Visualização não invasiva da morfologia microvascular do leito ungueal em camundongos usando capilaroscopia

Resumo

A capilaroscopia é uma ferramenta acessível para visualização direta, barata e não invasiva da microvasculatura. O objetivo deste protocolo é permitir que os pesquisadores usem a capilaroscopia para a visualização da morfologia microvascular periférica nos leitos ungueais de camundongos.

Resumo

A imagem das redes microcapilares da pele em humanos usando capilaroscopia ungueal (NFC) ressaltou a importância da microcirculação como um sistema de órgãos-alvo em doenças sistêmicas críticas. A capilaroscopia periungueal é aplicada clinicamente para detectar disfunção microvascular periférica e anormalidades em uma variedade de condições sistêmicas, incluindo distúrbios reumáticos, cardíacos, oculares (por exemplo, glaucoma) e endócrinos (por exemplo, hipertensão e diabetes mellitus). A NFC é útil não apenas na detecção de ruptura da microvasculatura sistêmica periférica, mas também na avaliação da eficácia do medicamento. No entanto, traduzir os achados clínicos da NFC para modelos de doenças animais pode ser um desafio. A detecção de disfunção ou anormalidades microvasculares em animais é frequentemente invasiva (por exemplo, endoscópica), realizada ex vivo (por exemplo, imagem post-mortem de tecidos) ou cara, exigindo equipamentos especializados, como os usados em técnicas de microtomografia computadorizada e imagem fotoacústica. O desenvolvimento de técnicas rápidas, não invasivas e baratas para obter imagens da microvasculatura periférica em modelos animais de doenças é necessário para diminuir as despesas de pesquisa e aumentar a traduzibilidade para a clínica.

A capilaroscopia já foi usada para visualizar a microvasculatura da dobra ungueal em modelos animais, inclusive em cobaias e camundongos, demonstrando assim a capacidade da capilaroscopia como uma ferramenta de imagem não invasiva em modelos animais. Este estudo fornece um protocolo que aplica capilaroscopia a um leito ungueal de camundongo, permitindo que os pesquisadores avaliem de forma fácil e barata a morfologia de sua microvasculatura. São fornecidas imagens representativas da arquitetura microvascular típica do leito ungueal em camundongos do tipo selvagem usando duas cepas de laboratório comumente usadas, SV129 / S6 e C57 / B6J. Novos estudos usando esse método são essenciais para a aplicação da capilaroscopia do leito ungueal a uma ampla gama de modelos de doenças de camundongos com anormalidades microvasculares periféricas.

Introdução

A imagem de redes microcapilares periféricas em humanos usando capilaroscopia periungueal (NFC) destacou a importância da microcirculação como um sistema de órgãos-alvo em uma ampla gama de doenças sistêmicas¹. A capilaroscopia envolve o uso de um microscópio para ampliar e visualizar vasos na dobra ungueal in vivo. Como tal, é uma técnica amplamente utilizada na clínica para detectar disfunções microvasculares periféricas e anormalidades em uma variedade de condições sistêmicas, incluindo doenças reumáticas ^2,3, cardíacas⁴, oculares (por exemplo, glaucoma)^5,6 e endócrinas (por exemplo, hipertensão e diabetes mellitus ^7,8). Alterações morfológicas nos capilares da dobra ungueal, incluindo hemorragias, aumento da tortuosidade do vaso e regiões avasculares, são prontamente detectadas usando NFC. Essas anormalidades morfológicas representam processos patológicos, como remodelação microvascular excessiva ou deficiente ^9,10. A NFC é uma ferramenta de diagnóstico útil para detectar essas patologias. Além disso, essa técnica é útil na avaliação da eficácia dos medicamentos¹¹.

No entanto, traduzir os achados clínicos da NFC para modelos animais de doença é um desafio por vários motivos. A visualização da microvasculatura em animais é tipicamente invasiva (por exemplo, endoscópica), realizada ex vivo (por exemplo, imagem post-mortem de tecidos) ou cara, exigindo equipamentos especializados, como tomografia computadorizada^12,13, angiografia por tomografia de coerência¹⁴ e técnicas de imagem fotoacústica¹⁵. Como a patologia microvascular periférica é evidente em uma ampla gama de doenças sistêmicas e do sistema nervoso central, incluindo infarto do miocárdio¹⁶, hipertensão¹⁷, neurodegenerações do sistema nervoso central relacionadas à idade, como a doença de Alzheimer¹⁸ e neuropatias ópticas, como glaucoma¹⁹, uma técnica de visualização in vivo não invasiva e econômica é altamente benéfica.

