Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تنظير الشعيرات الدموية هو أداة يمكن الوصول إليها للتصور المباشر وغير المكلف وغير الجراحي للأوعية الدموية الدقيقة. الهدف من هذا البروتوكول هو تمكين الباحثين من استخدام تنظير الشعيرات الدموية لتصور مورفولوجيا الأوعية الدموية الدقيقة المحيطية في أظافر الفئران.

Abstract

أكد تصوير شبكات الشعيرات الدموية الدقيقة للجلد لدى البشر باستخدام تنظير الشعيرات الدموية (NFC) على أهمية دوران الأوعية الدقيقة كنظام عضو مستهدف في الأمراض الجهازية الحرجة. يتم تطبيق تنظير الشعيرات الدموية سريريا للكشف عن الخلل الوظيفي والتشوهات في الأوعية الدموية الدقيقة الطرفية في مجموعة من الحالات الجهازية ، بما في ذلك اضطرابات الروماتيزم والقلب والعينية (مثل الجلوكوما) والغدد الصماء (على سبيل المثال ، ارتفاع ضغط الدم وداء السكري). NFC مفيد ليس فقط في الكشف عن اضطراب الأوعية الدموية الدقيقة الجهازية المحيطية ولكن أيضا في تقييم فعالية الدواء. ومع ذلك ، فإن ترجمة نتائج NFC السريرية إلى نماذج الأمراض الحيوانية قد يكون أمرا صعبا. غالبا ما يكون الكشف عن الخلل الوظيفي أو التشوهات في الأوعية الدموية الدقيقة في غازيا (على سبيل المثال ، بالمنظار) ، أو يتم إجراؤه خارج الجسم الحي (على سبيل المثال ، التصوير بعد الوفاة للأنسجة) ، أو مكلف ، ويتطلب معدات متخصصة مثل تلك المستخدمة في التصوير المقطعي الدقيق وتقنيات التصوير الضوئي الصوتي. هناك ما يبرر تطوير تقنيات سريعة وغير جراحية وغير مكلفة لتصوير الأوعية الدموية الدقيقة المحيطية في النماذج الحيوانية للأمراض لتقليل نفقات البحث وزيادة قابلية الترجمة إلى العيادة.

تم استخدام تنظير الشعيرات الدموية سابقا لتصور الأوعية الدموية الدقيقة في النماذج الحيوانية ، بما في ذلك خنازير غينيا والفئران ، مما يدل على قدرة تنظير الشعيرات الدموية كأداة تصوير غير جراحية في النماذج الحيوانية. توفر هذه الدراسة بروتوكولا يطبق تنظير الشعيرات الدموية على فأر مسمر ، مما يسمح للباحثين بتقييم مورفولوجيا الأوعية الدموية الدقيقة بسهولة وبتكلفة زهيدة. يتم توفير صور تمثيلية لبنية الأوعية الدموية الدقيقة النموذجية في الفئران البرية باستخدام سلالتين معمليتين شائعتين الاستخدام ، SV129 / S6 و C57 / B6J. تعد الدراسات الإضافية باستخدام هذه الطريقة ضرورية لتطبيق تنظير الشعيرات الدموية على مجموعة واسعة من نماذج أمراض الفئران مع تشوهات الأوعية الدموية الدقيقة المحيطية.

