Ein schneller, einfacher Workflow zur Quantifizierung externer adulter Drosophila-Strukturen

Zusammenfassung

Hier stellen wir einen schnellen, kostengünstigen Workflow für die hochauflösende Bildgebung von erwachsenen Drosophila-Augen vor, um Musterbildung und Wachstumsdefekte zu quantifizieren. Wir beschreiben unser Protokoll für die Probenvorbereitung durch Punktmontage, hochauflösende Bildaufnahme und Bildanalyse.

Zusammenfassung

Das Drosophila-Facettenauge ist ein präzise gemustertes Gewebe, das molekulare Mechanismen und biologische Prozesse aufgedeckt hat, die die Morphogenese vorantreiben. Es handelt sich um eine einfache Struktur von sich wiederholenden Einheitsaugen, die als Ommatidien bezeichnet werden und zur Charakterisierung genetischer Interaktionen und Genfunktionen verwendet wird. Mutationen, die die Augenarchitektur beeinflussen, können leicht erkannt und analysiert werden. Daher wird dieses System häufig in unterversorgten Institutionen eingesetzt. Eine weitere phänotypische Analyse umfasst häufig ein Rasterelektronenmikroskop (REM), um Bilder mit hoher Vergrößerung zu erzeugen, die für die quantitative Analyse geeignet sind. REMs sind jedoch teuer und erfordern teure Reagenzien. Die Probenvorbereitung erstreckt sich über Tage; Und oft benötigen sie Vollzeitpersonal für die Probenvorbereitung und die Wartung der Instrumente. Dies schränkt ihren Nutzen bei unterfinanzierten Institutionen oder bei Haushaltskürzungen ein. In der Entomologie ist der Einsatz hochauflösender digitaler Bildgebungstechnologie eine gängige Praxis zur Identifizierung und Charakterisierung von Arten. In diesem Artikel wird eine Methode beschrieben, die Strategien kombiniert und eine hochauflösende digitale Bildgebung von adulten Drosophila-Strukturen und eine quantitative Analyse mit der offenen Software ImageJ ermöglicht. Der Workflow ist eine schnelle und studierendenfreundliche Alternative, die die Einschränkungen unterfinanzierter und unterfinanzierter Forschungseinrichtungen mit einem kostengünstigen und schnellen Ansatz für die quantitative phänotypische Analyse behebt.

Einleitung

Drosophila melanogaster ist ein leistungsfähiger genetischer Modellorganismus, der seit Jahrzehnten zur Aufklärung molekularer Signalwege und zellulärer Verhaltensweisen eingesetzt wird. Viele der evolutionär konservierten Signalwege, die für die multizelluläre Entwicklung essentiell sind, wurden erstmals in Drosophila identifiziert und ihr Wirkmechanismus definiert. Etwa 65-75% aller humanen krankheitsassoziierten Gene haben Orthologe in Drosophila ^1,2. Das erwachsene Drosophila-Auge ist ein wichtiges Modell, das unvoreingenommene genetische Screenings ermöglicht hat, die die Entdeckung wichtiger konservierter Gene erleichtern, die an menschlichen Krankheiten beteiligt sind, einschließlich Krebs ^3,4, Neurodegeneration⁵ und Stoffwechselstörungen⁶.

Das Drosophila-Auge besteht aus ~800 Augeneinheiten, die als Ommatidien bezeichnet werden und präzise in einem sechseckigen Muster über die Oberfläche des erwachsenen Auges angeordnet sind⁷. Jedes Ommatidium besteht aus acht Photorezeptorneuronen, die eine unterschiedliche Position innerhalb eines asymmetrischen Trapezes einnehmen. Diese werden von vier nicht-neuralen Zapfenzellen und zwei primären Pigmentzellen unterstützt, die Linsen und Pseudokegel sezernieren, um Licht auf die lichtempfindlichen Rhabdomeren der Photorezeptorneuronen zu fokussieren. Benachbarte Ommatidien sind durch eine einzige Reihe interommatidialer Gitterzellen getrennt, die aus sekundären Pigmentzellen, tertiären Pigmentzellen und mechanosensorischen Borstenkomplexen bestehen ^8,9,10.

