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Method Article
Hier stellen wir einen schnellen, kostengünstigen Workflow für die hochauflösende Bildgebung von erwachsenen Drosophila-Augen vor, um Musterbildung und Wachstumsdefekte zu quantifizieren. Wir beschreiben unser Protokoll für die Probenvorbereitung durch Punktmontage, hochauflösende Bildaufnahme und Bildanalyse.
Das Drosophila-Facettenauge ist ein präzise gemustertes Gewebe, das molekulare Mechanismen und biologische Prozesse aufgedeckt hat, die die Morphogenese vorantreiben. Es handelt sich um eine einfache Struktur von sich wiederholenden Einheitsaugen, die als Ommatidien bezeichnet werden und zur Charakterisierung genetischer Interaktionen und Genfunktionen verwendet wird. Mutationen, die die Augenarchitektur beeinflussen, können leicht erkannt und analysiert werden. Daher wird dieses System häufig in unterversorgten Institutionen eingesetzt. Eine weitere phänotypische Analyse umfasst häufig ein Rasterelektronenmikroskop (REM), um Bilder mit hoher Vergrößerung zu erzeugen, die für die quantitative Analyse geeignet sind. REMs sind jedoch teuer und erfordern teure Reagenzien. Die Probenvorbereitung erstreckt sich über Tage; Und oft benötigen sie Vollzeitpersonal für die Probenvorbereitung und die Wartung der Instrumente. Dies schränkt ihren Nutzen bei unterfinanzierten Institutionen oder bei Haushaltskürzungen ein. In der Entomologie ist der Einsatz hochauflösender digitaler Bildgebungstechnologie eine gängige Praxis zur Identifizierung und Charakterisierung von Arten. In diesem Artikel wird eine Methode beschrieben, die Strategien kombiniert und eine hochauflösende digitale Bildgebung von adulten Drosophila-Strukturen und eine quantitative Analyse mit der offenen Software ImageJ ermöglicht. Der Workflow ist eine schnelle und studierendenfreundliche Alternative, die die Einschränkungen unterfinanzierter und unterfinanzierter Forschungseinrichtungen mit einem kostengünstigen und schnellen Ansatz für die quantitative phänotypische Analyse behebt.
Drosophila melanogaster ist ein leistungsfähiger genetischer Modellorganismus, der seit Jahrzehnten zur Aufklärung molekularer Signalwege und zellulärer Verhaltensweisen eingesetzt wird. Viele der evolutionär konservierten Signalwege, die für die multizelluläre Entwicklung essentiell sind, wurden erstmals in Drosophila identifiziert und ihr Wirkmechanismus definiert. Etwa 65-75% aller humanen krankheitsassoziierten Gene haben Orthologe in Drosophila 1,2. Das erwachsene Drosophila-Auge ist ein wichtiges Modell, das unvoreingenommene genetische Screenings ermöglicht hat, die die Entdeckung wichtiger konservierter Gene erleichtern, die an menschlichen Krankheiten beteiligt sind, einschließlich Krebs 3,4, Neurodegeneration5 und Stoffwechselstörungen6.
Das Drosophila-Auge besteht aus ~800 Augeneinheiten, die als Ommatidien bezeichnet werden und präzise in einem sechseckigen Muster über die Oberfläche des erwachsenen Auges angeordnet sind7. Jedes Ommatidium besteht aus acht Photorezeptorneuronen, die eine unterschiedliche Position innerhalb eines asymmetrischen Trapezes einnehmen. Diese werden von vier nicht-neuralen Zapfenzellen und zwei primären Pigmentzellen unterstützt, die Linsen und Pseudokegel sezernieren, um Licht auf die lichtempfindlichen Rhabdomeren der Photorezeptorneuronen zu fokussieren. Benachbarte Ommatidien sind durch eine einzige Reihe interommatidialer Gitterzellen getrennt, die aus sekundären Pigmentzellen, tertiären Pigmentzellen und mechanosensorischen Borstenkomplexen bestehen 8,9,10.
Störungen in der Augenentwicklung sind bei erwachsenen Augen als Zunahme oder Verminderung der Augengröße, abnormale Häufigkeit oder Struktur von Linsen oder Borsten oder als "raues Auge" sichtbar, bei dem die normalerweise invariante sechseckige Musterung gestört ist, so dass eine Reihe von Ommatidien nicht mehr über die Oberfläche des Auges verfolgt werden kann. Diese Phänotypen können mit Hilfe von Präpariermikroskopen auf der Ebene des groben Gewebes bewertet werden. Die detaillierte Analyse von Phänotypen umfasst traditionell die Rasterelektronenmikroskopie, gefolgt von einer quantitativen Bildanalyse11. Die Rasterelektronenmikroskopie erfordert jedoch teure Instrumente, teure Reagenzien, eine tagelange Probenvorbereitung und oft Vollzeitpersonal für die Wartung.
