Quantificação não invasiva do músculo esquelético em pequenos animais por meio de microtomografia computadorizada

Resumo

Este protocolo usa microtomografia computadorizada para permitir a quantificação econômica da massa magra, incluindo músculo esquelético e tecido visceral, tecido adiposo e tecido esquelético em pequenos animais. Ele distingue entre tecido magro e adiposo, o que oferece vantagens significativas para a pesquisa biomédica, particularmente na pesquisa translacional em pequenos animais.

Resumo

O tamanho, a massa e a composição do músculo esquelético são propriedades críticas para o estudo de doenças metabólicas e relacionadas ao músculo, pois afetam diretamente a compreensão da progressão da doença e os resultados do tratamento. Quantificar a massa magra, adiposa e esquelética de um animal vivo é importante em estudos metabólicos, fisiológicos, farmacológicos e de gerociência. No entanto, a obtenção de medidas precisas da composição corporal, especialmente da massa magra, continua sendo um desafio devido às limitações inerentes às técnicas convencionais de avaliação. A microtomografia computadorizada (microtomografia computadorizada) é uma técnica radiológica não invasiva que permite a visualização de alta resolução de estruturas internas em modelos de pequenos animais. Um método padronizado de micro-CT pode melhorar significativamente a pesquisa translacional com resultados mais confiáveis e impactantes, particularmente durante estudos de envelhecimento ou em diferentes momentos dentro do mesmo animal. Apesar de seu potencial, a falta de padronização nos métodos de aquisição e análise de imagens dificulta significativamente a comparabilidade dos resultados entre diferentes estudos. Aqui, apresentamos um protocolo abrangente e detalhado de baixo custo para análise de massa magra usando micro-CT para enfrentar esses desafios e promover a consistência na pesquisa envolvendo modelos de pequenos animais.

Introdução

Tamanho, massa e composição são propriedades cruciais do músculo esquelético para estudar os mecanismos de doenças metabólicas e relacionadas ao músculo¹. Sarcopenia, caquexia, atrofia e miopatias compartilham fenótipos comuns: redução de massa, alteração na composição e função muscular prejudicada 2,3,4,5. No entanto, quantificar a composição corporal em um animal vivo permanece altamente complexo e tecnicamente desafiador⁶.

As principais metodologias para imagens in vivo e análise da composição corporal são absorciometria de raios-X de dupla energia (DXA), tomografia computadorizada (TC) e ressonância magnética (MRI). Esses métodos são empregados principalmente para rastrear e monitorar doenças que levam à redução da massa magra 7,8,9,10,11. A DXA é o padrão ouro para análise da composição corporal devido ao seu menor custo. No entanto, a DXA tem uma desvantagem significativa em comparação com a RM e a TC: sua incapacidade de resolver espacialmente o tecido muscular e adiposo¹.

A ressonância magnética usa fortes campos magnéticos e ondas de rádio para gerar imagens detalhadas das estruturas internas do corpo¹². Uma de suas principais vantagens em relação à TC é sua resolução superior de contraste, permitindo excelente diferenciação entre os distintos tipos de partes moles ^1,13,14. Ao contrário da TC, a RM não utiliza radiação ionizante, tornando-a mais segura para uso repetido^15,16. No entanto, a RM é mais cara e menos acessível, com tempos de varredura mais longos e custos de manutenção^{mais altos 13,17}. Assim, instrumentos de ressonância magnética adaptados para análise de pequenos animais geralmente não estão disponíveis.

A micro-TC é semelhante à TC convencional, mas adaptada para pequenas estruturas e pesquisas biomédicas¹⁸. A micro-TC é uma técnica avançada de avaliação radiológica não invasiva que permite a visualização detalhada de estruturas internas em modelos de pequenos animais. A micro-TC usa raios-X para criar imagens detalhadas das estruturas internas do corpo, contando com a atenuação diferencial dos raios-X por vários tipos de tecido. Durante uma micro-tomografia, o camundongo está deitado em uma mesa que se move lentamente através de um pórtico circular. Dentro do pórtico, um tubo de raios-X gira em torno do mouse, emitindo raios-X de vários ângulos. Os detectores do lado oposto capturam esses raios-X depois que eles passam pelo corpo¹⁸.