Introduction

سلط تصوير شبكات الشعيرات الدموية الدقيقة المحيطية في البشر باستخدام تنظير الشعيرات الدموية العصبية (NFC) الضوء على أهمية دوران الأوعية الدقيقة كنظام عضو مستهدف في مجموعة واسعة من الأمراض الجهازية1. يتضمن التنظير الشعري استخدام مجهر لتكبير وتصور الأوعية في طية الظفر في الجسم الحي. على هذا النحو ، فهي تقنية تستخدم على نطاق واسع في العيادة للكشف عن الخلل الوظيفي والتشوهات في الأوعية الدموية الدقيقة الطرفية في مجموعة من الحالات الجهازية ، بما في ذلك الروماتيزم2،3 ، والقلب4 ، والعينية (على سبيل المثال ، الجلوكوما) 5،6 ، وأمراض الغدد الصماء (على سبيل المثال ، ارتفاع ضغط الدم والسكري7،8). يتم اكتشاف التغيرات المورفولوجية في الشعيرات الدموية في أظافر ، بما في ذلك النزيف ، وزيادة التواء الأوعية الدموية ، والمناطق اللاوعائية ، بسهولة باستخدام NFC. تمثل هذه التشوهات المورفولوجية عمليات مرضية مثل إعادة تشكيل الأوعية الدموية الدقيقة المفرطة أو الناقصة9،10. NFC هي أداة تشخيصية مفيدة للكشف عن هذه الأمراض. بالإضافة إلى ذلك ، هذه التقنية مفيدة في تقييم فعالية الدواء11.

ومع ذلك ، فإن ترجمة نتائج NFC السريرية إلى نماذج حيوانية للمرض يمثل تحديا لأسباب عديدة. عادة ما يكون تصور الأوعية الدموية الدقيقة في غازيا (على سبيل المثال ، بالمنظار) ، ويتم إجراؤه خارج الجسم الحي (على سبيل المثال ، تصوير الأنسجة بعد الوفاة) ، أو مكلف ، ويتطلب معدات متخصصة مثل التصوير المقطعي المحوسب12،13 ، وتصوير الأوعية الدموية بالتصوير المقطعي المتماسك14 ، وتقنيات التصوير الضوئيالصوتي 15. نظرا لأن أمراض الأوعية الدموية الدقيقة المحيطية واضحة في مجموعة واسعة من أمراض الجهاز العصبي الجهازي والمركزي ، بما في ذلك احتشاء عضلة القلب16 ، وارتفاع ضغطالدم 17 ، والانحطاط العصبي المرتبط بالعمر في الجهاز العصبي المركزي مثل مرض الزهايمر18 ، والاعتلالات العصبية البصرية مثل الجلوكوما19 ، فإن تقنية التصور غير الغازية والفعالة من حيث التكلفة في الجسم الحي مفيدة للغاية.

تم استخدام تنظير الشعيرات الدموية لتقييم الأوعية الدموية الدقيقة في النماذج الحيوانية ، بما في ذلك خنازير غينيا20 والفئران21 ، مما يدل على قدرته كأداة تصوير غير جراحية. هنا ، نقوم بتطبيق تنظير الشعيرات الدموية على جزء مختلف من الظفر ، المسمار. من خلال تسخير شفافية مسمار الفأر ، يقدم تنظير الشعيرات الدموية المسامير موقعا جديدا لتصور الأوعية الدموية الدقيقة المحيطية. بالمقارنة مع NFC ، وهو مفيد بشكل خاص لمراقبة حركة خلايا الدم21،22 ، يوفر بروتوكول تنظير الشعيرات الدموية المصغر الموصوف هنا مساحة أكبر لمراقبة أفضل لمورفولوجيا الأوعية الدموية الدقيقة وهيكلها. نحن نقدم بروتوكولا يسمح للباحثين بتقييم مورفولوجيا الأوعية الدموية الدقيقة ذات المسمار بالفئران بسهولة وبتكلفة زهيدة ، وهو موقع جديد لتصوير الأوعية الدموية المحيطية غير الغازية. يوفر هذا البروتوكول صورا تمثيلية لبنية الأوعية الدموية الدقيقة النموذجية في الفئران البرية باستخدام سلالتين معمليتين شائعتين الاستخدام (SV129 / S6 و C57 / B6J). نظهر أن تنظير الشعيرات الدموية المسمورة هو طريقة تصوير الأوعية الدموية الدقيقة غير المكلفة وغير الغازية. ستكون الدراسات الإضافية باستخدام هذه الطريقة الاستكشافية ضرورية لتطبيق تنظير الشعيرات الدموية على مجموعة واسعة من نماذج الفئران للأمراض حيث تكون تشوهات الأوعية الدموية الدقيقة المحيطية واضحة في علم الأمراض.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في المركز الطبي بجامعة فاندربيلت ومستشفى ماساتشوستس العام.

