使用毛细血管镜检查小鼠甲床微血管形态的无创可视化

摘要

毛细血管镜检查是一种可访问的工具，用于直接、廉价和无创地观察微血管系统。该协议的目标是使研究人员能够使用毛细血管镜检查来可视化小鼠甲床中的外周微血管形态。

摘要

使用甲襞毛细血管镜检查 （NFC） 对人体皮肤的微毛细血管网络进行成像，强调了微循环作为危重全身性疾病中靶器官系统的重要性。甲襞毛细血管镜检查在临床上用于检测外周微血管功能障碍和一系列全身性疾病的异常，包括风湿性、心脏、眼部（例如青光眼）和内分泌疾病（例如高血压和糖尿病）。NFC 不仅可用于检测外周全身微血管系统破坏，还可用于评估药物疗效。然而，将临床 NFC 发现转化为动物疾病模型可能具有挑战性。检测动物的微血管功能障碍或异常通常是侵入性的（例如，内窥镜），在 体外 进行（例如，组织的尸检成像）或昂贵的，需要专门的设备，例如用于显微计算机断层扫描和光声成像技术的设备。开发快速、无创且廉价的技术来对疾病动物模型中的外周微血管系统进行成像，以减少研究费用并提高对临床的可转化性。

毛细血管镜检查以前已被用于在动物模型（包括豚鼠和小鼠）中可视化甲襞微血管系统，从而证明了毛细血管镜检查在动物模型中作为非侵入性成像工具的能力。本研究提供了一种将毛细血管镜检查应用于小鼠甲床的方案，使研究人员能够轻松且廉价地评估其微血管系统的形态。提供了使用两种常用实验室菌株 SV129/S6 和 C57/B6J 的野生型小鼠典型甲床微血管结构的代表性图像。使用这种方法的进一步研究对于将甲床毛细血管镜检查应用于具有外周微血管异常的各种小鼠疾病模型至关重要。

引言

使用甲襞毛细血管镜检查 （NFC） 对人类的外周微毛细血管网络进行成像，突出了微循环作为各种全身性疾病中靶器官系统的重要性¹。毛细血管镜检查涉及使用显微镜在体内放大和观察甲襞中的血管。因此，它是临床上广泛使用的一种技术，用于检测一系列全身性疾病中的外周微血管功能障碍和异常，包括风湿性 ^2,3、心脏⁴、眼部（例如青光眼）^5,6 和内分泌疾病（例如高血压和糖尿病 ^7,8).使用 NFC 很容易检测到甲襞毛细血管的形态变化，包括出血、血管迂曲增加和无血管区域。这些形态学异常代表病理过程，例如过度或不足的微血管重塑 ^9,10。NFC 是检测这些病症的有用诊断工具。此外，该技术可用于评估药物疗效¹¹。

然而，由于多种原因，将临床 NFC 发现转化为疾病的动物模型具有挑战性。动物微血管系统的可视化通常是侵入性的（例如，内窥镜），在体外进行（例如，组织的死后成像），或者昂贵的，需要专门的设备，如显微计算机断层扫描^12,13、相干断层扫描血管造影¹⁴ 和光声成像技术¹⁵.由于外周微血管病变在广泛的全身和中枢神经系统疾病中很明显，包括心肌梗塞¹⁶、高血压¹⁷、与年龄相关的中枢神经系统神经变性（如阿尔茨海默病¹⁸）和视神经病变（如青光眼¹⁹），因此一种无创、具有成本效益的体内可视化技术非常有益。

