외부 성체 초파리 구조의 정량화를 위한 빠르고 간단한 워크플로우

요약

여기에서는 패터닝 및 성장 결함을 정량화하기 위해 성인 초파리 눈의 고해상도 이미징을 위한 빠르고 저렴한 워크플로우를 제시합니다. 포인트 마운팅(point-mounting), 고해상도 이미지 획득(high-resolution image acquisition) 및 이미지 분석을 통한 시료 전처리를 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

초파리(Drosophila) 겹눈은 형태 형성을 주도하는 분자 메커니즘과 생물학적 과정을 밝혀낸 정밀한 패턴의 조직입니다. 그것은 유전적 상호 작용과 유전자 기능을 특성화하는 데 사용되는 ommatidia라고 하는 반복되는 단위 눈의 간단한 구조입니다. 눈 구조에 영향을 미치는 돌연변이는 쉽게 감지하고 분석할 수 있습니다. 따라서 이 시스템은 자원이 부족한 기관에서 자주 사용됩니다. 추가 표현형 분석에는 종종 정량 분석에 적합한 고배율 이미지를 생성하기 위해 주사 전자 현미경(SEM)이 포함됩니다. 그러나 SEM은 비용이 많이 들고 값비싼 시약이 필요합니다. 샘플 준비는 며칠에 걸쳐 진행됩니다. 또한 시료 준비 및 기기 유지보수를 위해 상근 직원이 필요한 경우가 많습니다. 이로 인해 자원이 부족한 기관이나 긴축 예산 기간 동안 유용성이 제한됩니다. 곤충학에서 고해상도 디지털 이미징 기술의 사용은 종의 식별 및 특성화를 위한 일반적인 관행입니다. 이 논문은 개방형 소프트웨어 ImageJ를 사용하여 성체 초파리 구조의 고해상도 디지털 이미징과 정량 분석을 가능하게 하는 전략을 결합하는 방법을 설명합니다. 이 워크플로우는 정량적 표현형 분석에 대한 비용 효율적이고 신속한 접근 방식을 통해 자금이 부족하고 자원이 부족한 연구 시설의 한계를 해결하는 빠르고 학생 친화적인 대안입니다.

서문

Drosophila melanogaster는 분자 신호 전달 경로와 세포 행동을 규명하기 위해 수십 년 동안 사용되어 온 강력한 유전자 모델 유기체입니다. 다세포 발달에 필수적인 진화적으로 보존된 많은 신호 전달 경로가 처음으로 확인되었고 그 작용 메커니즘이 초파리에서 정의되었습니다. 모든 인간 질병 관련 유전자의 약 65-75%는 Drosophila ^1,2에 ortholog를 가지고 있습니다. 성인 초파리 눈은 암 ^3,4, 신경 퇴행⁵ 및 대사 장애⁶를 포함한 인간 질병과 관련된 중요한 보존 유전자의 발견을 용이하게 하는 편견 없는 유전자 검사를 가능하게 한 중요한 모델입니다.

초파리의 눈은 옴마티디아(ommatidia)라고 불리는 ~800개의 눈들로 구성되어 있으며, 이들은 성인

프로토콜

1. 성인 초파리 수집 및 고정

1. Drosophila crosses를 설정하거나 균주를 선택하여 파리 먹이가 들어있는 바이알에 넣으십시오. 파리가 발달하고 성충이 닫힐 때까지(25°C에서 ~10-14일) 원하는 온도(보통 25°C)에서 바이알을 배양합니다.
2. CO₂ 로 파리를 마취하고 CO₂ 패드에 놓습니다.
3. 깃털로 파리를 분류하고 원하는 표현형(예: 직선 날개)을 가진 개체를 선택합니다. 1mL 혈청학적 피펫의 가늘어진 끝 부분에 맞게 거위 깃털을 다듬어 깃털 파리 분류기를 만듭니다.
4. 1.7% 에탄올 1mL가 든 70mL 미세 원심분리기 튜브를 준비합니다. 선택한 파리를 마이크로 원심 분리기 튜브에 넣고 얼음에 넣으십시오. 마이크로 원심분리기 튜브를 4°C에서 밤새 보관합니다(그림 2A).
   알림: 파리를 에탄올에 24시간 이상 보존하지 마십시오. 70% 에탄올에 파리를 장기간 보관하면 눈과 신체 색소가 손실됩니다.

2. 포인트 마....

결과

Drosophila eye는 조직 패턴화, 성장 조절 및 세포 사멸을 연구하기 위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 당사는 최근 세포 내 pH(pHi)가 조직 성장에 어떤 영향을 미치는지 조사한 연구를 발표했습니다. 첫째, 발달 중인 눈에서 나트륨-양성자 교환기 DNhe2(포유류 NHE1의 ortholog)의 과발현이 패턴 결함을 유발하고 증식을 증가시키는 유전 시스템을 확립했다^16.......

토론

여기에서는 시료 전처리, 고분해능 이미징 및 성체 초파리 구조 분석을 위한 방법을 설명합니다. 초파리 눈은 유전적으로 다루기 쉬운 모델 시스템으로, 암¹⁹, 신경 퇴행²⁰ 및 대사 질환²¹을 포함한 질병의 기저에 있는 분자 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 특히, 암환자 "아바타(avatar)"는 종?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL serological pipette	ThermoFisher Scientific	170353N
1.7 mL microcentrifuge tubes	Genesee Scientific	24-282LR
20x Apo Microscope Objective	Mitutoyo Corp.	378-804-3
Archival 65 lb cardstock	Neenah, Inc.	91901
Canon EF 70-200 mm USM II telephoto lens	Canon	3044C002
Canon EOS 6D Mark II DSLR Camera Body	Canon	1897C002
Diffuser Dome	Macroscopic Solutions	PA-DIF-GIM-SM
Diffuser for Mitutoyo M Plan APO Objectives	Macroscopic Solutions	mitutoyo-diffusers
Drosophila vials and plugs	Genesee Scientific	32-117BF
Dumont #5 fine-tip forceps	Fisher Scientific	NC9889584
Goose feathers	Amazon	B01CMMJI6U
Heavy-Duty Anodized Aluminum Tripod	Really Right Stuff, LLC	TFA-32G
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	lint-free lab tissue
Levenhuk M1000 Plus Digital Camera	Levenhuk	70358
No. 3 mounting pin	Indigo Instruments	33414-3
Nutri-Fly Bloomington Drosophila media	Genesee Scientific	66-113	fly food
Point-Punch	M.C. Mieth Manufacturing, Inc.	448Detail
Screwknob Clamp	Really Right Stuff, LLC	SK-Clamp	For attaching the macro rail to the tripod
Stackshot Controller and Macro Rail	Cognisys Inc.	ST3X_100_BUNDLE
Step-down Ring Adapter	RAF Camera	763461174207	Lens adapter to connect the microscope objective to the camera lens
Titebond Glue	Franklin International	5013
Yongnuo YN-24-EX Macro Twin Lite Flash	Shenzhen Yongnuo Photographic Equipment Co.	YN-24EX
Software
Canon EOS Utility (v. 3.16.1).	Canon		acquisition software
FIJI	National Institutes of Health		Fiji is released as open source under the GNU General Public License.  FIJI Version 2.14.0/1.54f
GraphPad Prism	GraphPad Software, Boston, Massachusetts USA		Prism Version 10.3.1
Zerene Stacker (v.1.04)	Zerene Systems, LLC		Focus Stacking Software