Störungen in der Augenentwicklung sind bei erwachsenen Augen als Zunahme oder Verminderung der Augengröße, abnormale Häufigkeit oder Struktur von Linsen oder Borsten oder als "raues Auge" sichtbar, bei dem die normalerweise invariante sechseckige Musterung gestört ist, so dass eine Reihe von Ommatidien nicht mehr über die Oberfläche des Auges verfolgt werden kann. Diese Phänotypen können mit Hilfe von Präpariermikroskopen auf der Ebene des groben Gewebes bewertet werden. Die detaillierte Analyse von Phänotypen umfasst traditionell die Rasterelektronenmikroskopie, gefolgt von einer quantitativen Bildanalyse¹¹. Die Rasterelektronenmikroskopie erfordert jedoch teure Instrumente, teure Reagenzien, eine tagelange Probenvorbereitung und oft Vollzeitpersonal für die Wartung.

Abbildung 1: Arbeitsablauf für die Bildgebung adulter Drosophila-Strukturen . (A) Adulte Drosophila in 70 % Ethanol sammeln und fixieren. (B) Bereiten Sie die Proben für die Bildgebung vor, indem Sie sie punktuell montieren und an Stiften befestigen. (C) Erfassen Sie hochauflösende Bilder durch Fokus-Stacking und Integration. (D) Quantifizieren Sie Bilder mit FIJI. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

In diesem Artikel wird ein Arbeitsablauf vorgestellt, der relativ kostengünstig ist, eine kurze Probenvorbereitungszeit hat, leicht auf einem 3-Fuß-Labortisch eingerichtet werden kann, keine gefährlichen Materialien erfordert und eine langlebige Ergänzung für Drosophila-Forschungslabore sein könnte (Abbildung 1). Die Punktbefestigung ist eine entomologische Technik, die zur Lufttrocknung und Konservierung von kleinen, weichen Insekten wie Drosophila¹² verwendet wird. Bei dieser Methode werden Mikroskopobjektive mit hochauflösenden DSLR-Kameras kombiniert, um effektive Vergrößerungen von 10x bis 1.000x zu erzielen. Die begrenzte Schärfentiefe, die der Makrofotografie eigen ist, wird durch Focus Stacking überwunden: Das Zusammenfügen einer Reihe von Bildern, wobei sich die Brennebene durch das interessierende Exemplar bewegt¹³. Diese Methode liefert hochauflösende Bilder, die sich für die Quantifizierung von Phänotypen eignen und leicht für andere interessante Strukturen wie Flügel, Bein, Thorax und Abdomen angepasst werden könnten. Für den Bildanalyse-Workflow wird das kostenlose Bildanalyseprogramm FIJI (NIH ImageJ) verwendet. Diese Methodik macht die Probenvorbereitung, hochauflösende Bildgebung und Analyse für Studenten und Wissenschaftler an unterversorgten Institutionen zugänglich.

Protokoll

1. Entnahme und Fixierung adulter Drosophila

1. Setzen Sie Drosophila-Kreuzungen ein oder wählen Sie Stämme aus und legen Sie sie in Fläschchen mit Fliegenfutter. Inkubieren Sie die Fläschchen bei der gewünschten Temperatur (in der Regel 25 °C), bis sich die Fliegen entwickelt haben und die erwachsenen Tiere sich einschließen (~10-14 Tage bei 25 °C).
2. Betäuben Sie die Fliegen mit CO₂ und legen Sie sie auf ein CO₂ -Pad.
3. Sortieren Sie die Fliegen mit einer Feder und wählen Sie die Individuen mit dem gewünschten Phänotyp (z.B. gerade Flügel) aus. Stellen Sie einen Federfliegensortierer her, indem Sie eine Gänsefeder so zuschneiden, dass sie in das konische Ende einer serologischen 1-ml-Pipette passt.
4. Bereiten Sie ein 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml 70%igem Ethanol vor. Legen Sie die ausgewählten Fliegen in das Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie sie auf Eis. Lagern Sie die Mikrozentrifugenröhrchen über Nacht bei 4 °C (Abbildung 2A).
   HINWEIS: Bewahren Sie Fliegen nicht länger als 24 Stunden in Ethanol auf. Die langfristige Lagerung von Fliegen in 70%igem Ethanol führt zum Verlust von Augen- und Körperpigmenten.

