Quantification non invasive des muscles squelettiques chez les petits animaux à l’aide de la micro-tomodensitométrie

Résumé

Ce protocole utilise la micro-tomodensitométrie pour permettre la quantification rentable de la masse maigre, y compris les muscles squelettiques et les tissus viscéraux, le tissu adipeux et le tissu squelettique chez les petits animaux. Il distingue le tissu maigre du tissu adipeux, ce qui offre des avantages significatifs pour la recherche biomédicale, notamment dans la recherche translationnelle chez les petits animaux.

Résumé

La taille, la masse et la composition des muscles squelettiques sont des propriétés essentielles pour l’étude des maladies métaboliques et musculaires, car elles ont un impact direct sur la compréhension de la progression de la maladie et les résultats du traitement. La quantification de la masse maigre, adipeuse et squelettique d’un animal vivant est importante dans les études métaboliques, physiologiques, pharmacologiques et géroscientifiques. Cependant, l’obtention de mesures précises de la composition corporelle, en particulier de la masse maigre, reste difficile en raison des limites inhérentes aux techniques d’évaluation conventionnelles. La micro-tomodensitométrie (micro-TDM) est une technique radiologique non invasive qui permet de visualiser à haute résolution les structures internes dans des modèles de petits animaux. Une méthode de micro-TDM standardisée peut améliorer considérablement la recherche translationnelle avec des résultats plus fiables et plus percutants, en particulier lors d’études de vieillissement ou à différents moments au sein d’un même animal. Malgré son potentiel, le manque de normalisation dans les méthodes d’acquisition et d’analyse d’images entrave considérablement la comparabilité des résultats entre différentes études. Nous présentons ici un protocole complet et détaillé à faible coût pour l’analyse de la masse maigre à l’aide de la micro-tomodensitométrie afin de relever ces défis et de promouvoir la cohérence de la recherche impliquant de petits modèles animaux.

Introduction

La taille, la masse et la composition sont des propriétés musculaires squelettiques cruciales pour l’étude des mécanismes liés aux maladies musculaires et métaboliques¹. La sarcopénie, la cachexie, l’atrophie et les myopathies partagent des phénotypes communs : réduction de la masse, altération de la composition et altération de la fonction musculaire 2,3,4,5. Cependant, la quantification de la composition corporelle d’un animal vivant reste très complexe et techniquement difficile⁶.

Les principales méthodologies pour l’imagerie in vivo et l’analyse de la composition corporelle sont l’absorptiométrie à rayons X à double énergie (DXA), la tomodensitométrie (TDM) et l’imagerie par résonance magnétique (IRM). Ces méthodes sont principalement utilisées pour dépister et surveiller les maladies qui conduisent à une réduction de la masse maigre 7,8,9,10,11. Le DXA est la référence en matière d’analyse de la composition corporelle en raison de son faible coût. Cependant, le DXA présente un inconvénient significatif par rapport à l’IRM et à la TDM : son incapacité à résoudre spatialement le tissu musculaire et adipeux¹.

L’IRM utilise des champs magnétiques puissants et des ondes radio pour générer des images détaillées des structures internes du corps¹². L’un de ses principaux avantages par rapport à la TDM est sa résolution de contraste supérieure, permettant une excellente différenciation entre les différents types de tissus mous ^1,13,14. Contrairement à la TDM, l’IRM n’utilise pas de rayonnements ionisants, ce qui la rend plus sûre pour une utilisation répétée^15,16. Cependant, l’IRM est plus coûteuse et moins accessible, avec des temps d’examen plus longs et des coûts de maintenance plus élevés^13,17. Par conséquent, il n’existe généralement pas d’instruments d’IRM adaptés à l’analyse des petits animaux.

La micro-TDM est similaire à la TDM conventionnelle, mais adaptée aux petites structures et à la recherche biomédicale¹⁸. La micro-tomodensitométrie est une technique d’évaluation radiologique avancée et non invasive qui permet une visualisation détaillée des structures internes dans des modèles de petits animaux. La micro-tomodensitométrie utilise les rayons X pour créer des images détaillées des structures internes du corps, en s’appuyant sur l’atténuation différentielle des rayons X par divers types de tissus. Lors d’un micro-tomodensitométrie, la souris est posée sur une table qui se déplace lentement à travers un portique circulaire. À l’intérieur du portique, un tube à rayons X tourne autour de la souris, émettant des rayons X sous différents angles. Les détecteurs situés du côté opposé capturent ces rayons X après leur passage dans le corps¹⁸.