Abbildung 1: Arbeitsablauf für die Bildgebung adulter Drosophila-Strukturen . (A) Adulte Drosophila in 70 % Ethanol sammeln und fixieren. (B) Bereiten Sie die Proben für die Bildgebung vor, indem Sie sie punktuell montieren und an Stiften befestigen. (C) Erfassen Sie hochauflösende Bilder durch Fokus-Stacking und Integration. (D) Quantifizieren Sie Bilder mit FIJI. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
In diesem Artikel wird ein Arbeitsablauf vorgestellt, der relativ kostengünstig ist, eine kurze Probenvorbereitungszeit hat, leicht auf einem 3-Fuß-Labortisch eingerichtet werden kann, keine gefährlichen Materialien erfordert und eine langlebige Ergänzung für Drosophila-Forschungslabore sein könnte (Abbildung 1). Die Punktbefestigung ist eine entomologische Technik, die zur Lufttrocknung und Konservierung von kleinen, weichen Insekten wie Drosophila12 verwendet wird. Bei dieser Methode werden Mikroskopobjektive mit hochauflösenden DSLR-Kameras kombiniert, um effektive Vergrößerungen von 10x bis 1.000x zu erzielen. Die begrenzte Schärfentiefe, die der Makrofotografie eigen ist, wird durch Focus Stacking überwunden: Das Zusammenfügen einer Reihe von Bildern, wobei sich die Brennebene durch das interessierende Exemplar bewegt13. Diese Methode liefert hochauflösende Bilder, die sich für die Quantifizierung von Phänotypen eignen und leicht für andere interessante Strukturen wie Flügel, Bein, Thorax und Abdomen angepasst werden könnten. Für den Bildanalyse-Workflow wird das kostenlose Bildanalyseprogramm FIJI (NIH ImageJ) verwendet. Diese Methodik macht die Probenvorbereitung, hochauflösende Bildgebung und Analyse für Studenten und Wissenschaftler an unterversorgten Institutionen zugänglich.
1. Entnahme und Fixierung adulter Drosophila
2. Probenvorbereitung durch Punktmontage
HINWEIS: Drosophila sind Insekten mit weichem Körper, die spröde werden und an der Luft zusammenfallen; Daher erfordert dieses Protokoll, dass die Proben am selben Tag abgebildet werden, an dem sie montiert werden. Arbeiten Sie in kleinen Sets von ~5 Fliegen auf einmal, um Probenverluste zu vermeiden. Erhöhen Sie die Anzahl der Proben in einem Satz basierend auf der Effizienz. Proben, die mehr Zeit vor der Bildgebung benötigen, können durch eine zunehmende Konzentrationsreihe von Hexamethyldisilazan (HMDS) dehydriert werden14.
Abbildung 2: Probenvorbereitung. (A) Adulte Drosophila werden nach phänotypischen Markern sortiert und in markierten Mikrozentrifugenröhrchen mit 70 % Ethanol auf Eis gesammelt. Die Fliegen werden bei 4° C über Nacht gelagert. (B) Papierkartenspitzen werden vorbereitet, indem das schmale Ende mit einer Pinzette #5 um 90° vom Rest der Karte gebogen wird. (C) Fliegen werden aus den Röhren geborgen und kurz an der Luft trocknen gelassen. Hautkleber wird auf das kleine, gefaltete Ende der vorbereiteten Kartenspitze aufgetragen und an den Bauchsegmenten 2-3 auf die adulte Fliege geklebt. (D) Die Proben werden mit einem Identifikationsetikett auf einen Insektenstift #3 aus Edelstahl montiert. (E) Gesteckte Proben werden auf einer Probenplatine gelagert, bis sie für die Bildaufnahme bereit sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
3. Hochauflösende Fokus-Stacking-Bildaufnahme
Abbildung 3: Bildaufnahme. (A) Bildgebende Vorrichtung mit Teilen mit der folgenden Bezeichnung: a) Gehäuse der DSLR-Kamera; b) Teleobjektiv; c) 20x Apo Mikroskop Objektiv und Adapter; d) Blitz; e) Linsen- und Kuppeldiffusoren; f) Stackshot-Controller, Makroschiene und Drehtisch; g) Universelles Bühnen-Gimbal; h) Stativ. (B) Bildgebendes Gerät mit eingesetztem Lichtdiffusor. (C) Nahaufnahme einer montierten Probe in Position für die Bildgebung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
4. FIJI-Analyse-Workflow zur Berechnung der Augenpartie bei Erwachsenen
Abbildung 4: Bildanalyse in Fidschi. (A) Skalieren Sie das Originalbild. Laden Sie das Kalibrierbild herunter und messen Sie die Länge des 500-μm-Stabs. (B) Passen Sie die Skalierung mit der Funktion "Skalierung einstellen " an. (C) Öffnen Sie das gestapelte Bild. (D) Vergrößern Sie das Bild so, dass das Auge zentriert und nahezu im Vollbildmodus angezeigt wird. (E) Verwenden Sie das Freihandauswahl-Werkzeug , um das Auge an der Grenze zwischen der äußersten Reihe der Ommatidien und der umgebenden Nagelhaut zu umranden. (F) Messen Sie die Fläche innerhalb des ausgewählten Bereichs wird berechnet, indem Sie auf Analysieren | Messen | Fläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Das Drosophila-Auge ist ein hervorragendes Modellsystem für die Untersuchung von Gewebemustern, Wachstumskontrolle und Zelltod. Wir haben kürzlich eine Studie veröffentlicht, in der untersucht wurde, wie der intrazelluläre pH-Wert (pHi) das Gewebewachstum beeinflusst. Zunächst etablierten wir ein genetisches System, bei dem die Überexpression des Natrium-Protonen-Austauschers DNhe2 (das Ortholog des Säugetier-NHE1) im sich entwickelnden Auge zu Musterungsdefekten...