2. Probenvorbereitung durch Punktmontage

HINWEIS: Drosophila sind Insekten mit weichem Körper, die spröde werden und an der Luft zusammenfallen; Daher erfordert dieses Protokoll, dass die Proben am selben Tag abgebildet werden, an dem sie montiert werden. Arbeiten Sie in kleinen Sets von ~5 Fliegen auf einmal, um Probenverluste zu vermeiden. Erhöhen Sie die Anzahl der Proben in einem Satz basierend auf der Effizienz. Proben, die mehr Zeit vor der Bildgebung benötigen, können durch eine zunehmende Konzentrationsreihe von Hexamethyldisilazan (HMDS) dehydriert ^werden14.

1. Schneiden Sie kleine dreieckige Spitzen (7,1 mm x 2,7 mm) aus 65 lb Archivkarton mit einem speziellen Punktlocher aus. Bereiten Sie Punkte vor, indem Sie die Spitze (schmalste 25%) mit der Dumont #5 Feinpinzette in einen 90°-Winkel biegen (Abbildung 2B).
2. Entfernen Sie mit der Dumont #5 Feinpinzette die Fliegen aus den Mikrozentrifugenröhrchen (Schritt 1.4). Tupfen Sie die Fliegen vorsichtig mit fusselfreiem Laborgewebe ab, um überschüssiges Ethanol zu entfernen. Positionieren Sie jede Fliege auf der linken Seite auf einer Karteikarte unter einem Präpariermikroskop.
   HINWEIS: Entfernen Sie die Fliegen aus der Röhre, indem Sie sich an einer anatomischen Struktur festhalten, die nicht der interessierende Bereich ist - bei der Abbildung des Kopfes halten wir die Proben am Flügel oder Bein. Halten Sie die Proben nicht am Bauch, da diese Struktur verwendet wird, um die Fliege auf die Kartenspitze zu kleben.
3. Bereiten Sie den Hautkleber vor und stellen Sie seine Konsistenz auf die gewünschte Viskosität ein. Mischen Sie 1-2 Tropfen Hautkleber mit 1-2 Tropfen deionisiertem (DI) Wasser und mischen Sie es mit einer Transferpipette auf einer Karteikarte. Nehmen Sie eine vorbereitete Kartenspitze am breiten Ende mit einer Pinzette auf und geben Sie eine kleine Menge des verdünnten Klebers auf die gebogene Spitze der Spitze, indem Sie ihn in die Leim-Wasser-Mischung tupfen (Abbildung 2C).
   HINWEIS: Der Kleber sollte streichbar, aber nicht flüssig sein.
4. Bringen Sie die gebogene Spitze der Spitze auf die vordere Seite des rechten Abdomens um die Bauchsegmente 2-3 an (Abbildung 2C). Bevor der Kleber trocknet, nehmen Sie leichte Anpassungen am Hosenschlitz vor, so dass die vorder-hintere Achse des Fliegens senkrecht zur gebogenen Spitze der Spitze steht.
5. Stecken Sie einen Befestigungsstift Nr. 3 in das breite Ende der Kartenspitze (Abbildung 2D) und befestigen Sie ihn an einem Insektenstiftblock (Abbildung 2E). Beschriften Sie jeden Pin oder jede Pin-Reihe mit dem entsprechenden Genotyp.