Le logiciel du scanner micro-CT traite les données de ces multiples angles pour reconstruire des images en coupe transversale bidimensionnelle (tranches) du corps. Grâce à la reconstruction, ces tranches peuvent être combinées pour représenter l’anatomie interne de manière exhaustive¹⁹. Les images produites par les micro-tomodensitogrammes sont basées sur les différents degrés d’atténuation des rayons X par différents tissus du corps. Cette atténuation est quantifiée à l’aide des unités de Hounsfield (HU), une échelle qui normalise la radiodensité^20,21. L’échelle HU est fondamentale pour la segmentation, car chaque structure a une valeur légèrement différente.

Dans le présent article, nous avons utilisé les valeurs HU pour différencier avec précision l’os, le tissu maigre et le tissu adipeux¹. En référençant les plages d’HU établies, nous avons assuré une analyse et une comparaison précises de la composition corporelle. Dans cet article, nous montrons comment acquérir des images à l’aide de la micro-tomodensitométrie et son application dans la visualisation et la quantification de la masse maigre, grasse et squelettique.

Protocole

Toutes les méthodes ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Rio de Janeiro (IACUC - UFRJ ; A16/23-025-20). Les scanners ont été effectués sur des souris C57BL/6 mâles âgées de 6 et 22 mois.

1. Préparation des animaux

1. Anesthésie les souris à l’aide de 2 % d’isoflurane dans un mélange d’oxygène délivré par vaporisation. Utilisez un vaporisateur de précision pour l’induction et l’entretien avec un mélange de 100 % d’oxygène à l’aide d’un vaporisateur de précision.
2. Positionnez l’animal anesthésié en décubitus dorsal sur le balayage micro-CT à l’aide d’un lit de souris. Fixez la souris avec du ruban adhésif pour minimiser les mouvements pendant le balayage, puis insérez-la dans le portique.
3. Tout au long de l’expérience, qui dure environ 10 min, assurez-vous que l’animal porte un masque pour le maintenir sous le plan anesthésique tout en recevant la dose d’entretien au besoin.

2. Acquisition et reconstruction d’images

1. Acquérez des micro-tomodensitogrammes corporels à l’aide d’un système d’imagerie préclinique à haute résolution. Capturez un total de 1 024 projections avec un temps d’exposition de 470 ms chacune, en utilisant une rotation en mode vol à une tension de 60 kV et un courant de 480 μA. Réglez le système sur un grossissement de 1,25, ce qui permet d’obtenir un champ de vision (FOV) de 94,72 mm pour un temps d’acquisition total de 8,02 min. Capturez des images avec un binning de 1 x 1, ce qui donne une résolution de 2 368 x 2 240 pixels.
   REMARQUE : L’équipement utilisé dans ce manuscrit pour les images micro-CT présente des limites dans l’obtention d’images de la tête en raison du chevauchement avec le masque anesthésique. De plus, toute la longueur de la queue n’est pas capturée. Par conséquent, nous avons exclu l’analyse tête et queue (voir section 3).
2. Effectuez un balayage avec les mêmes paramètres sur un fantôme cylindrique en acrylique (diamètre : 2,5 cm, longueur : 11,5 cm) à moitié rempli d’eau distillée pour déterminer l’HU pour l’air et l’eau. Une fois les acquisitions terminées, reconstruisez les images à l’aide du logiciel d’acquisition avec des paramètres optimisés pour la réduction du bruit et l’algorithme de rétroprojection filtrée (FBP). Reconstruisez par lots des images d’animaux et de fantômes à l’aide d’une taille de voxel isotrope de 147 μm et d’une matrice de 640.
3. Extraire l’air et l’eau HU du fantôme (données brutes) à l’aide du logiciel référencé. Convertissez les images en fichiers DICOM et corrigez les valeurs HU.

