سير عمل سريع وبسيط للقياس الكمي لهياكل ذبابة الفاكهة الخارجية للبالغين

Laura Martins; Ramy Wong; Fredrick J. Larabee; Bree K. Grillo-Hill

doi:10.3791/67485

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

هنا ، نقدم سير عمل سريع ومنخفض التكلفة للتصوير عالي الدقة لعيون ذبابة الفاكهة البالغة لتحديد عيوب الزخرفة والنمو. نصف بروتوكولنا لإعداد العينة عن طريق تركيب النقاط والحصول على الصور عالية الدقة وتحليل الصور.

Abstract

ذبابة الفاكهة العين المركبة هي نسيج منقوش بدقة كشف عن الآليات الجزيئية والعمليات البيولوجية التي تدفع التشكل. إنه هيكل بسيط لعيون الوحدة المتكررة ، والتي تسمى ommatidia ، والتي تستخدم لتوصيف التفاعلات الجينية ووظائف الجينات. يمكن اكتشاف الطفرات التي تؤثر على بنية العين وتحليلها بسهولة. ومن ثم، كثيرا ما يستخدم هذا النظام في المؤسسات التي تعاني من نقص الموارد. غالبا ما يتضمن المزيد من التحليل الظاهري المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لتوليد صور عالية التكبير مناسبة للتحليل الكمي. ومع ذلك ، فإن SEMs باهظة الثمن وتتطلب كواشف مكلفة. يمتد تحضير العينة لأيام ؛ وغالبا ما يحتاجون إلى موظفين بدوام كامل لإعداد العينات وصيانة الأدوات. وهذا يحد من فائدتها في المؤسسات التي تعاني من نقص الموارد أو أثناء التقشف في الميزانية. في علم الحشرات ، يعد استخدام تقنية التصوير الرقمي عالي الدقة ممارسة شائعة لتحديد الأنواع وتوصيفها. تصف هذه الورقة طريقة تجمع بين الاستراتيجيات وتسمح بالتصوير الرقمي عالي الدقة لهياكل ذبابة الفاكهة البالغة والتحليل الكمي باستخدام البرنامج المفتوح ImageJ. يعد سير العمل بديلا سريعا وصديقا للطلاب يعالج قيود المرافق البحثية التي تعاني من نقص التمويل ونقص الموارد من خلال نهج فعال من حيث التكلفة وسريع لتحليل النمط الظاهري الكمي.

Introduction

ذبابة الفاكهة السوداء هو كائن حي نموذجي وراثي قوي تم استخدامه لعقود لتوضيح مسارات الإشارات الجزيئية والسلوكيات الخلوية. تم تحديد العديد من مسارات الإشارات المحفوظة تطوريا والتي تعتبر ضرورية للتطور متعدد الخلايا لأول مرة وتحديد آلية عملها في ذبابة الفاكهة. حوالي 65-75٪ من جميع الجينات المرتبطة بالأمراض البشرية لديها أخصائيي تقويم العظام في ذبابة الفاكهة¹^،². ذبابة الفاكهة البالغة العين هي نموذج مهم سمح بفحوصات جينية غير متحيزة سهلت اكتشاف الجينات المحفوظة المهمة المتورطة في الأمراض البشرية ، بما في ذلك السرطان³^،⁴ ، والتنكس العصبي⁵ ، واضطرابات التمثيل الغذائي⁶.

تتكون عين ذبابة الفاكهة من ~ 800 وحدة عيون ، تسمى ommatidia ، والتي يتم تنظيمها بدقة في نمط سداسي عبر سطح العين البالغة⁷. يتكون كل أوماتيدييوم من ثمانية خلايا عصبية مستقبلة للضوء تحتل موقعا مميزا داخل شبه منحرف غير متماثل. يتم دعمها بواسطة أربع خلايا مخروطية غير عصبية وخليتين صبغيتين أساسيتين تفرزان العدسة والمخروط الزائف لتركيز الضوء على المخططات المستشعرة للضوء للخلايا العصبية المستقبلة للضوء. يتم فصل ommatidia المجاورة بصف واحد من الخلايا الشبكية interommatidial ، والتي تتكون من خلايا صبغية ثانوية ، وخلايا صبغية ثلاثية ، ومجمعات شعيرات حسية ميكانيكية⁸^،⁹^،¹⁰.