Abbildung 2: Probenvorbereitung. (A) Adulte Drosophila werden nach phänotypischen Markern sortiert und in markierten Mikrozentrifugenröhrchen mit 70 % Ethanol auf Eis gesammelt. Die Fliegen werden bei 4° C über Nacht gelagert. (B) Papierkartenspitzen werden vorbereitet, indem das schmale Ende mit einer Pinzette #5 um 90° vom Rest der Karte gebogen wird. (C) Fliegen werden aus den Röhren geborgen und kurz an der Luft trocknen gelassen. Hautkleber wird auf das kleine, gefaltete Ende der vorbereiteten Kartenspitze aufgetragen und an den Bauchsegmenten 2-3 auf die adulte Fliege geklebt. (D) Die Proben werden mit einem Identifikationsetikett auf einen Insektenstift #3 aus Edelstahl montiert. (E) Gesteckte Proben werden auf einer Probenplatine gelagert, bis sie für die Bildaufnahme bereit sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Hochauflösende Fokus-Stacking-Bildaufnahme

1. Erfassen Sie hochauflösende Fotos von Fliegenaugen mit einem zusammengebauten und individuell angepassten Focus-Stacking-Bildgebungssystem.
   1. Nehmen Sie Fotos mit einem DSLR-Kameragehäuse mit einem 70-200-mm-Teleobjektiv auf, das über einen 77-mm-Objektivadapter mit einem 20-fach-Apo-Mikroskopobjektiv verbunden ist.
   2. Stellen Sie sicher, dass die Probe durch einen Diffusor mit einem Blitz beleuchtet wird (Abbildung 3).
   3. Steuern Sie die Z-Positionierung mit einem Stackshot-Controller und einer Makroschiene.
   4. Verbinden Sie die Kamera, den Blitz und den motorisierten Tisch mit einem robusten Stativ aus eloxiertem Aluminium.
2. Positionieren Sie jede punktgebundene Probe auf einem universellen Tisch-Gimbal, wobei der Kopf so ausgerichtet ist, dass das Auge zur Linse zeigt. Passen Sie die Kopfposition an, indem Sie den Kopf vorsichtig mit der Pinzette bewegen.
   ACHTUNG: Große und schnelle Anpassungen können zu einer versehentlichen Enthauptung führen.
3. Wenn die Kamera an einen Laptop angeschlossen ist, passen Sie die Aufnahmeeinstellungen in der Software an. Fotografieren Sie Proben bei 20-facher Vergrößerung mit diesen Einstellungen: Blitzleistung 1/32, Verschlusszeit 1/200, Blende F2,8 und ISO 400. Stellen Sie sicher, dass alle Autofokus- und Bildstabilisierungsfunktionen deaktiviert sind.
   HINWEIS: Diese Einstellungen sorgen für ein ausgewogenes Verhältnis zwischen optimaler Blitzbeleuchtung, Verschlusszeit und Schärfentiefe. Sie müssten für andere Vergrößerungen und/oder Linsenkombinationen angepasst werden.
4. Legen Sie den Speicherort für den resultierenden Bildstapel (10-50 Bilder) im gewünschten Dateiordner fest. Stellen Sie sicher, dass genügend Speicherkapazität für die Bilder vorhanden ist (~8,5 MB pro Bild).
5. Passen Sie die Einstellungen für den Fokusstapel an der Stackshot-Steuereinheit im Auto-Distance-Modus an.
   1. Stellen Sie die Schrittweite auf 5 μm ein und berechnen Sie die Anzahl der Schritte , indem Sie die Start - und Stopppositionen des Fokusstapels festlegen.
   2. Betrachten Sie die Probe im LiveView-Modus und mit der Kamera im Auto-Shoot-Modus , um die Start- und Stopppositionen zu identifizieren.
   3. Bewegen Sie die Schiene so, dass der nächstgelegene Teil der Probe scharf ist ( Startposition einstellen), und bewegen Sie sich dann dorthin, wo das am weitesten entfernte interessierende Merkmal scharf ist ( Endposition einstellen).
6. Versetzen Sie die Kamera wieder in den manuellen Aufnahmemodus und starten Sie die Bildaufnahme über die Stackshot-Steuereinheit.
   HINWEIS: Die Bildaufnahmezeit hängt von der Größe der Probe ab. Je größer die Schärfentiefe, die für große Proben erforderlich ist, desto mehr Schichten werden in den Bildstapel aufgenommen, was die Gesamtaufnahmezeit verlängert.
7. Öffnen Sie Dateien in der referenzierten Focus-Stacking-Software. Generieren Sie ein gestapeltes Bild, indem Sie auf Stapeln | Ausrichten & Stapeln aller (PMax).
8. Speichern Sie das endgültige Bild als .tif Datei auf der Festplatte des Computers, indem Sie auf Datei | Ausgabebild speichern.
   HINWEIS: Abhängig von der Auflösung der gestapelten Image-Datei und der Anzahl der abgebildeten Exemplare können große externe Festplatten (1 TB) für die Image-Sicherung erforderlich sein. Bei diesem Protokoll sind gestapelte Bilder jeweils ca. 100 MB groß, bevor sie komprimiert werden.