A capilaroscopia tem sido utilizada para avaliar a microvasculatura periungueal em modelos animais, incluindo cobaias²⁰ e camundongos²¹, demonstrando assim sua capacidade como ferramenta de imagem não invasiva. Aqui, aplicamos capilaroscopia em uma parte diferente da unha, o leito ungueal. Aproveitando a transparência da unha do camundongo, a capilaroscopia ungueal introduz um novo local para a visualização da microvasculatura periférica. Em comparação com o NFC, que é particularmente útil para monitorar o movimento das células sanguíneas^21,22, o protocolo de capilaroscopia do leito ungueal descrito aqui fornece uma área maior para melhor observação da morfologia e estrutura microvascular. Fornecemos um protocolo que permite aos pesquisadores avaliar de forma fácil e barata a morfologia da microvasculatura do leito ungueal de camundongos, que é um novo local para imagens vasculares periféricas não invasivas. Este protocolo fornece imagens representativas da arquitetura microvascular típica do leito ungueal em camundongos do tipo selvagem usando duas cepas de laboratório comumente usadas (SV129 / S6 e C57 / B6J). Mostramos que a capilaroscopia do leito ungueal é uma modalidade de imagem microvascular barata e não invasiva. Estudos adicionais usando este método exploratório serão essenciais para aplicar a capilaroscopia do leito ungueal a uma ampla gama de modelos de doenças em camundongos, onde anormalidades microvasculares periféricas são evidentes na patologia.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Centro Médico da Universidade Vanderbilt e do Hospital Geral de Massachusetts.

1. Preparação de unhas de camundongo para imagem

NOTA: Para obter a clareza ideal do vaso e a recuperação da pele, aguarde pelo menos 24 horas antes da imagem.

1. Para permitir a imagem desobstruída dos leitos ungueais dos ratos, remova o pelo das patas dos roedores pelo menos 24 h antes da capilaroscopia (Figura 1A). Para remover o pelo das patas do rato, siga os passos 1.1.1-1.1.6.
   1. Sedar o animal usando anestesia inalatória com isoflurano (isoflurano a 2% em dióxido de carbono a 5%/oxigênio a 95%). Confirme se o mouse está adequadamente anestesiado apertando a almofada do pé em ambas as patas traseiras. Se devidamente anestesiado, não deve haver movimento brusco (reflexo de retirada do pedal). Se houver um movimento reflexo, permita que o camundongo fique totalmente anestesiado por mais tempo sob isoflurano. Teste novamente o reflexo de retirada do pedal e continue.
   2. Depois que o camundongo estiver devidamente anestesiado, aplique um gel lubrificante para os olhos ou pomada oftálmica não medicamentosa estéril em ambos os olhos para evitar o ressecamento da córnea durante a anestesia.
   3. Mantendo o animal sob anestesia usando um cone nasal, aplique uma quantidade generosa de creme depilatório em toda a pata usando um aplicador. Tome cuidado para cobrir todas as áreas da pata e do leito ungueal, conforme mostrado na Figura 1B.
   4. Deixe o creme depilatório na pata por 2 min em temperatura ambiente (RT).
   5. Limpe cuidadosamente o creme depilatório, esfregando-o suavemente com um lenço de papel limpo.
   6. Lave a pata em água morna e estéril.
      NOTA: As patas devem estar livres de pelos e unhas desobstruídas para a obtenção de imagens, conforme mostrado na Figura 1C.
   7. Retorne o mouse à gaiola para garantir uma recuperação segura da anestesia. Não deixe o mouse sem vigilância até que ele recupere a consciência. Assim que o rato recuperar a consciência, devolva-o à gaiola original com a companhia de outros animais.