1. تحضير أظافر الفئران للتصوير

ملاحظة: للحصول على صفاء مثالي للأوعية واستعادة الجلد ، اتركيه لمدة 24 ساعة على الأقل قبل التصوير.

  1. لتمكين التصوير دون عائق لأظافر الفئران ، قم بإزالة الفراء من أقدام القوارض قبل 24 ساعة على الأقل من تصوير تنظير الشعيرات الدموية (الشكل 1 أ). لإزالة الفراء من أقدام الفأر ، اتبع الخطوات 1.1.1-1.1.6.
    1. تخدير باستخدام تخدير الأيزوفلوران المستنشق (2٪ إيزوفلوران في 5٪ ثاني أكسيد الكربون / 95٪ أكسجين). تأكد من تخدير الفأر بشكل كاف عن طريق الضغط على وسادة القدم على كلتا القدمين الخلفيتين. إذا تم تخديره بشكل صحيح ، فلا ينبغي أن تكون هناك حركة اهتزاز (منعكس سحب الدواسة). إذا كانت هناك حركة انعكاسية ، اترك الفأر مزيدا من الوقت تحت الأيزوفلوران ليصبح مخدرا بالكامل. أعد اختبار منعكس سحب الدواسة واستمر.
    2. بعد تخدير الفأر بشكل صحيح ، ضع جل العين المزلق أو مرهم العين المعقم غير الطبي على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية أثناء التخدير.
    3. الحفاظ على تحت التخدير باستخدام مخروط الأنف ، ضع كمية وفيرة من كريم إزالة الشعر على المخلب بالكامل باستخدام قضيب. احرص على تغطية المخلب بالكامل ومناطق التثبيت ، كما هو موضح في الشكل 1 ب.
    4. اتركي كريم إزالة الشعر على المخلب لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة (RT).
    5. نظف كريم إزالة الشعر بعناية عن طريق فركه برفق بمنديل نظيف.
    6. اغسل المخلب بالماء الفاتر والمعقم.
      ملاحظة: يجب أن تكون الكفوف خالية من الفراء والأظافر دون عائق للتصوير ، كما هو موضح في الشكل 1 ج.
    7. أعد الفأر إلى قفصه لضمان الشفاء الآمن من التخدير. لا تترك الفأر دون رقابة حتى يستعيد وعيه. بمجرد أن يستعيد الفأر وعيه ، أعده إلى القفص الأصلي بصحبة أخرى.

