כימות שרירי שלד לא פולשני בבעלי חיים קטנים באמצעות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת

Summary

פרוטוקול זה משתמש בטומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת כדי לאפשר כימות חסכוני של מסה רזה, כולל שרירי השלד ורקמת הקרביים, רקמת השומן ורקמת השלד בבעלי חיים קטנים. הוא מבחין בין רקמה רזה לרקמת שומן, מה שמציע יתרונות משמעותיים למחקר ביו-רפואי, במיוחד במחקר תרגומי בבעלי חיים קטנים.

Abstract

גודל, מסה והרכב שרירי השלד הם מאפיינים קריטיים לחקר מחלות מטבוליות ומחלות הקשורות לשרירים, מכיוון שהם משפיעים ישירות על הבנת התקדמות המחלה ותוצאות הטיפול. כימות מסת הרזה, השומן והשלד של בעל חיים חי חשוב במחקרים מטבוליים, פיזיולוגיים, פרמקולוגיים ומדעי הגרום. עם זאת, השגת מדידות מדויקות של הרכב הגוף, במיוחד של מסה רזה, נותרה מאתגרת בשל המגבלות האינהרנטיות של טכניקות הערכה קונבנציונליות. טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (micro-CT) היא טכניקה רדיולוגית לא פולשנית המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של מבנים פנימיים במודלים של בעלי חיים קטנים. שיטת מיקרו-CT סטנדרטית יכולה לשפר משמעותית את המחקר התרגומי עם תוצאות אמינות ומשפיעות יותר, במיוחד במהלך מחקרי הזדקנות או בנקודות זמן שונות בתוך אותו בעל חיים. למרות הפוטנציאל שלו, היעדר סטנדרטיזציה בשיטות רכישת וניתוח תמונות מעכב באופן משמעותי את יכולת ההשוואה של התוצאות בין מחקרים שונים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף ומפורט בעלות נמוכה לניתוח מסה רזה באמצעות מיקרו-CT כדי להתמודד עם אתגרים אלה ולקדם עקביות במחקר הכולל מודלים של בעלי חיים קטנים.

Introduction

גודל, מסה והרכב הם תכונות חיוניות של שרירי השלד לחקר מנגנוני מחלות הקשורות לשרירים ומטבוליות¹. סרקופניה, קאשקסיה, ניוון ומיופתיה חולקים פנוטיפים משותפים: ירידה במסה, שינוי בהרכב ופגיעה בתפקוד השרירים 2,3,4,5. עם זאת, כימות הרכב הגוף בבעל חיים חי נותר מורכב מאוד ומאתגר מבחינה טכנית⁶.

המתודולוגיות העיקריות להדמיה in vivo וניתוח הרכב הגוף הן ספיגת קרני רנטגן באנרגיה כפולה (DXA), טומוגרפיה ממוחשבת (CT) והדמיית תהודה מגנטית (MRI). שיטות אלו משמשות בעיקר לסינון וניטור מחלות המובילות להפחתת מסת שריר 7,8,9,10,11. DXA הוא תקן הזהב לניתוח הרכב הגוף בשל עלותו הנמוכה יותר. עם זאת, ל-DXA יש חיסרון משמעותי בהשוואה ל-MRI ו-CT: חוסר היכולת שלו לפתור מרחבית רקמת שריר ושומן¹.

MRI משתמש בשדות מגנטיים חזקים ובגלי רדיו כדי ליצור תמונות מפורטות של המבנים הפנימיים של הגוף¹². אחד היתרונות העיקריים שלו על פני CT הוא רזולוציית הניגודיות המעולה שלו, המאפשרת בידול מצוין בין סוגי רקמות רכות שונות ^1,13,14. בניגוד ל-CT, MRI אינו משתמש בקרינה מייננת, מה שהופך אותו לבטוח יותר לשימוש חוזר^15,16. עם זאת, MRI יקר יותר ופחות נגיש, עם זמני סריקה ארוכים יותר ועלויות תחזוקה גבוהות יותר^13,17. לפיכך, מכשירי MRI המותאמים לניתוח בעלי חיים קטנים אינם זמינים בדרך כלל.