O software do scanner micro-CT processa os dados desses múltiplos ângulos para reconstruir imagens transversais bidimensionais (fatias) do corpo. Por meio da reconstrução, esses cortes podem ser combinados para representar a anatomia interna de forma abrangente¹⁹. As imagens produzidas por microtomografias computadorizadas são baseadas nos vários graus de atenuação de raios-X por diferentes tecidos do corpo. Essa atenuação é quantificada por meio das Unidades Hounsfield (HU), escala que padroniza a radiodensidade^20,21. A escala HU é fundamental para a segmentação, pois cada estrutura tem um valor ligeiramente diferente.

No presente artigo, usamos valores de HU para diferenciar com precisão entre osso, tecido magro e tecido adiposo¹. Ao referenciar as faixas de HU estabelecidas, garantimos uma análise e comparação precisas da composição corporal. Aqui, demonstramos como adquirir imagens usando micro-CT e sua aplicação na visualização e quantificação de massa magra, gorda e esquelética.

Protocolo

Todos os métodos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Rio de Janeiro (IACUC - UFRJ; A16/23-025-20). As varreduras foram realizadas em camundongos C57BL/6 machos com idades entre 6 e 22 meses.

1. Preparação animal

1. Anestesiar camundongos usando isoflurano a 2% em uma mistura de oxigênio fornecida por vaporização. Use um vaporizador de precisão para indução e manutenção com uma mistura de 100% de oxigênio usando um vaporizador de precisão.
2. Posicione o animal anestesiado em decúbito dorsal na microtomografia computadorizada usando uma cama de camundongo. Prenda o mouse com fita adesiva para minimizar o movimento durante a varredura e, em seguida, insira-o no pórtico.
3. Durante todo o experimento, que dura aproximadamente 10 min, certifique-se de que o animal use uma máscara para mantê-lo sob o plano anestésico enquanto recebe a dose de manutenção conforme necessário.

2. Aquisição e reconstrução de imagens

1. Adquira microtomografias computadorizadas corporais usando um sistema de imagem pré-clínica de alta resolução. Capture um total de 1.024 projeções com um tempo de exposição de 470 ms cada, usando uma rotação em modo de voo a uma tensão de 60 kV e uma corrente de 480 μA. Defina o sistema para uma ampliação de 1,25, resultando em um campo de visão (FOV) de 94,72 mm para um tempo total de aquisição de 8,02 min. Capture imagens com um binning de 1 x 1, resultando em uma resolução de 2.368 x 2.240 pixels.
   NOTA: O equipamento utilizado neste manuscrito para imagens de micro-TC apresenta limitações na obtenção de imagens de crânio devido à sobreposição com a máscara anestésica. Além disso, todo o comprimento da cauda não é capturado. Assim, excluímos a análise de cabeça e cauda (ver seção 3).
2. Efectuar uma varredura com os mesmos parâmetros em um simulador cilíndrico acrílico (diâmetro: 2,5 cm, comprimento: 11,5 cm) cheio até a metade com água destilada para determinar a UH para ar e água. Após a conclusão das aquisições, reconstrua as imagens usando o software de aquisição com configurações otimizadas para redução de ruído e o algoritmo Filtered Back Projection (FBP). Reconstrua em lote imagens de animais e fantasmas usando um tamanho de voxel isotrópico de 147 μm e uma matriz de 640.
3. Extrair ar e água da UC do simulador (dados brutos) utilizando o software referenciado. Converta as imagens em arquivos DICOM e corrija os valores de HU.