2. في الجسم الحي تصوير تنظير الشعيرات الدموية

  1. بعد ما لا يقل عن 24 ساعة من وقت التعافي بعد إزالة الفراء ، قم بإعداد معدات تنظير الشعيرات الدموية في غرفة يتم التحكم في درجة حرارتها (يتم الاحتفاظ بها بين 21.5-22.5 درجة مئوية) ، كما هو موضح في الشكل 2 أ. يتضمن الإعداد الكامل للتصوير المسامير 1) معدات تخدير الأيزوفلوران ، 2) مخروط أنف التخدير ، 3) مرحلة حيوانية قابلة للتعديل ، 4) مجهر تنظير الشعيرات الدموية ، و 5) جهاز كمبيوتر محمول مزود ببرنامج فيديو للتصوير.
  2. تخدير باستخدام تخدير الأيزوفلوران المستنشق (2٪ إيزوفلوران في 5٪ ثاني أكسيد الكربون / 95٪ أكسجين).
    1. تأكد من تخدير الفأر بشكل كاف عن طريق الضغط على وسادة القدم على كلتا القدمين الخلفيتين. إذا تم تخديره بشكل صحيح ، فلا ينبغي أن تكون هناك حركة اهتزاز (منعكس سحب الدواسة). إذا كانت هناك حركة انعكاسية ، فارجع إلى الخطوة 1.1.1 واترك الماوس مزيدا من الوقت للتخدير الكامل. ثم أعد اختبار منعكس سحب الدواسة واستمر.
    2. بعد تخدير الفأر بشكل صحيح ، ضع جل العين المزلق أو مرهم العين المعقم غير الطبي على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية أثناء التخدير.
  3. للحفاظ على تحت التخدير ، ضع جانب الأخمص الخلفي لأعلى أعلى منصة شريط المختبر أسفل الهدف ، كما هو موضح في الشكل 2 ب ، التكبير.
  4. انشر أصابع القدم برفق لفصل الأظافر تحت هدف المجهر باستخدام قضيب. تأكد من فصل أسطح المسامير عن بعضها البعض للحصول على تصوير الأمثل للأوعية.
    ملاحظة: يوضح الشكل 2C إعداد التصوير الكامل الذي يعرض صورة السفينة على برنامج فيديو الكمبيوتر المحمول.
  5. لتقليل الوهج وتحسين التركيز ، ضع زيت الغمر (زيت الذرة) بسخاء على المخلب ، مما يضمن تغطية كاملة للأظافر. أضف شريطا أبيض أو ما شابه ذلك أسفل مخلب الماوس لتحسين التباين وتحسين تصور قاع الوعاء (الشكل 3 ؛ السهم 3).
  6. ركز على الظفر الموجود على الرقم الثاني من المخلب الخلفي. في الفئران ، هذا هو أكبر مسمار وأسهل في التصوير. لتركيز مسمار الماوس ، استخدم أدوات ضبط المرحلة x و y (الشكل 3 ؛ السهم 4) وعجلة التكبير (حتى 280x على هذه الأداة ؛ الشكل 3 ؛ السهم 1).
  7. قم بتحويل الهدف لتقليل وضع الوهج لعرض شبكة أوعية الأظافر (الشكل 3 ؛ السهم 2).
    ملاحظة: إذا أصبح من الصعب رؤية الأوعية أو تم تمديد وقت التصوير ، فأعد وضع زيت الغمر بسخاء. الكفوف الخطية للفئران أصغر من الكفوف الخلفية. وبالتالي ، يوصى بإجراء التصوير على الكفوف الخلفية.
  8. قم بتوصيل منظار الشعيرات الدموية بجهاز كمبيوتر محمول عبر اتصال ناقل تسلسلي عالمي (USB).
  9. افتح تطبيق برنامج الفيديو الأول على الكمبيوتر المحمول.
    ملاحظة: تحقق من توصيل الجهاز بشكل صحيح بالكمبيوتر المحمول في الإعدادات.
  10. على شاشة الكمبيوتر المحمول ، تصور ما يتم تكبيره بواسطة منظار الشعيرات الدموية وركز على المسمار عن طريق ضبط أدوات ضبط المراحل x و y وعجلة التكبير للحصول على صورة واضحة.
  11. بمجرد تركيز المجهر ورؤية صورة واضحة لشبكة الأوعية الدموية في الغطاء المسمير ، قم بتسجيل مقطع فيديو بالضغط على زر التسجيل الأحمر في Debut أو برنامج فيديو مشابه (الشكل 2C).
  12. احفظ كل مقطع فيديو في مجلد المشروع المناسب وقم بتسمية كل مقطع فيديو وفقا لذلك.