מיקרו-CT דומה ל-CT קונבנציונלי אך מותאם למבנים קטנים ולמחקר ביו-רפואי¹⁸. Micro-CT היא טכניקת הערכה רדיולוגית מתקדמת ולא פולשנית המאפשרת הדמיה מפורטת של מבנים פנימיים במודלים של בעלי חיים קטנים. מיקרו-CT משתמש בקרני רנטגן כדי ליצור תמונות מפורטות של המבנים הפנימיים של הגוף, תוך הסתמכות על הנחתה דיפרנציאלית של קרני רנטגן על ידי סוגי רקמות שונים. במהלך סריקת מיקרו-CT, העכבר שוכב על שולחן שנע לאט דרך שער מעגלי. בתוך השער מסתובב צינור רנטגן סביב העכבר, ופולט קרני רנטגן מזוויות שונות. גלאים בצד הנגדי לוכדים את קרני הרנטגן הללו לאחר שהן עוברות דרך הגוף¹⁸.

תוכנת סורק המיקרו-CT מעבדת את הנתונים מזוויות מרובות אלה כדי לשחזר תמונות חתך דו-ממדיות (פרוסות) של הגוף. באמצעות שחזור, ניתן לשלב את הפרוסות הללו כדי לייצג את האנטומיה הפנימית באופן מקיף¹⁹. התמונות המופקות על ידי סריקות מיקרו-CT מבוססות על דרגות שונות של הנחתת קרני רנטגן על ידי רקמות שונות בגוף. הנחתה זו מכומתת באמצעות יחידות Hounsfield (HU), סולם המתקנן את צפיפות הרדיו^20,21. סולם HU הוא בסיסי לסגמנטציה, מכיוון שלכל מבנה יש ערך שונה במקצת.

במאמר הנוכחי, השתמשנו בערכי HU כדי להבדיל במדויק בין עצם, רקמה רזה ורקמת שומן¹. על ידי התייחסות לטווחי HU שנקבעו, הבטחנו ניתוח והשוואה מדויקים של הרכב הגוף. כאן, אנו מדגימים כיצד לרכוש תמונות באמצעות מיקרו-CT ויישומו בהדמיה וכימות של מסת רזה, שומן ושלד.

Protocol

כל השיטות אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הפדרלית של ריו דה ז'ניירו (UFRJ), ריו דה ז'ניירו (IACUC - UFRJ; A16/23-025-20). הסריקות בוצעו על עכברי C57BL/6 זכרים בגילאי 6 ו-22 חודשים.

1. הכנת בעלי חיים

1. להרדים עכברים באמצעות איזופלורן 2% בתערובת של חמצן המועבר באמצעות אידוי. השתמש בוופורייזר מדויק הן לאינדוקציה והן לתחזוקה עם תערובת של 100% חמצן באמצעות וופורייזר מדויק.
2. מקם את החיה המורדמת בשכיבה על סריקת המיקרו-CT באמצעות מיטת עכבר. אבטח את העכבר עם סרט כדי למזער את התנועה במהלך הסריקה ולאחר מכן הכנס אותו לשער הסריקה
3. לאורך הניסוי, שנמשך כ-10 דקות, ודא שהחיה לובשת מסכה כדי לשמור אותה מתחת למישור ההרדמה בזמן קבלת מנת התחזוקה לפי הצורך.