3. Análise de imagem

1. Carregando um arquivo
   NOTA: Micro-CT é uma técnica que captura imagens temporal e espacialmente, gerando uma sequência de imagens. Portanto, é necessário abrir a pasta inteira em vez de uma única imagem.
   1. Na área superior esquerda da interface, encontre o menu Segmentação 3D , destacado em uma cor azul-acinzentada. Clique em Adicionar dados ().
   2. Quando uma janela com duas opções aparecer, selecione a primeira opção: Escolha o diretório a ser adicionado.
   3. Navegue até a pasta que contém a série de imagens DICOM do animal de destino e clique nela. Esta ação abrirá a pasta dentro do software, permitindo que todas as imagens sejam visualizadas simultaneamente.
   4. Observe as imagens exibidas em três telas. Cada tela representa um plano anatômico diferente: coronal, sagital e transversal, identificados pelas cores verde, amarelo e vermelho, respectivamente.
2. Segmentação
   1. Localize o Editor de segmentos () na guia superior (Módulos) e clique nele.
   2. Clique no botão verde + Adicionar para criar segmentos, definindo o intervalo de UC.
   3. Crie segmentos para osso, tecido magro e tecido adiposo clicando em 3x cada.
   4. Clique duas vezes em cada segmento para nomeá-lo e colori-lo de acordo com as configurações desejadas.
   5. Defina o intervalo de UC para cada segmento usando a função Limiar, localizada no lado esquerdo da janela. Para fazer isso, encontre a função Threshold Range e insira os valores de HU para cada tipo de tecido: tecido magro (-29 a 225 HU); tecido adiposo (-190 a -30 HU); osso (500 a 5.000 HU). Clique no botão Aplicar.
      NOTA: Consulte a Figura Suplementar S1 para comparações de valores de HU.
   6. Repita o processo de segmentação para cada tipo de tecido.
   7. Clique em Mostrar 3D para gerar uma renderização 3D.
      NOTA: A renderização aparecerá no quadrante azul da tela.
3. Limpando a imagem
   NOTA: Após a segmentação e renderização 3D, itens estranhos devem ser excluídos para garantir que não sejam incluídos nas medições volumétricas de tecido magro, tecido adiposo e osso. A remoção desses artefatos é essencial para garantir uma análise precisa.
   1. Localize a ferramenta "Tesoura" () no menu Segmentação .
   2. Escolha o plano anatômico ou a renderização 3D para uma visão mais clara do objeto a ser removido.
      1. Se estiver usando um plano anatômico, clique no botão maximizar visualização () na barra colorida do plano. Dentro da janela do plano anatômico, use o botão de rolagem do mouse para navegar para frente ou para trás na tomografia computadorizada.
         NOTA: Cada janela pode rolar independentemente.
      2. Para renderização 3D, use o botão esquerdo do mouse para girar ao longo de qualquer eixo e o botão direito do mouse para aumentar o zoom.
         NOTA: As teclas de seta no teclado também podem girar a imagem.
   3. Com a ferramenta Tesoura selecionada, realce a segmentação ao redor do objeto indesejado e circunde-o para removê-lo da imagem. O software exclui o objeto automaticamente.
      NOTA: Certifique-se de que a operação Apagar dentro esteja selecionada. Se o equipamento utilizado gerar imagens para qualquer imagem não biológica, como o grânulo, anestésico ou equipamento cirúrgico, é importante removê-lo. Além disso, se alguma área anatômica não for totalmente obtida, é fundamental estabelecer uma referência anatômica para remover essas áreas que não são totalmente obtidas para garantir a repetibilidade entre os experimentos. Objetos indesejados devem ser removidos em cada plano.
   4. Clique no ícone de layout de exibição de restauração () para retornar à tela com as quatro janelas, independentemente da janela selecionada.
   5. Repita o processo para todas as janelas em que o objeto precisa ser removido.
4. Volume de segmentação
   1. Após a segmentação, quantifique os volumes dos segmentos usando a função de quantificação encontrada no menu suspenso.
      NOTA: Todas as segmentações devem estar visíveis para esta ação.
   2. Navegue até Quantificação | Estatísticas de segmento. Clique em Aplicar e aguarde o software gerar uma tabela exibindo valores para cada segmentação. O software fornece dois valores de volume para cada segmentação: Labelmap (LM) e Closed Surface (CS).
      NOTA: O valor LM é geralmente adequado para calcular volumes de segmento, usando o número de voxels multiplicado pelo volume de um único voxel. O CS Value utiliza um modelo de superfície suavizada e integra o volume com base em elementos de superfície triangulares. O CS se alinha mais de perto com os contornos anatômicos e é recomendado para medições precisas.
   3. Para carregar dados de um novo animal, salve e feche a cena no menu de arquivo .
5. Análise da composição corporal
   1. Use as medições de volume fornecidas pelo software em cm³ para converter esses volumes em massa de tecido e aplicar a densidade apropriada para cada tipo de tecido. Use as seguintes densidades de tecido especificadas pela Comissão Internacional de Unidades e Medidas^{de Radiação 22}: 0,95 g/cm³ (tecido adiposo), 1,05 g/cm³ (tecido magro) e 1,92 g/cm³ (tecido esquelético)².
      1. Para calcular a massa tecidual, multiplique o volume (cm³) obtido do software pela respectiva densidade tecidual (g/cm³):
         Massa de tecido adiposo:_{segmentação de} volume X 0,95 = massa_adiposa
         Massa de Tecido Magro:_{Segmentação de} Volume X 1,05 = Massa_Magra
         Massa do tecido esquelético:_{segmentação de} volume X 1,92 = massa_esquelética
         Massa Total: Massa_adiposa + Massa_magra + Massa_esquelética = Massa_Total
6. Medição do comprimento do osso
   NOTA: Para corrigir a massa tecidual pelo comprimento ósseo para determinadas análises, é necessário obter comprimentos ósseos específicos.
   1. Retorne ao menu Editor de segmentos . Oculte as segmentações de tecido adiposo e tecido magro clicando no ícone de olho () ao lado de cada segmento.
      NOTA: Apenas a segmentação correspondente ao tecido esquelético deve permanecer visível.
   2. Selecione a opção Alternar marcações/barra de ferramentas () no canto superior do menu principal. Isso abrirá um menu secundário logo abaixo do menu principal. Localize o botão criar nova linha ().
   3. Depois de clicar no botão criar nova linha , navegue até a reconstrução 3D e identifique o osso a ser medido.
      NOTA: Os ossos recomendados são a tíbia ou o fêmur²².
   4. Assim que o osso for identificado, clique com o botão esquerdo em uma extremidade do osso e novamente na outra extremidade do tecido. Esta ação permite que o software calcule o tamanho do osso.
      NOTA: Para medições consistentes, selecione a mesma região anatômica do osso para cada animal. Por exemplo, a cabeça femoral é usada como uma extremidade e o côndilo lateral como a outra extremidade do fêmur.
7. Análise e normalização dos dados
   NOTA: Os dados de massa podem ser obtidos conforme explicado na seção 3.5 e usados como estão. Alternativamente, a massa magra, gorda e óssea pode ser normalizada de duas maneiras.
   1. Calcule a relação entre a massa tecidual e o peso do animal no dia em que as imagens são obtidas.
      Normalização para peso: Massa_magra ÷ Peso corporal
   2. Calcule a relação entre massa e tamanho ósseo (por exemplo, fêmur ou tíbia).
      Normalização para o fêmur: Massa_magra ÷ Tamanho_{do fêmur}
      Normalização para tíbia: Massa_magra ÷ Tamanho_tíbia
      NOTA: Os parâmetros de normalização são escolhidos com base na pergunta experimental. Se forem esperadas alterações no tamanho ósseo (por exemplo: ao comparar a remodelação óssea), sugere-se a normalização pelo peso corporal (item 3.7.1). Além disso, se mudanças no peso corporal forem esperadas em sua pergunta experimental, o tamanho do osso longo é o parâmetro de normalização sugerido (item 3.7.2).