تظهر الاضطرابات في نمو العين في عيون البالغين على شكل زيادة أو نقصان حجم العين ، أو وفرة أو بنية غير طبيعية للعدسات أو الشعيرات ، أو "العين الخشنة" حيث يتعطل الزخرفة السداسية الثابتة عادة بحيث لا يمكن متابعة صف من ommatidia عبر سطح العين. يمكن تسجيل هذه الأنماط الظاهرية على مستوى الأنسجة الإجمالية باستخدام مجاهر التشريح. يتضمن التحليل التفصيلي للأنماط الظاهرية تقليديا الفحص المجهري الإلكتروني المتبوعا بالتحليل الكمي للصور¹¹. ومع ذلك ، فإن الفحص المجهري الإلكتروني المسح يتطلب أجهزة باهظة الثمن ، وكواشف مكلفة ، وإعداد عينات تمتد لأيام ، وغالبا ما يكون موظفا بدوام كامل للحفاظ عليه.

figure-introduction-2257
الشكل 1: سير العمل لتصوير هياكل ذبابة الفاكهة البالغة. (أ) جمع ذبابة الفاكهة البالغة وإصلاحها في 70٪ من الإيثانول. (ب) إعداد عينات للتصوير عن طريق التركيب النقطي وتثبيته على المسامير. (ج) الحصول على صور عالية الدقة من خلال تكديس التركيز البؤري والتكامل. (د) تحديد الصور كميا باستخدام الفيجي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تقدم هذه الورقة سير عمل غير مكلف نسبيا ، وله وقت قصير لإعداد العينة ، ويمكن إعداده بسهولة على مقعد مختبر بطول 3 أقدام ، ولا يتطلب مواد خطرة ، ويمكن أن يكون إضافة طويلة العمر لمختبرات أبحاث ذبابة الفاكهة (الشكل 1). التثبيت النقطي هو تقنية حشرية تستخدم لتجفيف الحشرات الصغيرة الرخوة في الهواء والحفاظ عليها ، مثل ذبابة الفاكهة¹². تعتمد هذه الطريقة على الجمع بين أهداف المجهر وكاميرات DSLR عالية الدقة لتكبير فعال من 10x إلى 1,000x. يتم التغلب على العمق المحدود للمجال المتأصل في التصوير الفوتوغرافي عن طريق تكديس التركيز: تجميع سلسلة من الصور معا مع تحرك المستوى البؤري عبر العينة ذات الأهمية¹³. تنتج هذه الطريقة صورا عالية الدقة مناسبة لقياس الأنماط الظاهرية ويمكن تكييفها بسهولة مع الهياكل الأخرى ذات الأهمية ، مثل الجناح والساق والصدر والبطن. يستخدم سير عمل تحليل الصور برنامج تحليل الصور المجاني FIJI (NIH ImageJ). تجعل هذه المنهجية إعداد العينات والتصوير عالي الدقة والتحليل في متناول الطلاب الجامعيين والعلماء في المؤسسات التي تعاني من نقص الموارد.

Protocol

1. جمع ذبابة الفاكهة البالغة وتثبيتها

قم بإعداد صلبان ذبابة الفاكهة أو سلالات مختارة وضعها في قوارير تحتوي على طعام الذباب. احتضان القوارير عند درجة الحرارة المطلوبة (عادة 25 درجة مئوية) حتى يتطور الذباب ويحيط البالغون (~ 10-14 يوما عند 25 درجة مئوية).
قم بتخدير الذباب ب CO₂ وضعه على وسادة ثاني أكسيد الكربون₂ .
قم بفرز الذباب بالريشة وحدد الأفراد الذين لديهم النمط الظاهري المطلوب (على سبيل المثال ، الأجنحة المستقيمة). اصنع فارز ذبابة الريش عن طريق تقليم ريشة الإوزة لتناسب الطرف المدبب لماصة مصلية سعة 1 مل.
قم بإعداد أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مل مع 1 مل من 70٪ إيثانول. ضع الذباب المحدد في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وضعه على الثلج. قم بتخزين أنابيب الطرد المركزي الدقيقة عند 4 درجات مئوية طوال الليل (الشكل 2 أ).
ملاحظة: لا تحافظ على الذباب في الإيثانول لأكثر من 24 ساعة. سيؤدي التخزين طويل الأمد للذباب في 70٪ من الإيثانول إلى فقدان صبغة العين والجسم.