Hier beschreiben wir eine Methode zur Probenvorbereitung, hochauflösenden Bildgebung und Analyse von adulten Drosophila-Strukturen . Das Drosophila-Auge ist ein genetisch manipulierbares Modellsystem, das wichtige Einblicke in die molekularen Mechanismen von Krankheiten wie Krebs19, Neurodegeneration20 und Stoffwechselerkrankungen21 geliefert hat. Insbesondere werden "Avatare" von Krebspatienten ge...
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Die Autoren danken den Mitgliedern des Grillo-Hill pHly-Labors für die Gespräche und die Unterstützung. Wir danken Tim Andriese, Randy Kirschner, Kitty (Ngoc-Huong) Nguyen, Marco Parent, Jonny Shaloub und Librado Veliz für die hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch NIH SC3GM132049 und 1R16GM153640 Awards (BKGH), einen CSU Biotechnology Faculty-Student Research Award (LM und BKGH) und Startkapital des College of Science und des Department of Biological Sciences an der San José State University (FJL) unterstützt. Besondere Erwähnung verdient Bernd Becker für seinen Einfallsreichtum und seine Unterstützung während dieses Prozesses. Wir danken der BioIcons (https://bioicons.com/)-Community für die Bereitstellung hochwertiger Symbole für unsere Abbildungen und insbesondere Serviere für das Pipettensymbol und DBCLS für die in Abbildung 1 und Abbildung 2 verwendeten Drosophila-, Pinzetten- und Desktop-Elektronenmikroskop-Symbole, die unter CC-BY 4.0 Unported lizenziert sind. Wir danken auch der SciDraw (https://scidraw.io/) Community für die Bereitstellung hochwertiger Icons für unsere Figuren, insbesondere Diogo Losch De Oliveira (doi.org/10.5281/zenodo.3925953), die unter der Creative Commons 4.0 Lizenz (CC-BY) lizenziert sind.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 mL serological pipette | ThermoFisher Scientific | 170353N | |
1.7 mL microcentrifuge tubes | Genesee Scientific | 24-282LR | |
20x Apo Microscope Objective | Mitutoyo Corp. | 378-804-3 | |
Archival 65 lb cardstock | Neenah, Inc. | 91901 | |
Canon EF 70-200 mm USM II telephoto lens | Canon | 3044C002 | |
Canon EOS 6D Mark II DSLR Camera Body | Canon | 1897C002 | |
Diffuser Dome | Macroscopic Solutions | PA-DIF-GIM-SM | |
Diffuser for Mitutoyo M Plan APO Objectives | Macroscopic Solutions | mitutoyo-diffusers | |
Drosophila vials and plugs | Genesee Scientific | 32-117BF | |
Dumont #5 fine-tip forceps | Fisher Scientific | NC9889584 | |
Goose feathers | Amazon | B01CMMJI6U | |
Heavy-Duty Anodized Aluminum Tripod | Really Right Stuff, LLC | TFA-32G | |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | lint-free lab tissue |
Levenhuk M1000 Plus Digital Camera | Levenhuk | 70358 | |
No. 3 mounting pin | Indigo Instruments | 33414-3 | |
Nutri-Fly Bloomington Drosophila media | Genesee Scientific | 66-113 | fly food |
Point-Punch | M.C. Mieth Manufacturing, Inc. | 448Detail | |
Screwknob Clamp | Really Right Stuff, LLC | SK-Clamp | For attaching the macro rail to the tripod |
Stackshot Controller and Macro Rail | Cognisys Inc. | ST3X_100_BUNDLE | |
Step-down Ring Adapter | RAF Camera | 763461174207 | Lens adapter to connect the microscope objective to the camera lens |
Titebond Glue | Franklin International | 5013 | |
Yongnuo YN-24-EX Macro Twin Lite Flash | Shenzhen Yongnuo Photographic Equipment Co. | YN-24EX | |
Software | |||
Canon EOS Utility (v. 3.16.1). | Canon | acquisition software | |
FIJI | National Institutes of Health | Fiji is released as open source under the GNU General Public License. FIJI Version 2.14.0/1.54f | |
GraphPad Prism | GraphPad Software, Boston, Massachusetts USA | Prism Version 10.3.1 | |
Zerene Stacker (v.1.04) | Zerene Systems, LLC | Focus Stacking Software |
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