Resultados

O posicionamento anatômico adequado do animal sedado na mesa de imagem garante resultados de varredura consistentes e reprodutíveis, destacando a eficácia da aquisição de dados na obtenção de resultados confiáveis. A sedação adequada dos animais durante a imagem, incluindo sistemas especializados de liberação de gás e vaporizadores, é fundamental para avaliações anatômicas precisas (Figura 1).

Discussão

A avaliação por meio da tomografia é um método eficaz e não invasivo para a obtenção de informações detalhadas sobre a composição corporal. A micro-CT, em particular, oferece medidas de resultados valiosas para estudos pré-clínicos. No campo ósseo, a micro-TC tem diferentes usos, pois a análise da microarquitetura²³ e da remodelação óssea²⁴ são particularmente interessantes. A avaliação da morfologia da estrutura bioló...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3DSlicer, version 5.6.2	3D Slicer platform		A free and open-source software for image analysis and scientific visualization.
Amide, version 1.0.1	Amide platform		A free and open-source software used for correcting the Hounsfield Unit values in the processed DICOM images.
Amira, version 4.1	Thermo Fisher Scientific		Used to extract air and water Hounsfield Unit values from the phantom's raw data and to convert images into DICOM files.
Isoforine	Cristália		Isoflurane is a non-flammable liquid anesthetic agent for use in general inhalation anesthesia by vaporization.
Triumph XO subsystem	Gamma Medica-Ideas Flex		Advanced imaging subsystem designed for preclinical small animal imaging, offering high-resolution CT and PET capabilities for quantitative and qualitative analysis.