3. حفظ الصور المسمرة

  1. افتح الفيديو المسامير في البرنامج واختر يدويا إطارا في الفيديو حيث تكون الأوعية في تركيز واضح.
  2. باستخدام أداة لقطة الشاشة على الكمبيوتر ، التقط لقطة شاشة لشاشة الفيديو الأولى التي تظهر الأوعية الدموية الواضحة في الظفر. حفظ الصورة.
  3. افتح صورة لقطة الشاشة في برنامج ImageJ بالنقر فوق ملف وفتح ؛ حدد الملف من المجلد الوجهة الخاص به.
  4. إذا لزم الأمر، اضبط السطوع والتباين عن طريق تحديد > Image > Adjust Brightness/Contrast. يمكن أن تساعد هذه الأداة في تغيير تباين الصور لتصور مورفولوجيا الوعاء بشكل أفضل.
  5. بمجرد ضبط الصورة، انقر فوق Set في أداة Brightness/Contrast .
  6. احفظ الصورة كملف TIFF بالنقر فوق ملف ثم حفظ باسم.

النتائج

باستخدام طريقة تنظير الشعيرات الدموية الموضحة هنا ، يمكن تصوير مورفولوجيا الأوعية الدموية المسامير بسهولة ، كما هو موضح في الشكل 4 أ. تظهر الأوعية الدموية النموذجية المسامير في الفأر ثلاث ميزات متسقة ، كما هو موضح في الشكل 4 ب: كل مسمار يح?...

Discussion

باختصار ، نقدم بروتوكولا يسمح للباحثين بتقييم مورفولوجيا الأوعية الدموية الدقيقة ذات المسمار بالفئران بسهولة وبتكلفة زهيدة ، وهو موقع جديد لتصوير الأوعية الدموية المحيطية غير الغازية. مثل طرق NFC المستخدمة في خنازير غينيا20 والفئران21 ، فإن الق?...

Disclosures

لا علاقة له بهذا العمل ، كان الدكتور باسكوال مستشارا مدفوع الأجر ل Twenty Twenty. لا علاقة لها بهذا العمل ، كلارا كوزينز هي مستشارة مدفوعة الأجر لشركة Cartography Biosciences. المؤلفون الآخرون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من خلال أموال الإدارات غير المقيدة الممنوحة إلى Lauren K. Wareham. يتم دعم الدكتور باسكوال من قبل مؤسسة الجلوكوما (NYC) وبمنحة تحدي غير مقيدة من Research to Prevention Blindness (NYC).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthetic Charcoal Filter CannisterReFreshEZ-258
Capillaroscope Jiahua Electronic Instrument Co., Jiangsu, ChinaJH-1004
Compressed gas (5% carbon dioxide, 95% oxygen)AirgasUN3156
Corn oilSigmaC8-267 
Debut video capture softwareDebutAvailable free online.
Eye spearsBVI Weck- Cel0008680For application and removal of hair removal cream.
Hair removal creamNair 610370323649
Isoflurane 250 mL bottlePiramal critical careNDC  6679401725
Lab jack Fisherbrand14-673-52Used as a platform to hold the mouse.
Nose cone (low profile anesthesia mask)Kent ScientificSOMNO-0801
Transfer pipettesFisherbrand13-711-9AMApply corn oil generously to mouse paw as an immersion oil.
USB Video capture cardVIXLWBR116
VetequipVWR89012-492Isoflurane equipment
White labeling tape Fisherbrand15-958Used to create a white/contrasting background under mouse paw when taking images.