Abbildung 3: Bildaufnahme. (A) Bildgebende Vorrichtung mit Teilen mit der folgenden Bezeichnung: a) Gehäuse der DSLR-Kamera; b) Teleobjektiv; c) 20x Apo Mikroskop Objektiv und Adapter; d) Blitz; e) Linsen- und Kuppeldiffusoren; f) Stackshot-Controller, Makroschiene und Drehtisch; g) Universelles Bühnen-Gimbal; h) Stativ. (B) Bildgebendes Gerät mit eingesetztem Lichtdiffusor. (C) Nahaufnahme einer montierten Probe in Position für die Bildgebung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. FIJI-Analyse-Workflow zur Berechnung der Augenpartie bei Erwachsenen

1. Für die Bildanalyse laden Sie die FIJI-Software¹⁵ von der ImageJ.net-Website herunter.
2. Wählen Sie Bilder für die Analyse aus, bei denen das Auge zentriert und ausgerichtet ist, mit angemessener Beleuchtung und minimaler peripherer Unschärfe, was auf eine korrekte Ausrichtung mit der Kamera hinweist.
3. Kalibrieren Sie den Bildmaßstab.
   1. Laden Sie das Bild der Maßstabsleiste für eine 20-fache Vergrößerung herunter, die 500 μm entspricht. Alternativ können Sie zum Zeitpunkt der Bildaufnahme ein Lineal mit denselben Einstellungen fotografieren. Öffnen Sie das Bild in der FIJI-Software.
   2. Messen Sie die Länge der Maßstabsleiste (Abbildung 4A). Verwenden Sie das Werkzeug "Gerade Linie ", um die Linie genau nachzuzeichnen. Klicken Sie auf Analysieren | Messen. Dieser Pixelabstand entspricht 500 μm (Abbildung 4B).
   3. Berechnen Sie Pixel pro Mikrometer. Verwenden Sie diese Option, um Pixelmessungen in Mikrometermessungen umzuwandeln.
4. Öffnen Sie die gestapelte Bilddatei in FIJI (Abbildung 4C).
5. Wählen Sie Lupe aus der Symbolleiste, um den Fokusbereich zu vergrößern. Versuchen Sie, den Bildschirm mit dem Auge und der unmittelbar umgebenden Nagelhaut des Kopfes auszufüllen (Abbildung 4D).
6. Wählen Sie Freihandwerkzeug aus der Symbolleiste aus. Umreißen Sie den Netzhautbereich so genau wie möglich und folgen Sie dabei den Konturen der äußersten Reihe von Ommatidien (Abbildung 4E). Um einen Teil der Auswahl zu entfernen, halten Sie die Optionstaste gedrückt und wählen Sie die Pixel aus, die Sie entfernen möchten. Um der Auswahl etwas hinzuzufügen, halten Sie die Wahltaste und die Umschalttaste gedrückt und wählen Sie die Pixel aus, die Sie hinzufügen möchten.
7. Um die Fläche zu berechnen, wählen Sie Analysieren | Messen Sie über das obere Menü (Abbildung 4F). Es erscheint ein neues Fenster mit den Parametern Fläche, Mittelwert, Minimum und Maximum . Kopieren Sie diese Daten und fügen Sie sie in eine Tabelle ein, um sie zu dokumentieren und von Pixeln in Mikrometermessungen umzuwandeln.
8. Führen Sie entsprechende statistische Analysen durch.

Abbildung 4: Bildanalyse in Fidschi. (A) Skalieren Sie das Originalbild. Laden Sie das Kalibrierbild herunter und messen Sie die Länge des 500-μm-Stabs. (B) Passen Sie die Skalierung mit der Funktion "Skalierung einstellen " an. (C) Öffnen Sie das gestapelte Bild. (D) Vergrößern Sie das Bild so, dass das Auge zentriert und nahezu im Vollbildmodus angezeigt wird. (E) Verwenden Sie das Freihandauswahl-Werkzeug , um das Auge an der Grenze zwischen der äußersten Reihe der Ommatidien und der umgebenden Nagelhaut zu umranden. (F) Messen Sie die Fläche innerhalb des ausgewählten Bereichs wird berechnet, indem Sie auf Analysieren | Messen | Fläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergebnisse

Das Drosophila-Auge ist ein hervorragendes Modellsystem für die Untersuchung von Gewebemustern, Wachstumskontrolle und Zelltod. Wir haben kürzlich eine Studie veröffentlicht, in der untersucht wurde, wie der intrazelluläre pH-Wert (pHi) das Gewebewachstum beeinflusst. Zunächst etablierten wir ein genetisches System, bei dem die Überexpression des Natrium-Protonen-Austauschers DNhe2 (das Ortholog des Säugetier-NHE1) im sich entwickelnden Auge zu Musterungsdefekten...

Diskussion

Hier beschreiben wir eine Methode zur Probenvorbereitung, hochauflösenden Bildgebung und Analyse von adulten Drosophila-Strukturen . Das Drosophila-Auge ist ein genetisch manipulierbares Modellsystem, das wichtige Einblicke in die molekularen Mechanismen von Krankheiten wie Krebs¹⁹, Neurodegeneration²⁰ und Stoffwechselerkrankungen²¹ geliefert hat. Insbesondere werden "Avatare" von Krebspatienten ge...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL serological pipette	ThermoFisher Scientific	170353N
1.7 mL microcentrifuge tubes	Genesee Scientific	24-282LR
20x Apo Microscope Objective	Mitutoyo Corp.	378-804-3
Archival 65 lb cardstock	Neenah, Inc.	91901
Canon EF 70-200 mm USM II telephoto lens	Canon	3044C002
Canon EOS 6D Mark II DSLR Camera Body	Canon	1897C002
Diffuser Dome	Macroscopic Solutions	PA-DIF-GIM-SM
Diffuser for Mitutoyo M Plan APO Objectives	Macroscopic Solutions	mitutoyo-diffusers
Drosophila vials and plugs	Genesee Scientific	32-117BF
Dumont #5 fine-tip forceps	Fisher Scientific	NC9889584
Goose feathers	Amazon	B01CMMJI6U
Heavy-Duty Anodized Aluminum Tripod	Really Right Stuff, LLC	TFA-32G
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	lint-free lab tissue
Levenhuk M1000 Plus Digital Camera	Levenhuk	70358
No. 3 mounting pin	Indigo Instruments	33414-3
Nutri-Fly Bloomington Drosophila media	Genesee Scientific	66-113	fly food
Point-Punch	M.C. Mieth Manufacturing, Inc.	448Detail
Screwknob Clamp	Really Right Stuff, LLC	SK-Clamp	For attaching the macro rail to the tripod
Stackshot Controller and Macro Rail	Cognisys Inc.	ST3X_100_BUNDLE
Step-down Ring Adapter	RAF Camera	763461174207	Lens adapter to connect the microscope objective to the camera lens
Titebond Glue	Franklin International	5013
Yongnuo YN-24-EX Macro Twin Lite Flash	Shenzhen Yongnuo Photographic Equipment Co.	YN-24EX
Software
Canon EOS Utility (v. 3.16.1).	Canon		acquisition software
FIJI	National Institutes of Health		Fiji is released as open source under the GNU General Public License.  FIJI Version 2.14.0/1.54f
GraphPad Prism	GraphPad Software, Boston, Massachusetts USA		Prism Version 10.3.1
Zerene Stacker (v.1.04)	Zerene Systems, LLC		Focus Stacking Software