3. Analyse d’images

1. Téléchargement d’un fichier
   REMARQUE : La micro-tomodensitométrie est une technique qui permet de capturer des images dans le temps et dans l’espace, générant ainsi une séquence d’images. Par conséquent, il est nécessaire d’ouvrir l’ensemble du dossier plutôt qu’une seule image.
   1. Dans la zone supérieure gauche de l’interface, recherchez le menu Slicer 3D , mis en évidence dans une couleur bleu grisâtre. Cliquez sur Ajouter des données ().
   2. Lorsqu’une fenêtre avec deux options s’affiche, sélectionnez la première option : Choisissez Répertoire à ajouter.
   3. Naviguez jusqu’au dossier contenant la série d’images DICOM de l’animal cible et cliquez dessus. Cette action ouvrira le dossier dans le logiciel, permettant à toutes les images d’être visualisées simultanément.
   4. Observez les images affichées sur trois écrans. Chaque écran représente un plan anatomique différent : coronal, sagittal et transversal, identifié par les couleurs vert, jaune et rouge, respectivement.
2. Segmentation
   1. Localisez l’éditeur de segments () dans l’onglet supérieur (Modules) et cliquez dessus.
   2. Cliquez sur le bouton vert + Ajouter pour créer des segments, définissant la plage HU.
   3. Créez des segments pour l’os, le tissu maigre et le tissu adipeux en cliquant 3x chacun.
   4. Double-cliquez sur chaque segment pour le nommer et le colorer selon les paramètres souhaités.
   5. Définissez la plage HU pour chaque segment à l’aide de la fonction Seuil, située sur le côté gauche de la fenêtre. Pour ce faire, recherchez la fonction Plage de seuil et entrez les valeurs HU pour chaque type de tissu : tissu maigre (-29 à 225 HU), tissu adipeux (-190 à -30 HU), os (500 à 5 000 HU). Cliquez sur le bouton Appliquer.
      REMARQUE : Reportez-vous à la figure supplémentaire S1 pour les comparaisons des valeurs HU.
   6. Répétez le processus de segmentation pour chaque type de tissu.
   7. Cliquez sur Afficher la 3D pour générer un rendu 3D.
      REMARQUE : Le rendu apparaîtra dans le quadrant bleu de l’écran.
3. Nettoyage de l’image
   REMARQUE : Après la segmentation et le rendu 3D, les éléments superflus doivent être exclus pour s’assurer qu’ils ne sont pas inclus dans les mesures volumétriques du tissu maigre, du tissu adipeux et de l’os. L’élimination de ces artefacts est essentielle pour garantir une analyse précise.
   1. Localisez l’outil « Ciseaux » () dans le menu Segmentation .
   2. Choisissez soit le plan anatomique, soit le rendu 3D pour une vue plus claire de l’objet à supprimer.
      1. Si vous utilisez un plan anatomique, cliquez sur le bouton d’agrandissement de la vue () sur la barre colorée du plan. À l’intérieur de la fenêtre du plan anatomique, utilisez le bouton de défilement de la souris pour naviguer vers l’avant ou vers l’arrière dans la tomodensitométrie.
         REMARQUE : Chaque fenêtre peut défiler indépendamment.
      2. Pour le rendu 3D, utilisez le bouton gauche de la souris pour pivoter le long de n’importe quel axe et le bouton droit de la souris pour zoomer.
         REMARQUE : Les touches fléchées du clavier peuvent également faire pivoter l’image.
   3. Avec l’outil Ciseaux sélectionné, mettez en surbrillance la segmentation autour de l’objet indésirable et encerclez-le pour le supprimer de l’image. Le logiciel supprime automatiquement l’objet.
      REMARQUE : Assurez-vous que l’opération Effacer à l’intérieur est sélectionnée. Si l’équipement utilisé génère des images pour une image non biologique, telle que la bille, l’anesthésique ou l’équipement chirurgical, il est important de le retirer. De plus, si une zone anatomique n’est pas entièrement obtenue, il est fondamental d’établir une référence anatomique pour éliminer ces zones qui ne sont pas entièrement obtenues afin d’assurer la répétabilité entre les expériences. Les objets indésirables doivent être éliminés dans chaque plan.
   4. Cliquez sur l’icône de restauration de la disposition de la vue () pour revenir à l’écran avec les quatre fenêtres, quelle que soit la fenêtre sélectionnée.
   5. Répétez le processus pour toutes les fenêtres où l’objet doit être retiré.
4. Volume de segmentation
   1. Après la segmentation, quantifiez les volumes des segments à l’aide de la fonction de quantification disponible dans le menu déroulant.
      REMARQUE : Toutes les segmentations doivent être visibles pour cette action.
   2. Accéder à Quantification | Statistiques sectorielles. Cliquez sur Appliquer, et attendez que le logiciel génère un tableau affichant les valeurs pour chaque segmentation. Le logiciel fournit deux valeurs de volume pour chaque segmentation : Labelmap (LM) et Closed Surface (CS).
      REMARQUE : La valeur LM convient généralement au calcul des volumes de segments, en utilisant le nombre de voxels multiplié par le volume d’un seul voxel. CS Value utilise un modèle de surface lissée et intègre le volume basé sur des éléments de surface triangulaires. Le CS s’aligne plus étroitement avec les contours anatomiques et est recommandé pour des mesures précises.
   3. Pour télécharger les données d’un nouvel animal, enregistrez et fermez la scène dans le menu Fichier .
5. Analyse de la composition corporelle
   1. Utilisez les mesures de volume fournies par le logiciel en cm³ pour convertir ces volumes en masse tissulaire et appliquer la densité appropriée pour chaque type de tissu. Utilisez les densités tissulaires suivantes spécifiées par la Commission internationale des unités et mesures de rayonnement²² : 0,95 g/cm³ (tissu adipeux), 1,05 g/cm³ (tissu maigre) et 1,92 g/cm³ (tissu squelettique)².
      1. Pour calculer la masse tissulaire, multipliez le volume (cm³) obtenu à partir du logiciel par la densité tissulaire respective (g/cm³) :
         Masse de tissu adipeux :_Segmentation du volume X 0,95 = Masse_adipeuse
         Masse tissulaire maigre :_Segmentation du volume X 1,05 = Masse_maigre
         Masse tissulaire squelettique :_Segmentation volumique X 1,92 = Masse_squelettique
         Masse totale : Masse_adipeuse + Masse_maigre + Masse_squelettique = Masse_totale
6. Mesure de la longueur des os
   REMARQUE : Pour corriger la masse tissulaire en fonction de la longueur de l’os pour certaines analyses, il est nécessaire d’obtenir des longueurs osseuses spécifiques.
   1. Revenez au menu Éditeur de segments . Cachez les segmentations du tissu adipeux et du tissu maigre en cliquant sur l’icône de l’œil () à côté de chaque segment.
      REMARQUE : Seule la segmentation correspondant au tissu squelettique doit rester visible.
   2. Sélectionnez l’option Activer/désactiver les annotations/barre d’outils () dans le coin supérieur du menu principal. Cela ouvrira un menu secondaire juste en dessous du menu principal. Localisez le bouton Créer une nouvelle ligne ().
   3. Après avoir cliqué sur le bouton Créer une nouvelle ligne , naviguez jusqu’à la reconstruction 3D et identifiez l’os à mesurer.
      REMARQUE : Les os recommandés sont le tibia ou le fémur²².
   4. Une fois l’os identifié, faites un clic gauche sur une extrémité de l’os et à nouveau sur l’autre extrémité du tissu. Cette action permet au logiciel de calculer la taille de l’os.
      REMARQUE : Pour des mesures cohérentes, sélectionnez la même région anatomique de l’os pour chaque animal. Par exemple, la tête fémorale est utilisée comme une extrémité et le condyle latéral comme l’autre extrémité du fémur.
7. Analyse et normalisation des données
   REMARQUE : Les données de masse peuvent être obtenues comme expliqué au point 3.5 et utilisées telles quelles. Alternativement, la masse maigre, grasse et osseuse peuvent être normalisées de deux manières.
   1. Calculez le rapport entre la masse tissulaire et le poids de l’animal le jour de l’obtention des images.
      Normalisation au poids : masse_maigre ÷ poids corporel
   2. Calculez le rapport entre la masse et la taille de l’os (par exemple, le fémur ou le tibia).
      Normalisation au fémur : masse_maigre ÷ Taille_{du fémur}
      Normalisation du tibia : masse_maigre ÷ taille_{du tibia}
      REMARQUE : Les paramètres de normalisation sont choisis en fonction de la question expérimentale. Si des changements dans la taille de l’os sont attendus (par exemple, lors de la comparaison du remodelage osseux), la normalisation en fonction du poids corporel est suggérée (point 3.7.1). De plus, si des changements dans le poids corporel sont attendus dans votre question expérimentale, la taille des os longs est le paramètre de normalisation suggéré (point 3.7.2).

