95 =_{질량 지방}
         린 조직 질량: 부피_분할 X 1.05 =_{질량 제원(Mass Lean})
         골격 조직 질량: 부피_분할 X 1.92 = 골_격 질량
         총 질량 :_{질량 지방 + 질량 경사} + 질량_골격 = 질량_총
6. 뼈 길이 측정
   참고: 특정 분석을 위해 뼈 길이에 따라 조직 질량을 보정하려면 특정 뼈 길이를 얻어야 합니다.
   1. 세그먼트 편집기 메뉴로 돌아갑니다. 지방 조직과 야윈 조직 분할을 숨기려면 각 세그먼트 옆에 있는 눈 아이콘()을 클릭합니다.
      참고: 골격 조직에 해당하는 분할만 볼 수 있어야 합니다.
   2. 메인 메뉴의 상단 모서리에 있는 Toggle Markups/Toolbar( () 옵션을 선택합니다. 그러면 메인 메뉴 바로 아래에 보조 메뉴가 열립니다. 새 줄 만들기 버튼()을 찾습니다.
   3. 새 선 만들기 버튼을 클릭한 후 3D 재구성으로 이동하여 측정할 뼈를 식별합니다.
      참고: 권장되는 뼈는 경골 또는 대퇴골²²입니다.
   4. 뼈가 식별되면 뼈의 한쪽 끝을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 조직의 다른 쪽 끝을 다시 클릭합니다. 이 작업을 통해 소프트웨어는 뼈 크기를 계산할 수 있습니다.
      참고: 일관된 측정을 위해 각 동물에 대해 뼈의 동일한 해부학적 영역을 선택하십시오. 예를 들어, 대퇴골두는 대퇴골의 한쪽 끝으로 사용되고 외측 과두는 대퇴골의 다른 쪽 끝으로 사용됩니다.
7. 데이터 분석 및 정규화
   참고: 질량 데이터는 섹션 3.5에 설명된 대로 얻을 수 있으며 그대로 사용할 수 있습니다. 또는 제지방, 지방 및 뼈 질량을 두 가지 방법으로 정규화할 수 있습니다.
   1. 이미지를 얻은 날의 조직 질량과 동물의 체중 사이의 비율을 계산합니다.
      체중에 대한 정규화 : 체중 ÷_체중 (Body Weight)
   2. 질량과 뼈 크기(예: 대퇴골 또는 경골) 간의 비율을 계산합니다.
      대퇴골에 대한 정규화: Mass_lean ÷ Size_femur
      경골로 정규화: Mass_lean ÷ Size_tibia
      참고: 정규화 매개변수는 실험 질문을 기반으로 선택됩니다. 뼈 크기의 변화가 예상되는 경우(예: 뼈 리모델링을 비교할 때) 체중에 의한 정규화가 제안됩니다(항목 3.7.1). 또한 실험 질문에서 체중의 변화가 예상되는 경우 긴 뼈 크기는 제안된 정규화 매개변수(항목 3.7.2)입니다.

결과

진정제를 투여한 동물을 이미징 테이블에서 적절하게 해부학적으로 배치하면 일관되고 재현 가능한 스캔 결과를 보장하여 신뢰할 수 있는 결과를 달성하는 데 있어 데이터 수집 효율성을 강조합니다. 특수 가스 전달 시스템 및 기화기를 포함한 이미징 전반에 걸쳐 적절한 동물 진정제는 정확한 해부학적 평가를 위한 기본입니다(그림 1).

토론

단층 촬영을 통한 평가는 자세한 체성분 정보를 얻기 위한 효과적이고 비침습적인 방법입니다. 특히 Micro-CT는 전임상 연구를 위한 유용한 결과 측정을 제공합니다. 뼈 분야에서, 마이크로 CT는 마이크로 아키텍처^{(micro-architecture) 23} 와 뼈 리모델링(bone remodeling^{) 24} 을 분석하는 것이 특히 흥미롭기 때문에 다양한 용도로 사용됩니다. 내부 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3DSlicer, version 5.6.2	3D Slicer platform		A free and open-source software for image analysis and scientific visualization.
Amide, version 1.0.1	Amide platform		A free and open-source software used for correcting the Hounsfield Unit values in the processed DICOM images.
Amira, version 4.1	Thermo Fisher Scientific		Used to extract air and water Hounsfield Unit values from the phantom's raw data and to convert images into DICOM files.
Isoforine	Cristália		Isoflurane is a non-flammable liquid anesthetic agent for use in general inhalation anesthesia by vaporization.
Triumph XO subsystem	Gamma Medica-Ideas Flex		Advanced imaging subsystem designed for preclinical small animal imaging, offering high-resolution CT and PET capabilities for quantitative and qualitative analysis.