2. تحضير العينة عن طريق تركيب النقطة

ملاحظة: ذبابة الفاكهة هي حشرات ناعمة الجسم تصبح هشة وتنهار عند تجفيفها بالهواء. لذلك، يتطلب هذا البروتوكول تصوير العينات في نفس اليوم الذي يتم تركيبها فيه. اعمل في مجموعات صغيرة من ~ 5 ذباب في وقت واحد لمنع فقدان العينة. زيادة عدد العينات في مجموعة بناء على الكفاءة. يمكن تجفيف العينات التي تتطلب مزيدا من الوقت قبل التصوير من خلال سلسلة تركيز متزايدة من سداسي ميثيل ديسيلازان (HMDS)¹⁴.

قم بقص النقاط المثلثة الصغيرة (7.1 مم × 2.7 مم) من البطاقات الأرشيفية التي يبلغ وزنها 65 رطلا باستخدام لكمة نقطية متخصصة. قم بإعداد النقاط عن طريق ثني الطرف (أضيق 25٪) بزاوية 90 درجة باستخدام ملقط Dumont # 5 ذو الطرف الدقيق (الشكل 2 ب).
باستخدام ملقط Dumont # 5 ذو الطرف الدقيق ، قم بإزالة الذباب من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (الخطوة 1.4). امسح الذباب برفق بأنسجة مختبر خالية من النسالة لإزالة الإيثانول الزائد. ضع كل ذبابة على جانبها الأيسر على بطاقة فهرسة تحت مجهر تشريح.
ملاحظة: قم بإزالة الذباب من الأنبوب عن طريق التمسك بهيكل تشريحي ليس منطقة الاهتمام - عند تصوير الرأس ، نحتفظ بعينات من الجناح أو الساق. لا تمسك عينات من البطن ، حيث يتم استخدام هذا الهيكل للصق الذبابة على نقطة البطاقة.
تحضير الغراء المخفي ، وضبط اتساقه على اللزوجة المطلوبة. امزج 1-2 قطرات من غراء الجلد مع 1-2 قطرات من الماء منزوع الأيونات (DI) ، واخلطها مع ماصة نقل على بطاقة فهرسة. التقط نقطة بطاقة معدة في الطرف العريض باستخدام ملقط ، وضع كمية صغيرة من الغراء المخفف على الطرف المنحني للنقطة عن طريق وضعها في مزيج الغراء والماء (الشكل 2 ج).
ملاحظة: يجب أن يكون الغراء قابلا للدهن ولكن ليس سائلا.
ضع الطرف المنحني للنقطة على الجانب الأمامي من البطن الأيمن حول أجزاء البطن 2-3 (الشكل 2 ج). قبل أن يجف الغراء ، قم بإجراء تعديلات طفيفة على الذبابة بحيث يكون المحور الأمامي الخلفي للذبابة عموديا على الطرف المنحني للنقطة.
أدخل دبوس التثبيت رقم 3 في الطرف العريض لنقطة البطاقة (الشكل 2 د) وثبته في كتلة تثبيت الحشرات (الشكل 2 ه). قم بتسمية كل دبوس أو صف من المسامير بالنمط الجيني المقابل.