Résultats

Le positionnement anatomique correct de l’animal sous sédatif sur la table d’imagerie garantit des résultats de balayage cohérents et reproductibles, mettant en évidence l’efficacité de l’acquisition de données pour obtenir des résultats fiables. Une sédation animale appropriée tout au long de l’imagerie, y compris les systèmes d’administration de gaz spécialisés et les vaporisateurs, est fondamentale pour des évaluations anatomiques précises (

Discussion

L’évaluation par tomographie est une méthode efficace et non invasive pour obtenir des informations détaillées sur la composition corporelle. La micro-tomodensitométrie, en particulier, offre des mesures de résultats précieuses pour les études précliniques. Dans le domaine osseux, la micro-TDM a différentes utilisations, car l’analyse de la micro-architecture²³ et le remodelage osseux²⁴ sont particulièrement intéressants. L?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3DSlicer, version 5.6.2	3D Slicer platform		A free and open-source software for image analysis and scientific visualization.
Amide, version 1.0.1	Amide platform		A free and open-source software used for correcting the Hounsfield Unit values in the processed DICOM images.
Amira, version 4.1	Thermo Fisher Scientific		Used to extract air and water Hounsfield Unit values from the phantom's raw data and to convert images into DICOM files.
Isoforine	Cristália		Isoflurane is a non-flammable liquid anesthetic agent for use in general inhalation anesthesia by vaporization.
Triumph XO subsystem	Gamma Medica-Ideas Flex		Advanced imaging subsystem designed for preclinical small animal imaging, offering high-resolution CT and PET capabilities for quantitative and qualitative analysis.