2. רכישה ובנייה מחדש של תמונות

1. לרכוש סריקות מיקרו-CT של הגוף באמצעות מערכת הדמיה פרה-קלינית ברזולוציה גבוהה. לכוד בסך הכל 1,024 הקרנות עם זמן חשיפה של 470 אלפיות השנייה כל אחת, תוך שימוש בסיבוב אופן טיסה במתח של 60 קילו וולט וזרם של 480 μA. הגדר את המערכת להגדלה של 1.25, וכתוצאה מכך שדה ראייה (FOV) של 94.72 מ"מ לזמן רכישה כולל של 8.02 דקות. צלם תמונות עם שילוב של 1 x 1, והתוצאה היא רזולוציה של 2,368 x 2,240 פיקסלים.
   הערה: הציוד המשמש בכתב יד זה לתמונות מיקרו-CT מציג מגבלות בהשגת תמונות ראש עקב החפיפה עם מסכת ההרדמה. בנוסף, כל אורך הזנב אינו נלכד. לפיכך, לא כללנו את ניתוח הראש והזנב (ראה סעיף 3).
2. בצע סריקה עם אותם פרמטרים על פנטום גלילי אקרילי (קוטר: 2.5 ס"מ, אורך: 11.5 ס"מ) מלא למחצה במים מזוקקים כדי לקבוע את ה-HU לאוויר ומים. עם השלמת הרכישות, שחזר את התמונות באמצעות תוכנת הרכישה עם הגדרות מותאמות להפחתת רעש ואלגוריתם הקרנה אחורית מסוננת (FBP). שחזור אצווה של תמונות בעלי חיים ופנטום באמצעות גודל ווקסל איזוטרופי של 147 מיקרומטר ומטריצה של 640.
3. חלץ אוויר ומים HU מהפנטום (נתונים גולמיים) באמצעות התוכנה המוזכרת. המירו את התמונות לקובצי DICOM ותקנו את ערכי ה-HU.