毛细血管镜检查已用于评估动物模型（包括豚鼠²⁰ 和小鼠²¹）中的甲襞微血管系统，从而证明其作为非侵入性成像工具的能力。在这里，我们将毛细血管镜检查应用于指甲的不同部分，即甲床。利用小鼠指甲的透明度，甲床毛细血管镜检查为外周微血管系统的可视化引入了一个新的位置。与对监测血细胞运动特别有用的 NFC 相比^21,22，此处描述的甲床毛细血管镜检查方案提供了更大的区域，可以更好地观察微血管形态和结构。我们提供了一种协议，使研究人员能够轻松且廉价地评估小鼠甲床微血管系统的形态，这是无创外周血管成像的新位置。该方案使用两种常用的实验室菌株 （SV129/S6 和 C57/B6J） 提供了野生型小鼠中典型甲床微血管结构的代表性图像。我们表明甲床毛细血管镜检查是一种廉价、无创的微血管成像方式。使用这种探索性方法的进一步研究对于将甲床毛细血管镜检查应用于病理学中外周微血管异常明显的各种小鼠疾病模型至关重要。

研究方案

此处描述的所有方法均已获得范德堡大学医学中心和麻省总医院机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。

1. 准备用于成像的小鼠指甲

注意：为了获得最佳的血管清晰度和皮肤恢复，在成像前至少等待 24 小时。

1. 为了实现小鼠甲床的无障碍成像，请在毛细血管镜成像前至少 24 小时去除啮齿动物爪子上的皮毛（图 1A）。要去除鼠标爪子上的毛发，请按照步骤 1.1.1-1.1.6作。
   1. 使用吸入异氟醚麻醉剂（2% 异氟醚在 5% 二氧化碳/95% 氧气中）镇静动物。通过捏住双后脚的脚垫来确认鼠标已充分麻醉。如果麻醉得当，不应有抽搐动作（踏板撤退反射）。如果有反射运动，让鼠标在异氟醚下有更多时间完全麻醉。重新测试踏板撤离反射并继续。
   2. 小鼠适当麻醉后，在双眼上涂抹润滑眼凝胶或无菌非药物眼药膏，以防止麻醉时角膜干燥。
   3. 使用鼻锥保持动物处于麻醉状态，使用涂抹器将大量脱毛霜涂抹在整个爪子上。注意覆盖整个爪子和甲床区域，如图 1B 所示。
   4. 在室温 （RT） 下将脱毛霜留在爪子上 2 分钟。
   5. 用干净的纸巾轻轻擦拭，小心地擦掉脱毛霜。
   6. 用温水无菌水清洗爪子。
      注意：爪子应该没有毛皮和指甲，以便进行成像，如图 1C 所示。
   7. 将鼠标放回笼子里，以确保从麻醉中安全恢复。在鼠标恢复意识之前，不要让鼠标无人看管。一旦老鼠恢复意识，就与其他动物一起将其放回原来的笼子里。

2. 体内甲 床毛细血管镜成像

1. 在去除毛皮后至少 24 小时的恢复时间后，将毛细血管镜检查设备设置在温控室（保持在 21.5-22.5 °C 之间），如图 2A 所示。甲床成像的完整设置包括 1） 异氟醚麻醉设备，2） 麻醉鼻锥，3） 可调节的动物载物台，4） 毛细血管显微镜，以及 5） 带有成像视频软件的笔记本电脑。
2. 使用吸入异氟醚麻醉剂（2% 异氟醚在 5% 二氧化碳/95% 氧气中）镇静动物。
   1. 通过捏住双后脚的脚垫来确认鼠标已充分麻醉。如果麻醉得当，不应有抽搐动作（踏板撤退反射）。如果有反射运动，请返回步骤 1.1.1 并让鼠标有更多时间完全麻醉。然后，重新测试踏板退缩反射并继续。
   2. 小鼠适当麻醉后，将润滑眼凝胶或无菌非药物眼药膏涂抹在双眼上，以防止麻醉期间角膜干燥。
3. 保持动物处于镇静状态，将后爪掌侧朝上放在物镜下方的实验室胶带平台顶部，如图 2B 所示，缩放。
4. 使用涂抹器轻轻张开脚趾，以分离显微镜物镜下的指甲。确保甲床彼此分开，以实现最佳的血管成像。
   注意： 图 2C 显示了完整的成像设置，在笔记本电脑视频软件上显示船舶图片。
5. 为了减少眩光并提高注意力，请在爪子上大量涂抹浸油（玉米油），确保完全覆盖指甲。在鼠标爪下添加白色胶带或类似物，以增强对比度并改善血管床的可视化（图 3;箭头 3）。
6. 专注于后爪第二指的指甲;在小鼠中，这是最大的指甲，最容易成像。要聚焦鼠标指甲，请使用 x 和 y 载物台调节器（图 3;箭头 4）和放大轮（在本仪器上高达 280 倍; 图 3;箭头 1）。
7. 转动物镜以减少眩光的位置，使钉子容器网络进入视野（图 3;箭头 2）。
   注意：如果血管变得难以看到或成像时间延长，请大量重新涂抹浸油。老鼠的字体爪子比后爪小;因此，建议对后爪进行成像。
8. 通过通用串行总线 （USB） 连接将毛细管镜连接到笔记本电脑。
9. 在笔记本电脑上打开 Debut 视频软件应用程序。
   注意： 在设置中验证设备是否已正确连接到笔记本电脑。
10. 在笔记本电脑屏幕上，可视化毛细管镜放大的内容，并通过调整 x 和 y 载物台调节器和放大轮将焦点集中在甲床上，以获得清晰的图像。
11. 一旦显微镜聚焦并看到甲床中血管网络的清晰图像，通过点击 Debut 中的 红色录制 按钮或类似的视频软件程序来录制视频（图 2C）。
12. 将每个视频保存到相应的项目文件夹，并相应地标记每个视频。