figure-protocol-3340
الشكل 2: تحضير العينة. (أ) ذبابة الفاكهة البالغة يتم فرز بناء على علامات النمط الظاهري ويتم جمعها في أنابيب طرد مركزي دقيقة مصنفة تحتوي على 70٪ من الإيثانول على الجليد. يتم تخزين الذباب عند 4 درجات مئوية طوال الليل. (ب) يتم تحضير نقاط البطاقة الورقية عن طريق ثني الطرف الضيق بزاوية 90 درجة من باقي البطاقة باستخدام زوج من الملقط # 5. (ج) يتم استرداد الذباب من الأنابيب والسماح له بالجفاف في الهواء لفترة وجيزة. يتم تطبيق إخفاء الغراء على الطرف الصغير المطوي لنقطة البطاقة المعدة ويتم لصقه على الذبابة البالغة في أجزاء البطن 2-3. (د) يتم تثبيت العينات ، مع ملصق تعريف ، على دبوس حشرات من الفولاذ المقاوم للصدأ # 3. (ه) يتم تخزين العينات المثبتة على لوحة عينة حتى تصبح جاهزة للحصول على الصور. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. اكتساب تصوير تكديس التركيز عالي الدقة

احصل على صور عالية الدقة لعيون الذبابة باستخدام نظام تصوير تكديس التركيز البؤري المجمع والمخصص الذي تم تجميعه وتخصيصه.
1. التقط الصور الفوتوغرافية باستخدام هيكل كاميرا DSLR باستخدام عدسة تليفوتوغرافي مقاس 70-200 مم متصلة بهدف مجهر Apo 20x عبر محول عدسة مقاس 77 مم.
2. تأكد من إضاءة العينة بفلاش من خلال موزع (الشكل 3).
3. تحكم في تحديد موضع Z باستخدام وحدة تحكم Stackshot وسكة ماكرو.
4. قم بتوصيل الكاميرا والفلاش والمرحلة الآلية بحامل ثلاثي القوائم من الألومنيوم المؤكسد شديد التحمل.
ضع كل عينة مثبتة على نقطة على محور مسرح عالمي مع توجيه الرأس بحيث تكون العين متجهة نحو العدسة. قم بإجراء تعديلات على وضع الرأس عن طريق تحريك الرأس برفق باستخدام الملقط.
تنبيه: يمكن أن تؤدي التعديلات الكبيرة والسريعة إلى قطع الرأس عن طريق الخطأ.
مع ربط الكاميرا بجهاز كمبيوتر محمول ، اضبط إعدادات الاكتساب في البرنامج. صور العينات بتكبير 20x باستخدام الإعدادات التالية: قوة الفلاش 1/32 وسرعة الغالق 1/200 وفتحة العدسة F2.8 وISO 400. تأكد من إيقاف تشغيل أي من ميزات التركيز البؤري التلقائي وتثبيت الصورة.
ملاحظة: توازن هذه الإعدادات بين إضاءة الفلاش المثلى وسرعة الغالق وعمق المجال. ستحتاج إلى تعديلها للتكبيرات الأخرى و / أو مجموعات العدسات.
قم بتعيين موقع حفظ مكدس الصور الناتج (10-50 صورة) في مجلد الملفات المطلوب. تأكد من سعة تخزين كافية للصور (~ 8.5 ميجابايت لكل صورة).
اضبط إعدادات مكدس التركيز البؤري على وحدة التحكم Stackshot في وضع المسافة التلقائية .
1. اضبط حجم الخطوة على 5 ميكرومتر واحسب عدد الخطوات عن طريق تعيين موضعي البدء والإيقاف لمكدس التركيز البؤري.
2. اعرض العينة في وضع LiveView ومع الكاميرا في وضع التصوير التلقائي لتحديد مواضع البدء والإيقاف.
3. حرك السكة بحيث يكون أقرب جزء من العينة في بؤرة التركيز (تعيين موضع البدء ) ، ثم انتقل إلى حيث تكون أبعد ميزة محل الاهتمام في التركيز (تعيين موضع النهاية ).
أعد الكاميرا إلى وضع التصوير اليدوي وابدأ الحصول على الصورة من وحدة التحكم Stackshot.
ملاحظة: يعتمد وقت الحصول على الصورة على حجم العينة. كلما زاد عمق المجال اللازم للعينات الكبيرة ، تم تضمين المزيد من الشرائح في مكدس الصور ، مما سيطيل وقت الاقتناء الإجمالي.
افتح الملفات في برنامج تكديس التركيز المشار إليه. إنشاء صورة مكدسة بالنقر على مكدس | محاذاة وتكديس الكل (PMax).
احفظ الصورة النهائية على القرص الصلب للكمبيوتر كملف .tif بالنقر فوق ملف | حفظ صورة الإخراج.
ملاحظة: وفقا لدقة ملف الصورة المكدس وعدد العينات المصورة، قد تكون محركات الأقراص الصلبة الخارجية الكبيرة (1 تيرابايت) ضرورية للنسخ الاحتياطي للصور. في هذا البروتوكول ، يبلغ حجم الصور المكدسة حوالي 100 ميجابايت لكل منها قبل ضغطها.