2. Imagem de capilaroscopia de leito ungueal in vivo

1. Após um tempo mínimo de recuperação de 24 h após a remoção do pelo, instale o equipamento de capilaroscopia em uma sala com temperatura controlada (mantida entre 21,5-22,5 °C), conforme mostrado na Figura 2A. A configuração completa para imagens do leito ungueal inclui 1) equipamento de anestesia com isoflurano, 2) um cone nasal de anestesia, 3) um estágio animal ajustável, 4) um microscópio capilar e 5) um laptop com software de vídeo para imagens.
2. Sedar o animal usando anestesia inalatória com isoflurano (isoflurano a 2% em dióxido de carbono a 5%/oxigênio a 95%).
   1. Confirme se o mouse está adequadamente anestesiado apertando a almofada do pé em ambas as patas traseiras. Se devidamente anestesiado, não deve haver movimento brusco (reflexo de retirada do pedal). Se houver um movimento reflexo, retorne à etapa 1.1.1 e aguarde mais tempo para que o mouse seja totalmente anestesiado. Em seguida, teste novamente o reflexo de retirada do pedal e continue.
   2. Depois que o camundongo estiver devidamente anestesiado, aplique gel lubrificante para os olhos ou pomada oftálmica não medicamentosa estéril em ambos os olhos para evitar o ressecamento da córnea durante a anestesia.
3. Mantendo o animal sob sedação, posicione o lado volar da pata traseira para cima em cima da plataforma de fita de laboratório abaixo da objetiva, conforme mostrado na Figura 2B, zoom.
4. Espalhe os dedos dos pés suavemente para separar as unhas sob a objetiva do microscópio usando um aplicador. Certifique-se de que os leitos ungueais estejam separados uns dos outros para obter imagens ideais do vaso.
   NOTA: A Figura 2C mostra a configuração completa da imagem mostrando a imagem do vaso no software de vídeo do laptop.
5. Para reduzir o brilho e melhorar o foco, aplique generosamente óleo de imersão (óleo de milho) na pata, garantindo a cobertura completa das unhas. Adicione fita branca ou similar sob a pata do rato para aumentar o contraste e melhorar a visualização do leito do vaso (Figura 3; seta 3).
6. Concentre-se na unha no segundo dedo da pata traseira; Em camundongos, esta é a unha maior e mais fácil de visualizar. Para focar a unha do mouse, use os ajustadores de estágio x e y (Figura 3; seta 4) e a roda de ampliação (até 280x neste instrumento; Figura 3; seta 1).
7. Gire a objetiva para reduzir o posicionamento do brilho para trazer a rede de vasos ungueais à vista (Figura 3; seta 2).
   NOTA: Se os vasos se tornarem difíceis de ver ou o tempo de imagem se tornar estendido, reaplique generosamente o óleo de imersão. As patas dos ratos são menores que as traseiras; Assim, recomenda-se que a imagem seja realizada nas patas traseiras.
8. Conecte o capilaroscópio a um laptop por meio de uma conexão USB (barramento serial universal).
9. Abra o aplicativo de software de vídeo Debut no laptop.
   NOTA: Verifique se o dispositivo está conectado corretamente ao laptop nas configurações.
10. Na tela do laptop, visualize o que está sendo ampliado pelo capilaroscópio e concentre-se no leito ungueal ajustando os ajustadores de estágio x e y e a roda de ampliação para obter uma imagem nítida.
11. Assim que o microscópio estiver focado e uma imagem clara da rede de vasos no leito ungueal for vista, grave um vídeo pressionando o botão vermelho de gravação no Debut ou em um programa de software de vídeo semelhante (Figura 2C).
12. Salve cada vídeo na pasta do projeto apropriada e rotule cada vídeo de acordo.

3. Salvando imagens de leito ungueal

1. Abra o vídeo do leito ungueal no software e escolha manualmente um quadro no vídeo em que os vasos estejam em foco claro.
2. Usando a ferramenta Captura de tela no computador, faça uma captura de tela da tela de vídeo de estreia mostrando a vasculatura clara na unha. Salve a imagem.
3. Abra a imagem da captura de tela no software ImageJ clicando em Arquivo e Abrir; Selecione o arquivo em sua pasta de destino.
4. Se necessário, ajuste o brilho e o contraste selecionando Imagem > Ajustar > Brilho/Contraste. Essa ferramenta pode ajudar a alterar o contraste das imagens para visualizar melhor a morfologia do vaso.
5. Depois que a imagem for ajustada, clique em Definir na ferramenta Brilho/Contraste .
6. Salve a imagem como um arquivo TIFF clicando em Arquivo e depois em Salvar como.

Resultados

Usando o método de capilaroscopia descrito aqui, a morfologia vascular do leito ungueal pode ser facilmente visualizada, conforme mostrado na Figura 4A. A vasculatura ungueal típica em um camundongo exibe três características consistentes, conforme destacado na Figura 4B: cada leito ungueal tem 1) um vaso aferente, 2) um vaso eferente e 3) uma rede de capilares conectando os vasos aferentes e eferentes. Para demonstrar a con...

Discussão

Em resumo, fornecemos um protocolo que permite aos pesquisadores avaliar de forma fácil e barata a morfologia da microvasculatura do leito ungueal de camundongo, um novo local para imagens vasculares periféricas não invasivas. Como os métodos NFC usados em cobaias²⁰ e camundongos²¹, a principal força do protocolo descrito aqui é que ele permite uma avaliação rápida e não invasiva da microvasculatura periférica em modelos de camun...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic Charcoal Filter Cannister	ReFresh	EZ-258
Capillaroscope	Jiahua Electronic Instrument Co., Jiangsu, China	JH-1004
Compressed gas (5% carbon dioxide, 95% oxygen)	Airgas	UN3156
Corn oil	Sigma	C8-267
Debut video capture software	Debut		Available free online.
Eye spears	BVI Weck- Cel	0008680	For application and removal of hair removal cream.
Hair removal cream	Nair	610370323649
Isoflurane 250 mL bottle	Piramal critical care	NDC  6679401725
Lab jack	Fisherbrand	14-673-52	Used as a platform to hold the mouse.
Nose cone (low profile anesthesia mask)	Kent Scientific	SOMNO-0801
Transfer pipettes	Fisherbrand	13-711-9AM	Apply corn oil generously to mouse paw as an immersion oil.
USB Video capture card	VIXLW	BR116
Vetequip	VWR	89012-492	Isoflurane equipment
White labeling tape	Fisherbrand	15-958	Used to create a white/contrasting background under mouse paw when taking images.