3. 保存甲床图像

1. 在软件中打开甲床视频，并在视频中手动选择血管清晰聚焦的帧。
2. 使用计算机上的 屏幕截图 工具，截取首次亮相的视频屏幕的屏幕截图，显示指甲中的清晰脉管系统。保存图片。
3. 单击在 ImageJ 软件中打开屏幕截图图像 文件 和 可选;从其目标文件夹中选择文件。
4. 如果需要，通过选择 图像>调整亮度/对比度>来调整亮度和对比度。该工具可以帮助改变图像的对比度，以更好地可视化血管形态。
5. 调整图像后，单击 设置 在 亮度/对比度 工具。
6. 通过单击将图像另存为 TIFF 文件 文件 文件 然后 另存为.

结果

使用此处描述的毛细血管镜检查方法，可以很容易地对甲床血管形态进行成像，如图 4A 所示。小鼠的典型甲床脉管系统表现出三个一致的特征， 如图 4B 所示：每个甲床有 1） 传入血管，2） 传出血管，以及 3） 连接传入血管和传出血管的毛细血管网络。为了证明甲床形态的一致性，我们在 图 4C 中显示?...

讨论

总之，我们提供了一种方案，使研究人员能够轻松且廉价地评估小鼠甲床微血管系统的形态，这是一种用于无创外周血管成像的新位置。与豚鼠²⁰ 和小鼠²¹ 中使用的 NFC 方法一样，此处描述的协议的主要优势在于它允许对小鼠疾病模型中的外周微血管系统进行快速和非侵入性评估。这对于涉及外周血管异常的研究特别有用，例如风湿性?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic Charcoal Filter Cannister	ReFresh	EZ-258
Capillaroscope	Jiahua Electronic Instrument Co., Jiangsu, China	JH-1004
Compressed gas (5% carbon dioxide, 95% oxygen)	Airgas	UN3156
Corn oil	Sigma	C8-267
Debut video capture software	Debut		Available free online.
Eye spears	BVI Weck- Cel	0008680	For application and removal of hair removal cream.
Hair removal cream	Nair	610370323649
Isoflurane 250 mL bottle	Piramal critical care	NDC  6679401725
Lab jack	Fisherbrand	14-673-52	Used as a platform to hold the mouse.
Nose cone (low profile anesthesia mask)	Kent Scientific	SOMNO-0801
Transfer pipettes	Fisherbrand	13-711-9AM	Apply corn oil generously to mouse paw as an immersion oil.
USB Video capture card	VIXLW	BR116
Vetequip	VWR	89012-492	Isoflurane equipment
White labeling tape	Fisherbrand	15-958	Used to create a white/contrasting background under mouse paw when taking images.