figure-protocol-7493
الشكل 3: الحصول على الصور. (أ) جهاز تصوير بأجزاء تحمل علامة على النحو التالي: أ) جسم كاميرا DSLR؛ ب) عدسة تليفوتوغرافي. ج) هدف ومحول مجهر Apo 20x ؛ د) فلاش؛ ه) ناشرات العدسة والقبة ؛ و) وحدة تحكم Stackshot ، سكة حديد الماكرو ، والمرحلة الدوارة ؛ ز) المرحلة العالمية جيمبال ؛ ح) حامل ثلاثي القوائم. (ب) جهاز تصوير مع موزع ضوء في مكانه. (ج) لقطة مقربة للعينة المركبة في موضعها للتصوير. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. سير عمل تحليل فيجي لحساب منطقة العين البالغة

لتحليل الصور ، احصل على برنامج FIJI¹⁵ من موقع الويب ImageJ.net.
اختر صورا للتحليل حيث تكون العين متمركزة ومحاذاة مع إضاءة كافية والحد الأدنى من الضبابية المحيطية، مما يشير إلى المحاذاة المناسبة مع الكاميرا.
معايرة مقياس الصورة.
1. قم بتنزيل صورة شريط المقياس للتكبير 20x الذي يرتبط ب 500 ميكرومتر. بالتناوب ، في وقت الحصول على الصورة ، قم بتصوير مسطرة باستخدام نفس الإعدادات. افتح الصورة في برنامج FIJI.
2. قم بقياس طول شريط المقياس (الشكل 4 أ). استخدم أداة الخط المستقيم لتتبع الخط بالضبط. انقر فوق تحليل | قياس. مسافة البكسل هذه تعادل 500 ميكرومتر (الشكل 4 ب).
3. احسب وحدات البكسل لكل ميكرون. استخدم هذا لتحويل قياسات البكسل إلى قياسات ميكرومتر.
افتح ملف الصورة المكدسة في فيجي (الشكل 4C).
حدد عدسة مكبرة من شريط الأدوات لتكبير منطقة التركيز. حاول ملء الشاشة بالعين وبشرة الرأس المحيطة مباشرة (الشكل 4 د).
حدد أداة التحديد اليدوي من شريط الأدوات. حدد منطقة الشبكية بأكبر قدر ممكن ، باتباع ملامح الصف الخارجي من ommatidia (الشكل 4E). لإزالة جزء من التحديد، اضغط باستمرار على زر الخيار وحدد وحدات البكسل المراد إزالتها. للإضافة إلى التحديد، اضغط باستمرار على زري الخيار والتبديل وحدد وحدات البكسل المراد إضافتها.
لحساب المساحة، حدد تحليل | قم بالقياس من القائمة العلوية (الشكل 4F). ستظهر نافذة جديدة تحتوي على معلمات المنطقة والمتوسط والحد الأدنى والحد الأقصى . انسخ هذه البيانات والصقها في جدول بيانات للتوثيق والتحويل من قياسات البكسل إلى الميكرومتر.
إجراء التحليلات الإحصائية المناسبة.

figure-protocol-10272
الشكل 4: تحليل الصور في فيجي. (أ) قياس الصورة الأصلية. قم بتنزيل صورة المعايرة وقم بقياس طول شريط 500 ميكرومتر. (ب) اضبط القياس باستخدام وظيفة ضبط المقياس . (ج) افتح الصورة المكدسة. (د) تكبير الصورة بحيث تكون العين في المنتصف وملء الشاشة تقريبا. (ه) استخدم أداة Freehand Select لتحديد العين عند الحد بين الصف الخارجي من ommatidia والبشرة المحيطة. (F) يتم حساب قياس المساحة داخل المنطقة المحددة بالنقر فوق تحليل | قياس | منطقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتائج

ذبابة الفاكهة العين هي نظام نموذجي ممتاز لدراسة زخرفة الأنسجة والتحكم في النمو وموت الخلايا. نشرنا مؤخرا دراسة تبحث في كيفية تأثير الأس الهيدروجيني داخل الخلايا (pHi) على نمو الأنسجة. أولا ، أنشأنا نظاما وراثيا حيث يتسبب الإفراط في التعبير عن مبادل البروتون الصودي?...

Discussion

نصف هنا طريقة لإعداد العينة والتصوير عالي الدقة وتحليل هياكل ذبابة الفاكهة البالغة. ذبابة الفاكهة هي نظام نموذجي قابل للتتبع وراثيا أسفر عن رؤى مهمة حول الآليات الجزيئية الكامنة وراء الأمراض بما في ذلك السرطان¹⁹ والتنكس العصبي²⁰ وأمرا...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا أعضاء مختبر Grillo-Hill pHly على المناقشات والدعم. نشكر تيم أندريس وراندي كيرشنر وكيتي (نجوك هونغ) نجوين وماركو بارنت وجوني شالوب وليبرادو فيليز على الدعم الفني الممتاز. تم دعم هذا العمل من قبل جوائز المعاهد الوطنية للصحة SC3GM132049 و 1R16GM153640 (BKGH) ، وجائزة أبحاث أعضاء هيئة التدريس والطلاب في جامعة CSU للتكنولوجيا الحيوية (LM و BKGH) ، وأموال بدء التشغيل من كلية العلوم وقسم العلوم البيولوجية في جامعة ولاية سان خوسيه (FJL). تنويه خاص إلى بيرند بيكر لسعة حيلتهم ومساعدتهم خلال هذه العملية. نشكر مجتمع BioIcons (https://bioicons.com/) على توفير أيقونات عالية الجودة لشخصياتنا وخاصة Serviere لأيقونة الماصة ، و DBCLS لذبابة الفاكهة ، والملقط ، وأيقونات المجهر الإلكتروني المكتبي المستخدمة في الشكل 1 والشكل 2 ، والتي تم ترخيصها بموجب CC-BY 4.0 Unported. نشكر أيضا مجتمع SciDraw (https://scidraw.io/) على توفير أيقونات عالية الجودة لشخصياتنا ، وخاصة Diogo Losch De Oliveira (doi.org/10.5281/zenodo.3925953) ، المرخصة بموجب ترخيص المشاع الإبداعي 4.0 (CC-BY).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL serological pipette	ThermoFisher Scientific	170353N
1.7 mL microcentrifuge tubes	Genesee Scientific	24-282LR
20x Apo Microscope Objective	Mitutoyo Corp.	378-804-3
Archival 65 lb cardstock	Neenah, Inc.	91901
Canon EF 70-200 mm USM II telephoto lens	Canon	3044C002
Canon EOS 6D Mark II DSLR Camera Body	Canon	1897C002
Diffuser Dome	Macroscopic Solutions	PA-DIF-GIM-SM
Diffuser for Mitutoyo M Plan APO Objectives	Macroscopic Solutions	mitutoyo-diffusers
Drosophila vials and plugs	Genesee Scientific	32-117BF
Dumont #5 fine-tip forceps	Fisher Scientific	NC9889584
Goose feathers	Amazon	B01CMMJI6U
Heavy-Duty Anodized Aluminum Tripod	Really Right Stuff, LLC	TFA-32G
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	lint-free lab tissue
Levenhuk M1000 Plus Digital Camera	Levenhuk	70358
No. 3 mounting pin	Indigo Instruments	33414-3
Nutri-Fly Bloomington Drosophila media	Genesee Scientific	66-113	fly food
Point-Punch	M.C. Mieth Manufacturing, Inc.	448Detail
Screwknob Clamp	Really Right Stuff, LLC	SK-Clamp	For attaching the macro rail to the tripod
Stackshot Controller and Macro Rail	Cognisys Inc.	ST3X_100_BUNDLE
Step-down Ring Adapter	RAF Camera	763461174207	Lens adapter to connect the microscope objective to the camera lens
Titebond Glue	Franklin International	5013
Yongnuo YN-24-EX Macro Twin Lite Flash	Shenzhen Yongnuo Photographic Equipment Co.	YN-24EX
Software
Canon EOS Utility (v. 3.16.1).	Canon		acquisition software
FIJI	National Institutes of Health		Fiji is released as open source under the GNU General Public License. FIJI Version 2.14.0/1.54f
GraphPad Prism	GraphPad Software, Boston, Massachusetts USA		Prism Version 10.3.1
Zerene Stacker (v.1.04)	Zerene Systems, LLC		Focus Stacking Software

References

Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
Hodgson, J. A., Parvy, J. -. P., Yu, Y., Vidal, M., Cordero, J. B. Drosophila larval models of invasive tumorigenesis for in vivo studies on tumour/peripheral host tssue interactions during cancer cachexia. Int J Mol Sci. 22 (15), 8317 (2021).
Lam Wong, K. K., Verheyen, E. M. Metabolic reprogramming in cancer: mechanistic insights from Drosophila. Dis Model Mech. 14 (7), dmm048934 (2021).
Bonini, N. M. A perspective on Drosophila genetics and its insight into human neurodegenerative disease. Front Mol Biosci. 9, e1060796 (2022).
Drummond-Barbosa, D., Tennessen, J. M. Reclaiming Warburg: using developmental biology to gain insight into human metabolic diseases. Development. 147 (11), dev189340 (2020).
Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
Johnson, R. I. Hexagonal patterning of the Drosophila eye. Dev Biol. 478, 173-182 (2021).
Weasner, B. P., Kumar, J. P. The early history of the eye-antennal disc of Drosophila melanogaster. Genetics. 221 (1), iyac041 (2022).
Pichaud, F., Casares, F. Shaping an optical dome: The size and shape of the insect compound eye. Semin Cell Dev Biol. 130, 37-44 (2022).
Oster, I. I., Crang, R. E. Scanning electron microscopy of Drosophila mutant and wild type eyes. Trans Am Microsc Soc. 91 (4), 600-602 (1972).
Gibb, T. J., Oseto, C. . Insect collection and identification: Techniques for the field and laboratory. , (2019).
Mertens, J., Roie, M. V., Merckx, J., Dekoninck, W. The use of low cost compact cameras with focus stacking functionality in entomological digitization projects. ZooKeys. 712, 141-154 (2017).
Brown, B. V. A further chemical alternative to critical-point-drying for preparing small (or large) flies. Fly Times. 11, 10 (1993).
Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Method. 9 (7), 676-682 (2012).
Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression. eLife. 4, e03270 (2015).
White, K. A., Grillo-Hill, B. K., Barber, D. L. Cancer cell behaviors mediated by dysregulated pH dynamics at a glance. J Cell Sci. 130 (4), 663-669 (2017).
Peralta, J., et al. Drosophila Nhe2 overexpression induces autophagic cell death. Mol Biol Cell. 35 (7), br13 (2024).
Munnik, C., Xaba, M. P., Malindisa, S. T., Russell, B. L., Sooklal, S. A. Drosophila melanogaster: A platform for anticancer drug discovery and personalized therapies. Front Genet. 13, 949241 (2022).
Nitta, Y., Sugie, A. Studies of neurodegenerative diseases using Drosophila and the development of novel approaches for their analysis. Fly. 16 (1), 275-298 (2022).
Pletcher, R. C., et al. A genetic screen using the Drosophila melanogaster TRiP RNAi collection to identify metabolic enzymes required for eye development. G3: Genes|Genomes|Genetics. 9 (7), 2061-2070 (2019).
Bangi, E., et al. A personalized platform identifies trametinib plus zoledronate for a patient with KRAS-mutant metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 5 (5), eaav6528 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

SEM ImageJ

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated:

Method Article