3. ניתוח תמונות

1. העלאת קובץ
   הערה: מיקרו-CT היא טכניקה הלוכדת תמונות באופן זמני ומרחבי, ויוצרת רצף תמונות. לכן, יש צורך לפתוח את התיקיה כולה ולא תמונה בודדת.
   1. באזור השמאלי העליון של הממשק, מצא את תפריט 3D Slicer , המודגש בצבע כחול-אפרפר. לחץ על הוסף נתונים ().
   2. כאשר מופיע חלון עם שתי אפשרויות, בחר/י באפשרות הראשונה: בחר/י ״ספריה להוספה״.
   3. נווט לתיקיה המכילה את סדרת תמונות DICOM של חיות היעד ולחץ עליה. פעולה זו תפתח את התיקייה בתוך התוכנה, ותאפשר צפייה בכל התמונות בו זמנית.
   4. התבונן בתמונות המוצגות על פני שלושה מסכים. כל מסך מייצג מישור אנטומי שונה: עטרה, סגיטלי ורוחבי, המזוהים על ידי הצבעים ירוק, צהוב ואדום, בהתאמה.
2. פילוח
   1. אתר את עורך הפלחים () בכרטיסייה העליונה (מודולים), ולחץ עליו.
   2. לחץ על הלחצן הירוק + הוסף כדי ליצור פלחים, המגדירים את טווח ה-HU.
   3. צור מקטעים עבור עצם, רקמה רזה ורקמת שומן על ידי לחיצה על פי 3 כל אחד.
   4. לחץ פעמיים על כל קטע כדי לתת לו שם ולצבוע אותו בהתאם להגדרות הרצויות.
   5. הגדר את טווח ה-HU עבור כל מקטע באמצעות הפונקציה Threshold, הממוקמת בצד שמאל של החלון. לשם כך, מצא את הפונקציה טווח סף והזן את ערכי ה-HU עבור כל סוג רקמה: רקמה רזה (-29 עד 225 HU); רקמת שומן (-190 עד -30 HU); עצם (500 עד 5,000 HU). לחץ על לחצן החל.
      הערה: עיין באיור משלים S1 להשוואות ערכי HU.
   6. חזור על תהליך הפילוח עבור כל סוג רקמה.
   7. לחצו על 'הצג תלת-ממד ' ליצירת רינדור תלת-ממד.
      הערה: העיבוד יופיע ברבע הכחול של התצוגה.
3. ניקוי התמונה
   הערה: לאחר פילוח ועיבוד תלת מימד, יש לכלול פריטים זרים כדי להבטיח שהם אינם כלולים במדידות הנפח של רקמה רזה, רקמת שומן ועצם. הסרת חפצים אלה חיונית כדי להבטיח ניתוח מדויק.
   1. אתר את הכלי "מספריים" () בתפריט סגמנטציה .
   2. בחרו במישור האנטומי או בעיבוד התלת-ממדי לתצוגה ברורה יותר של העצם שיש להסיר.
      1. בשעת שימוש במישור אנטומי, לחצו על לחצן התצוגה המקסימום () בסרגל הצבעוני של המישור. בתוך חלון המישור האנטומי, השתמש בלחצן הגלילה של העכבר כדי לנווט קדימה או אחורה בסריקת ה-CT.
         הערה: כל חלון יכול לגלול בנפרד.
      2. לעיבוד תלת-ממד, השתמשו בלחצן העכבר השמאלי כדי לסובב לאורך ציר כלשהו ובלחצן העכבר הימני כדי להגדיל את התצוגה.
         הערה: מקשי החצים במקלדת יכולים גם לסובב את התמונה.
   3. כשהכלי מספריים נבחר, סמן את הפילוח סביב האובייקט הלא רצוי והקיף אותו כדי להסיר אותו מהתמונה. התוכנה מוחקת את האובייקט באופן אוטומטי.
      הערה: ודא שהפעולה מחק בפנים נבחרה. אם הציוד המשמש מייצר תמונות עבור כל תמונה לא ביולוגית, כגון חרוז, חומר הרדמה או ציוד כירורגי, חשוב להסיר אותו. בנוסף, אם אזור אנטומי כלשהו לא הושג במלואו, חיוני לקבוע התייחסות אנטומית להסרת אזורים אלה שלא הושגו במלואם כדי להבטיח חזרה בין ניסויים. יש להסיר חפצים לא רצויים בכל מישור.
   4. לחץ על סמל פריסת תצוגת השחזור () כדי לחזור למסך עם ארבעת החלונות, ללא קשר לחלון שנבחר.
   5. חזור על התהליך עבור כל החלונות שבהם האובייקט זקוק להסרה.
4. נפח פילוח
   1. לאחר הפילוח, כמת את נפחי הקטעים באמצעות פונקציית הכימות שנמצאת בתפריט הנפתח.
      הערה: כל הפילוח חייב להיות גלוי עבור פעולה זו.
   2. נווט אל כימות | סטטיסטיקה של פלחים. לחץ על החל והמתן עד שהתוכנה תיצור טבלה המציגה ערכים עבור כל פילוח. התוכנה מספקת שני ערכי נפח עבור כל פילוח: מפת תוויות (LM) ומשטח סגור (CS).
      הערה: ערך LM מתאים בדרך כלל לחישוב נפחי מקטעים, תוך שימוש במספר הווקסלים כפול עוצמת הקול של ווקסל בודד. CS Value משתמש במודל משטח מוחלק ומשלב נפח המבוסס על רכיבי משטח משולשים. CS מיישר קו קרוב יותר לקווי המתאר האנטומיים ומומלץ למדידות מדויקות.
   3. כדי להעלות נתונים מבעל חיים חדש, שמור וסגור את הסצנה בתפריט הקובץ .
5. ניתוח הרכב הגוף
   1. השתמש במדידות הנפח המסופקות על ידי התוכנה בס"מ³ כדי להמיר נפחים אלה למסת רקמה ולהחיל את הצפיפות המתאימה לכל סוג רקמה. השתמש בצפיפות הרקמה הבאה שצוינה על ידי הוועדה הבינלאומית ליחידות קרינה ומדידות²²: 0.95 גרם/סמ"ק (רקמת שומן), 1.05 גרם/סמ"ק (רקמת רזה) ו-1.92 גרם/סמ"ק (רקמת שלד)².
      1. כדי לחשב מסת רקמה, הכפל את הנפח (cm³) המתקבל מהתוכנה בצפיפות הרקמה המתאימה (g/cm³):
         מסת רקמת שומן:_פילוח נפח X 0.95 =_שומן מסה
         מסת רקמה_{רזה: פילוח נפח} X 1.05 =_{מסה רזה}
         מסת רקמת שלד:_{פילוח נפח} X 1.92 = מסה_שלד
         מסה כוללת:_{מסה שומן} + מסה_רזה + מסה_שלד =_{מסה סך הכל}
6. מדידת אורך עצם
   הערה: כדי לתקן מסת רקמה לפי אורך עצם עבור ניתוחים מסוימים, יש צורך להשיג אורכי עצם ספציפיים.
   1. חזור לתפריט עורך פלחי שוק . הסתר את רקמת השומן וסגמנטציות הרקמה הרזה על ידי לחיצה על סמל העין () ליד כל מקטע.
      הערה: רק הפילוח המתאים לרקמת השלד צריך להישאר גלוי.
   2. בחר באפשרות Toggle Markups/Toolbar () בפינה העליונה של התפריט הראשי. פעולה זו תפתח תפריט משני ממש מתחת לתפריט הראשי. אתר את הלחצן צור שורה חדשה ().
   3. לאחר לחיצה על כפתור צור קו חדש , נווט לשחזור התלת מימד וזהה את העצם למדידה.
      הערה: העצמות המומלצות הן השוקה או עצם הירך²².
   4. לאחר זיהוי העצם, לחץ לחיצה ימנית על קצה אחד של העצם ושוב על הקצה השני של הרקמה. פעולה זו מאפשרת לתוכנה לחשב את גודל העצם.
      הערה: למדידות עקביות, בחר את אותו אזור אנטומי של העצם עבור כל בעל חיים. לדוגמה, ראש הירך משמש כקצה אחד והקונדיל הרוחבי כקצה השני של עצם הירך.
7. ניתוח נתונים ונורמליזציה
   הערה: ניתן להשיג את נתוני המסה כפי שהוסבר בסעיף 3.5 ולהשתמש בהם כפי שהם. לחלופין, ניתן לנרמל את מסת הרזה, השומן והעצם בשתי דרכים.
   1. חשב את היחס בין מסת הרקמה למשקל החיה ביום קבלת התמונות.
      נורמליזציה למשקל: מסה_רזה ÷ משקל גוף
   2. חשב את היחס בין מסה לגודל העצם (למשל, עצם הירך או השוקה).
      נורמליזציה לעצם הירך: מסה_רזה ÷ גודל_{עצם הירך}
      נורמליזציה לשוקה: מסה_רזה ÷ גודל_השוקה
      הערה: פרמטרי הנורמליזציה נבחרים על סמך שאלת הניסוי. אם צפויים שינויים בגודל העצם (לדוגמה: כאשר משווים שיפוץ עצם) מוצעת הנורמליזציה לפי משקל הגוף (פריט 3.7.1). בנוסף, אם צפויים שינויים במשקל הגוף בשאלת הניסוי שלך, גודל העצם הארוך הוא פרמטר הנורמליזציה המוצע (פריט 3.7.2).