References

  1. El Miedany, Y., Ismail, S., Wadie, M., Hassan, M. Nailfold capillaroscopy: tips and challenges. Clin Rheumatol. 41 (12), 3629-3640 (2022).
  2. Etehad Tavakol, M., Fatemi, A., Karbalaie, A., Emrani, Z., Erlandsson, B. -. E. Nailfold capillaroscopy in rheumatic diseases: Which parameters should be evaluated. BioMed Res Int. 2015 (1), 974530 (2015).
  3. Cutolo, M., Smith, V. Detection of microvascular changes in systemic sclerosis and other rheumatic diseases. Nat Rev Rheumatol. 17 (11), 665-677 (2021).
  4. Lim, M. W. S., et al. Nailfold video-capillaroscopy in the study of cardiovascular disease: a systematic review. Blood Press Monit. 28 (1), 24-32 (2023).
  5. Philip, S., Najafi, A., Tantraworasin, A., Pasquale, L. R., Ritch, R. Nailfold capillaroscopy of resting peripheral blood flow in exfoliation glaucoma and primary open-angle glaucoma. JAMA Ophthalmol. 137 (6), 618-625 (2019).
  6. Taniguchi, E. V., et al. Peripheral microvascular abnormalities associated with open-angle glaucoma. Ophthalmol Glaucoma. 6 (3), 291-299 (2023).
  7. Maldonado, G., Guerrero, R., Paredes, C., Ríos, C. Nailfold capillaroscopy in diabetes mellitus. Microvasc Res. 112, 41-46 (2017).
  8. Gurfinkel, Y. I., Sasonko, M., Priezzhev, A. Digital capillaroscopy as important tool for early diagnostics of arterial hypertension Proc. SPIE 9448, Saratov Fall Meeting 2014: Optical Technologies in Biophysics and Medicine XVI; Laser Physics and Photonics XVI; and Computational Biophysics. , 944804 (2015).
  9. Santamaría, R., González-Álvarez, M., Delgado, R., Esteban, S., Arroyo, A. G. Remodeling of the microvasculature: May the blood flow be with you. Front Physiol. 11, 586852 (2020).
  10. Pries, A. R., Secomb, T. W. Making microvascular networks work: angiogenesis, remodeling, and pruning. Physiology. 29 (6), 446-455 (2014).
  11. Cutolo, M., Smith, V. State of the art on nailfold capillaroscopy: a reliable diagnostic tool and putative biomarker in rheumatology. Rheumatology. 52 (11), 1933-1940 (2013).
  12. Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282 (5), R1267-R1279 (2002).
  13. Zagorchev, L., et al. Micro computed tomography for vascular exploration. J Angiogenes Res. 2, 7 (2010).
  14. Untracht, G. R., et al. Pilot study of optical coherence tomography angiography-derived microvascular metrics in hands and feet of healthy and diabetic people. Sci Rep. 13 (1), 1122 (2023).
  15. Mirg, S., Turner, K. L., Chen, H., Drew, P. J., Kothapalli, S. -. R. Photoacoustic imaging for microcirculation. Microcirculation. 29 (6-7), e12776 (2022).
  16. Gkontra, P., et al. Dynamic changes in microvascular flow conductivity and perfusion after myocardial infarction shown by image-based modeling. J Am Heart Assoc. 8 (7), e011058 (2019).
  17. Laurent, S., Agabiti-Rosei, C., Bruno, R. M., Rizzoni, D. Microcirculation and macrocirculation in hypertension: A dangerous cross-link. Hypertension. 79 (3), 479-490 (2022).
  18. Kisler, K., Nelson, A. R., Montagne, A., Zlokovic, B. V. Cerebral blood flow regulation and neurovascular dysfunction in Alzheimer disease. Nat Rev Neurosci. 18 (7), 419-434 (2017).
  19. Wareham, L. K., Calkins, D. J. The neurovascular unit in glaucomatous neurodegeneration. Front Cell Dev Biol. 8, 452 (2020).
  20. Mandujano, A., Golubov, M. Animal models of systemic sclerosis: using nailfold capillaroscopy as a potential tool to evaluate microcirculation and microangiopathy: a narrative review. Life. 12 (5), 703 (2022).
  21. Kim, M. Nail fold capillaroscopy as a potential tool to evaluate breast tumor. J Anal Sci Technol. 15 (1), 35 (2024).
  22. McKay, G. N., et al. Visualization of blood cell contrast in nailfold capillaries with high-speed reverse lens mobile phone microscopy. Biomed Opt Express. 11 (4), 2268-2276 (2020).
  23. Zhang, X., Qian, X., Tao, C., Liu, X. In vivo imaging of microvasculature during anesthesia with high-resolution photoacoustic microscopy. Ultrasound Med Biol. 44 (5), 1110-1118 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

SV129 S6 C57 B6J

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved