תהליך עבודה מהיר ופשוט לכימות מבני דרוזופילה חיצוניים למבוגרים

Summary

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה מהירה, בעלות נמוכה, עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של עיני דרוזופילה בוגרות כדי לכמת דפוסי דפוס ופגמי גדילה. אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו להכנת דגימות על ידי הרכבה נקודתית, רכישת תמונה ברזולוציה גבוהה וניתוח תמונה.

Abstract

עין תרכובת דרוזופילה היא רקמה בעלת תבנית מדויקת שחשפה מנגנונים מולקולריים ותהליכים ביולוגיים המניעים מורפוגנזה. זהו מבנה פשוט של עיני יחידה חוזרות, המכונה ommatidia, המשמש לאפיון אינטראקציות גנטיות ותפקודי גנים. מוטציות המשפיעות על ארכיטקטורת העין ניתן לזהות ולנתח בקלות; לפיכך, מערכת זו משמשת לעתים קרובות במוסדות חסרי משאבים. ניתוח פנוטיפי נוסף כולל לעתים קרובות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כדי להפיק תמונות בהגדלה גבוהה המתאימות לניתוח כמותי. עם זאת, SEMs הם יקרים ודורשים ריאגנטים יקרים; הכנת הדגימה משתרעת על פני ימים; ולעתים קרובות, הם זקוקים לצוות במשרה מלאה להכנת דגימות ותחזוקת מכשירים. זה מגביל את התועלת שלהם במוסדות חסרי משאבים או במהלך צנע תקציבי. באנטומולוגיה, השימוש בטכנולוגיית הדמיה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה הוא פרקטיקה נפוצה לזיהוי ואפיון מינים. מאמר זה מתאר שיטה המשלבת אסטרטגיות ומאפשרת הדמיה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה של מבני דרוזופילה בוגרים וניתוח כמותי באמצעות התוכנה הפתוחה ImageJ. זרימת העבודה היא חלופה מהירה וידידותית לסטודנטים המתקנת את המגבלות של מתקני מחקר תת-ממומנים ותת-משאבים עם גישה חסכונית ומהירה לניתוח פנוטיפי כמותי.

Introduction

Drosophila melanogaster הוא אורגניזם מודל גנטי רב עוצמה המשמש במשך עשרות שנים כדי להבהיר מסלולי איתות מולקולרי והתנהגויות תאיות. רבים ממסלולי האיתות שהשתמרו אבולוציונית וחיוניים להתפתחות רב-תאית זוהו לראשונה ומנגנון הפעולה שלהם הוגדר בדרוזופילה. כ 65-75% מכל הגנים הקשורים למחלות אנושיות יש אורתולוגים Drosophila ^1,2. עין הדרוזופילה הבוגרת היא מודל חשוב שאיפשר בדיקות גנטיות בלתי משוחדות שאפשרו גילוי גנים שמורים חשובים המעורבים במחלות אנושיות, כולל סרטן ^3,4, ניוון עצבי ⁵ והפרעות מטבוליות⁶.

עין הדרוזופילה מורכבת מ~800 עיני יחידה, הנקראות אומטידיה, המסודרות במדויק בתבנית משושה על פני השטח של העין הבוגרת⁷. כל אומטידיום מורכב משמונה נוירונים קולטי אור התופסים מיקום מובחן בתוך טרפז א-סימטרי. אלה נתמכים על ידי ארבעה תאי חרוט לא עצביים ושני תאי פיגמנט ראשוניים המפרישים עדשה ופסאודו-חרוט כדי למקד אור על הרבדומרים קולטי האור של נוירוני קולטני האור. אומטידיה שכנה מופרדת על ידי שורה אחת של תאי סריג אינטראומטידיאלים, המורכבים מתאי פיגמנט משניים, תאי פיגמנט שלישוניים וקומפלקסי זיפים מכנו-סנסוריים ^8,9,10.

הפרעות בהתפתחות העיניים נראות בעיניים בוגרות כגודל עיניים מוגדל או קטן, שפע חריג או מבנה של עדשות או זיפים, או כ"עין מחוספסת" שבה דפוס המשושה האינווריאנטי בדרך כלל משתבש כך שלא ניתן עוד לעקוב אחר שורה של אומטידיה על פני השטח של העין. ניתן להבקיע פנוטיפים אלה ברמת הרקמה הגסה באמצעות מיקרוסקופים מנתחים. ניתוח מפורט של פנוטיפים כולל באופן מסורתי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים ואחריו ניתוח תמונה כמותי¹¹. עם זאת, סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים דורשת מכשור יקר, ריאגנטים יקרים, הכנת דגימות המתפרשת על פני ימים, ולעתים קרובות, צוות במשרה מלאה לתחזוקה.

איור 1: תהליך עבודה להדמיית מבני דרוזופילה בוגרים. (A) לאסוף ולתקן דרוזופילה בוגרת באתנול 70%. (B) הכינו דגימות להדמיה על ידי הרכבה נקודתית והצמדה לפינים. (C) קבל תמונות ברזולוציה גבוהה באמצעות ערימת מיקוד ושילוב. (D) כימות תמונות באמצעות FIJI. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מאמר זה מציג תהליך עבודה זול יחסית, בעל זמן הכנת דגימה קצר, ניתן להציב אותו בקלות על ספסל מעבדה בגובה 3 מטרים, אינו דורש חומרים מסוכנים, ויכול להיות תוספת ארוכת חיים למעבדות מחקר דרוזופילה (איור 1). הרכבה נקודתית היא טכניקה אנטומולוגית המשמשת לייבוש באוויר ולשימור חרקים קטנים ובעלי גוף רך, כגון דרוזופילה¹². שיטה זו מסתמכת על שילוב מטרות מיקרוסקופ עם מצלמות DSLR ברזולוציה גבוהה להגדלות יעילות של פי 10 עד פי 1,000. עומק השדה המוגבל הטבוע בצילום מאקרו מתגבר על ידי הערמת מיקוד: תפירת סדרה של תמונות כאשר מישור המוקד נע דרך הדגימה המעניינת¹³. שיטה זו מניבה תמונות ברזולוציה גבוהה המתאימה לכימות פנוטיפים וניתן להתאים אותה בקלות למבנים אחרים בעלי עניין, כגון כנף, רגל, בית חזה ובטן. תהליך העבודה של ניתוח התמונה משתמש בתוכנית ניתוח התמונות החינמית FIJI (NIH ImageJ). מתודולוגיה זו הופכת את הכנת הדגימות, הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח לנגישים לסטודנטים לתואר ראשון ולמדענים במוסדות חסרי משאבים.

Protocol

1. איסוף וקיבוע דרוזופילה למבוגרים

1. הגדירו צלבי דרוזופילה או זנים נבחרים והניחו אותם בבקבוקונים המכילים מזון לזבובים. לדגור על הבקבוקונים בטמפרטורה הרצויה (בדרך כלל 25 מעלות צלזיוס) עד שהזבובים התפתחו והמבוגרים נסגרים (~ 10-14 ימים ב 25 מעלות צלזיוס).
2. הרדימו את הזבובים עם_CO2 והניחו אותם על כרית CO₂ .
3. מיין את הזבובים עם נוצה ובחר את הפרטים עם הפנוטיפ הרצוי (למשל, כנפיים ישרות). צור סדרן זבוב נוצות על ידי חיתוך נוצת אווז כך שתתאים לקצה המחודד של פיפטה סרולוגית של 1 מ"ל.
4. הכינו צינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל עם 1 מ"ל של 70% אתנול. מניחים את הזבובים שנבחרו בצינור המיקרוצנטריפוגה ומניחים קרח. אחסנו את צינורות המיקרוצנטריפוגות בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה (איור 2A).
   הערה: אין לשמר זבובים באתנול למשך יותר מ-24 שעות. אחסון ארוך טווח של זבובים באתנול 70% יגרום לאובדן פיגמנט בעיניים ובגוף.

2. הכנת דגימה על ידי הרכבה נקודתית

הערה: דרוזופילה הם חרקים בעלי גוף רך שהופכים שבירים וקורסים כאשר הם מיובשים באוויר; לכן, פרוטוקול זה דורש שהדגימות יצולמו באותו יום שבו הן מותקנות. עבוד בקבוצות קטנות של ~5 זבובים בכל פעם כדי למנוע אובדן דגימה. הגדל את מספר הדגימות בקבוצה בהתבסס על יעילות. דגימות הדורשות זמן רב יותר לפני הדמיה יכולות להתייבש באמצעות סדרה של ריכוז הולך וגדל של hexamethyldisilazane (HMDS)¹⁴.

1. חתך נקודות משולש קטנות (7.1 מ"מ x 2.7 מ"מ) מקרטון ארכיוני במשקל 65 ליברות באמצעות ניקוב נקודתי מיוחד. הכינו נקודות על-ידי כיפוף החוד (הצר ביותר ב-25%) לזווית של 90° בעזרת מלקחיים עדינים מסוג Dumont #5 (איור 2B).
2. באמצעות מלקחיים עדינים של Dumont #5, הסר את הזבובים מצינורות המיקרוצנטריפוגות (שלב 1.4). הכתם בעדינות את הזבובים ברקמת מעבדה נטולת סיבים כדי להסיר עודפי אתנול. מקמו כל זבוב על צדו השמאלי על כרטיס אינדקס תחת מיקרוסקופ מנתח.
   הערה: הסר את הזבובים מהצינור על ידי אחיזה במבנה אנטומי שאינו אזור העניין - כאשר אנו מדמים את הראש, אנו מחזיקים דגימות על ידי הכנף או הרגל. אין להחזיק דגימות ליד הבטן, מכיוון שמבנה זה משמש להדבקת הזבוב על נקודת הקלף.
3. הכינו את דבק הסתרה, התאמת עקביותו לצמיגות הרצויה. ערבבו 1-2 טיפות של דבק הסתרה עם 1-2 טיפות מים שעברו דה-יוניזציה (DI), וערבבו עם צינור העברה על כרטיס אינדקס. הרימו נקודת קלף מוכנה בקצה הרחב בעזרת מלקחיים, והניחו כמות קטנה של הדבק המדולל על הקצה הכפוף של הנקודה על-ידי טבילתה לתוך תערובת הדבק-מים (איור 2C).
   הערה: הדבק צריך להיות ניתן למריחה אך לא נוזלי.
4. מרחו את הקצה הכפוף של הנקודה על הצד הקדמי של הבטן הימנית סביב מקטעי בטן 2-3 (איור 2C). לפני שהדבק מתייבש, בצעו התאמות קלות בזבוב כך שהציר הקדמי-אחורי של הזבוב יהיה מאונך לקצה הכפוף של הנקודה.
5. הכניסו פין הרכבה מס' 3 לקצה הרחב של נקודת הכרטיס (איור 2D) והדקו אותו לגוש הצמדת חרקים (איור 2E). תייג כל סיכה או שורת סיכות בגנוטיפ המתאים.

איור 2: הכנת הדגימה. (A) דרוזופילה בוגרת ממוינת על פי סמנים פנוטיפיים ונאספת לצינורות מיקרוצנטריפוגות מסומנים המכילים 70% אתנול על קרח. הזבובים מאוחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. (B) נקודות כרטיס נייר מוכנות על ידי כיפוף הקצה הצר 90° משאר הכרטיס באמצעות זוג #5 מלקחיים. (C) זבובים מוחלצים מצינורות ומאפשרים להם להתייבש באוויר לזמן קצר. דבק הסתר נמרח על הקצה הקטן והמקופל של נקודת הקלף המוכנה ומודבק לזבוב הבוגר במקטעים 2-3 בבטן. (D) הדגימות מותקנות, עם תווית זיהוי, על סיכת חרק נירוסטה #3. (E) דגימות מוצמדות מאוחסנות בלוח דגימה עד שהן מוכנות לרכישת תמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. רכישת הדמיה בערימת מיקוד ברזולוציה גבוהה

1. קבל צילומים ברזולוציה גבוהה של עיני זבוב באמצעות מערכת הדמיה מורכבת ומותאמת אישית להערמת פוקוס שהורכבה ומותאמת אישית.
   1. צלם תמונות עם גוף מצלמת DSLR עם עדשת טלפוטו 70-200 מ"מ המחוברת ליעד מיקרוסקופ Apo 20x באמצעות מתאם עדשת 77 מ"מ.
   2. ודאו שהדגימה מוארת באמצעות הבזק דרך מפזר (איור 3).
   3. שלוט במיקום Z באמצעות בקר Stackshot ומסילת מאקרו.
   4. חבר את המצלמה, המבזק והבמה הממונעת לחצובת אלומיניום אנודייז כבדה.
2. מקם כל דגימה נקודתית על גימבל במה אוניברסלי כשהראש מכוון כך שהעין פונה לכיוון העדשה. בצע התאמות מיקום הראש על ידי הזזת הראש בעדינות עם המלקחיים.
   התראה: התאמות גדולות ומהירות עלולות לגרום לעריפת ראשים בשוגג.
3. כאשר המצלמה קשורה למחשב נייד, התאם את הגדרות הרכישה בתוכנה. דגימות צילום בהגדלה של 20x עם ההגדרות הבאות: עוצמת הבזק 1/32, מהירות תריס 1/200, צמצם F2.8 ו-ISO 400. ודא שכל תכונות המיקוד האוטומטי וייצוב התמונה כבויות.
   הערה: הגדרות אלה מאזנות בין תאורת המבזק האופטימלית, מהירות התריס ועומק השדה. יהיה צורך להתאים אותם להגדלות אחרות ו / או שילובי עדשות.
4. קבעו את המיקום לשמירת אוסף התמונות שנוצר (10-50 תמונות) בתיקיית הקבצים הרצויה. ודא קיבולת אחסון מספקת עבור התמונות (~ 8.5 MB לתמונה).
5. התאם את הגדרות מחסנית המיקוד ביחידת הבקרה Stackshot במצב מרחק אוטומטי.
   1. הגדר את גודל הצעד ל- 5 מיקרומטר וחשב את מספר השלבים על-ידי הגדרת מיקומי ההתחלה והעצירה של ערימת המיקוד.
   2. הצג את הדגימה במצב LiveView וכשהמצלמה במצב צילום אוטומטי כדי לזהות את מיקומי ההתחלה והעצירה.
   3. הזז את המסילה כך שהחלק הקרוב ביותר של הדגימה יהיה בפוקוס (הגדר את מיקום ההתחלה ), ולאחר מכן עבור למקום שבו התכונה הרחוקה ביותר של עניין נמצאת בפוקוס (קבע מיקום קצה ).
6. החזר את המצלמה למצב צילום ידני והתחל את רכישת התמונה מיחידת הבקרה Stackshot.
   הערה: זמן רכישת התמונה תלוי בגודל הדגימה. ככל שעומק השדה הדרוש לדגימות גדולות גדול יותר, כך יותר פרוסות נכללות באוסף התמונות, מה שיאריך את זמן הרכישה הכולל.
7. פתח קבצים בתוכנת ערימת המיקוד שבוצעה אליה הפניה. צור תמונה מוערמת על-ידי לחיצה על ערימה | יישור וערמה הכל (PMax).
8. שמור את התמונה הסופית בכונן הקשיח של המחשב כקובץ .tif על-ידי לחיצה על קובץ | שמור תמונת פלט.
   הערה: בהתאם לרזולוציה של קובץ התמונה המוערם ומספר הדגימות המצולמות, ייתכן שיהיה צורך בכוננים קשיחים חיצוניים גדולים (1 TB) לגיבוי תמונה. בפרוטוקול זה, ערימת תמונות היא כ- 100 MB כל אחת לפני דחיסה.

איור 3: רכישת תמונה. (א) מכשיר הדמיה עם חלקים המסומנים כדלקמן: א) גוף מצלמת DSLR; ב) עדשת טלפוטו; ג) 20x Apo מיקרוסקופ מטרה ומתאם; ד) פלאש; ה) מפזרי עדשה וכיפה; ו) בקר Stackshot, מסילת מאקרו ושלב סיבובי; ז) גימבל במה אוניברסלי; ח) חצובה. (B) מכשיר הדמיה עם מפזר אור במקומו. (C) צילום תקריב של דגימה רכובה במקומה לצורך הדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. זרימת עבודה לניתוח FIJI לחישוב אזור העיניים למבוגרים

1. לניתוח תמונות, השג את תוכנת FIJI¹⁵ מאתר האינטרנט של ImageJ.net.
2. בחר תמונות לניתוח שבהן העין ממורכזת ומיושרת עם תאורה מתאימה וטשטוש היקפי מינימלי, המציין יישור נכון עם המצלמה.
3. כייל את קנה המידה של התמונה.
   1. הורד את תמונת סרגל קנה המידה להגדלה של 20x המתאימה ל- 500 מיקרומטר. לחלופין, בזמן רכישת התמונה, צלם סרגל באמצעות אותן הגדרות. פתח את התמונה בתוכנת FIJI.
   2. מדדו את אורך סרגל קנה המידה (איור 4A). השתמש בכלי קו ישר כדי לעקוב אחר הקו במדויק. לחץ על נתח | למדוד. מרחק פיקסלים זה שווה ערך ל- 500 מיקרומטר (איור 4B).
   3. חישוב פיקסלים למיקרון. השתמש באפשרות זו כדי להמיר מדידות פיקסלים למדידות מיקרומטר.
4. פתחו את קובץ התמונה המוערם בפיג'י (איור 4C).
5. בחר זכוכית מגדלת מסרגל הכלים כדי להגדיל את אזור המיקוד. נסו למלא את המסך בעין ובקוטיקולה הקרובה של הראש (איור 4D).
6. בחר Freehand Select Tool מסרגל הכלים. שרטט את אזור הרשתית קרוב ככל האפשר, לפי קווי המתאר של השורה החיצונית ביותר של אומטידיה (איור 4E). להסרת חלק מהבחירה, לחצו לחיצה ממושכת על לחצן האפשרויות ובחרו בפיקסלים להסרה. להוספה לבחירה, לחצו לחיצה ממושכת על לחצני האפשרויות וההזחה ובחרו בפיקסלים להוספה.
7. כדי לחשב את האזור, בחר נתח | מדידה מהתפריט העליון (איור 4F). יופיע חלון חדש עם פרמטרים של שטח, ממוצע, מינימום ומקסימום. העתק והדבק נתונים אלה בגיליון אלקטרוני לצורך תיעוד והמרה מפיקסלים למדידות מיקרומטר.
8. לבצע ניתוחים סטטיסטיים מתאימים.

איור 4: ניתוח תמונות בפיג'י. (A) שינוי קנה מידה של התמונה המקורית. הורד את תמונת הכיול ומדוד את אורך הסרגל של 500 מיקרומטר. (B) התאם את קנה המידה באמצעות הפונקציה Set Scale . (C) פתח את התמונה המוערמת. (D) הגדל את התמונה כך שהעין תהיה ממורכזת וכמעט מסך מלא. (E) השתמש בכלי בחירה חופשית כדי לשרטט את העין בגבול שבין השורה החיצונית ביותר של אומטידיה לבין הקוטיקולה שמסביב. (ו) מדידת האזור באזור שנבחר מחושבת על ידי לחיצה על נתח | מדידה | אזור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

עין דרוזופילה היא מערכת מודל מצוינת לחקר דפוסי רקמות, בקרת גדילה ומוות תאי. לאחרונה פרסמנו מחקר החוקר כיצד pH תוך-תאי (pHi) משפיע על צמיחת רקמות. ראשית, ביססנו מערכת גנטית שבה ביטוי יתר של מחליף נתרן-פרוטונים DNhe2 (האורתולוג של יונקים NHE1) בעין המתפתחת גורם למומים בדפו...

Discussion

כאן אנו מתארים שיטה להכנת דגימה, הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של מבני דרוזופילה בוגרים. עין הדרוזופילה היא מערכת מודל גנטית שהניבה תובנות קריטיות לגבי מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס מחלות כולל סרטן¹⁹, ניוון עצבי²⁰ ומחלות מטבוליות

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL serological pipette	ThermoFisher Scientific	170353N
1.7 mL microcentrifuge tubes	Genesee Scientific	24-282LR
20x Apo Microscope Objective	Mitutoyo Corp.	378-804-3
Archival 65 lb cardstock	Neenah, Inc.	91901
Canon EF 70-200 mm USM II telephoto lens	Canon	3044C002
Canon EOS 6D Mark II DSLR Camera Body	Canon	1897C002
Diffuser Dome	Macroscopic Solutions	PA-DIF-GIM-SM
Diffuser for Mitutoyo M Plan APO Objectives	Macroscopic Solutions	mitutoyo-diffusers
Drosophila vials and plugs	Genesee Scientific	32-117BF
Dumont #5 fine-tip forceps	Fisher Scientific	NC9889584
Goose feathers	Amazon	B01CMMJI6U
Heavy-Duty Anodized Aluminum Tripod	Really Right Stuff, LLC	TFA-32G
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	lint-free lab tissue
Levenhuk M1000 Plus Digital Camera	Levenhuk	70358
No. 3 mounting pin	Indigo Instruments	33414-3
Nutri-Fly Bloomington Drosophila media	Genesee Scientific	66-113	fly food
Point-Punch	M.C. Mieth Manufacturing, Inc.	448Detail
Screwknob Clamp	Really Right Stuff, LLC	SK-Clamp	For attaching the macro rail to the tripod
Stackshot Controller and Macro Rail	Cognisys Inc.	ST3X_100_BUNDLE
Step-down Ring Adapter	RAF Camera	763461174207	Lens adapter to connect the microscope objective to the camera lens
Titebond Glue	Franklin International	5013
Yongnuo YN-24-EX Macro Twin Lite Flash	Shenzhen Yongnuo Photographic Equipment Co.	YN-24EX
Software
Canon EOS Utility (v. 3.16.1).	Canon		acquisition software
FIJI	National Institutes of Health		Fiji is released as open source under the GNU General Public License.  FIJI Version 2.14.0/1.54f
GraphPad Prism	GraphPad Software, Boston, Massachusetts USA		Prism Version 10.3.1
Zerene Stacker (v.1.04)	Zerene Systems, LLC		Focus Stacking Software