תוצאות

מיקום אנטומי נכון של החיה המורדמת על שולחן ההדמיה מבטיח תוצאות סריקה עקביות וניתנות לשחזור, ומדגיש את יעילות רכישת הנתונים בהשגת תוצאות אמינות. טשטוש נכון של בעלי חיים במהלך ההדמיה, כולל מערכות הובלת גז מיוחדות ומכשירי אידוי, הוא בסיסי עבור הערכות אנטומיות מדויקות (

Discussion

הערכה באמצעות טומוגרפיה היא שיטה יעילה ולא פולשנית להשגת מידע מפורט על הרכב הגוף. מיקרו-CT, במיוחד, מציע מדדי תוצאה חשובים למחקרים פרה-קליניים. בתחום העצם, למיקרו-CT שימושים שונים, שכן ניתוח המיקרו-ארכיטקטורה²³ ושיפוץ עצם²⁴ מעניינים במיוחד. הערכת המ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3DSlicer, version 5.6.2	3D Slicer platform		A free and open-source software for image analysis and scientific visualization.
Amide, version 1.0.1	Amide platform		A free and open-source software used for correcting the Hounsfield Unit values in the processed DICOM images.
Amira, version 4.1	Thermo Fisher Scientific		Used to extract air and water Hounsfield Unit values from the phantom's raw data and to convert images into DICOM files.
Isoforine	Cristália		Isoflurane is a non-flammable liquid anesthetic agent for use in general inhalation anesthesia by vaporization.
Triumph XO subsystem	Gamma Medica-Ideas Flex		Advanced imaging subsystem designed for preclinical small animal imaging, offering high-resolution CT and PET capabilities for quantitative and qualitative analysis.