Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Kapillaroskopi, mikrovasküler sistemin doğrudan, ucuz ve non-invaziv görüntülenmesi için erişilebilir bir araçtır. Bu protokolün amacı, araştırmacıların farelerin tırnak yataklarında periferik mikrovasküler morfolojinin görselleştirilmesi için kapillaroskopi kullanmalarını sağlamaktır.

Özet

Tırnak kıvrımlı kapillaroskopi (NFC) kullanılarak insanlarda cildin mikrokılcal damar ağlarının görüntülenmesi, kritik sistemik hastalıklarda hedef organ sistemi olarak mikrosirkülasyonun önemini vurgulamıştır. Tırnak kıvrımı kapillaroskopisi, romatizmal, kardiyak, oküler (örneğin glokom) ve endokrin bozukluklar (örneğin, hipertansiyon ve diabetes mellitus) dahil olmak üzere bir dizi sistemik durumda periferik mikrovasküler disfonksiyonu ve anormallikleri tespit etmek için klinik olarak uygulanır. NFC sadece periferik sistemik mikrovasküler sistem bozulmasının saptanmasında değil, aynı zamanda ilaç etkinliğinin değerlendirilmesinde de yararlıdır. Bununla birlikte, klinik NFC bulgularını hayvan hastalığı modellerine çevirmek zor olabilir. Hayvanlarda mikrovasküler disfonksiyonun veya anormalliklerin tespit edilmesi genellikle invazivdir (ör., endoskopik), ex vivo olarak gerçekleştirilir (ör., dokuların ölüm sonrası görüntülenmesi) veya pahalıdır, mikrobilgisayarlı tomografi ve fotoakustik görüntüleme tekniklerinde kullanılanlar gibi özel ekipman gerektirir. Hayvan hastalık modellerinde periferik mikrovaskülatürü görüntülemek için hızlı, invaziv olmayan ve ucuz tekniklerin geliştirilmesi, araştırma masraflarını azaltmak ve kliniğe çevrilebilirliği artırmak için garanti edilmektedir.

Kapillaroskopi daha önce kobaylar ve fareler de dahil olmak üzere hayvan modellerinde tırnak kıvrımı mikrovaskülatürünü görselleştirmek için kullanılmıştır, böylece hayvan modellerinde invaziv olmayan bir görüntüleme aracı olarak kapillaroskopinin yeteneğini göstermiştir. Bu çalışma, bir fare çivi yatağına kapillaroskopi uygulayan ve araştırmacıların mikrovaskülatürünün morfolojisini kolay ve ucuz bir şekilde değerlendirmelerine olanak tanıyan bir protokol sunmaktadır. Yaygın olarak kullanılan iki laboratuvar suşu olan SV129 / S6 ve C57 / B6J kullanılarak vahşi tip farelerde tipik tırnak yatağı mikrovasküler mimarisinin temsili görüntüleri sağlanmaktadır. Bu yöntemi kullanan daha ileri çalışmalar, periferik mikrovasküler anormallikleri olan çok çeşitli fare hastalığı modellerine çivili kapillaroskopi uygulamak için gereklidir.

Giriş

Tırnak kıvrımlı kapillaroskopi (NFC) kullanılarak insanlarda periferik mikrokılcal ağların görüntülenmesi, çok çeşitli sistemik hastalıklarda hedef organ sistemi olarak mikrosirkülasyonun önemini vurgulamıştır1. Kapillaroskopi, in vivo olarak tırnak kıvrımındaki damarları büyütmek ve görselleştirmek için bir mikroskop kullanımını içerir. Bu nedenle, romatizmal 2,3, kardiyak4, oküler (örn. glokom)5,6 ve endokrin hastalıklar (örn., hipertansiyon ve diabetes mellitus 7,8) dahil olmak üzere bir dizi sistemik durumda periferik mikrovasküler disfonksiyonu ve anormallikleri tespit etmek için klinikte yaygın olarak kullanılan bir tekniktir). Kanamalar, artmış damar kıvrımı ve avasküler bölgeler dahil olmak üzere tırnak kıvrımı kılcal damarlarındaki morfolojik değişiklikler NFC kullanılarak kolayca tespit edilir. Bu morfolojik anormallikler, aşırı veya eksik mikrovasküler yeniden şekillenme gibi patolojik süreçleri temsil eder 9,10. NFC, bu patolojileri tespit etmek için yararlı bir tanı aracıdır. Ek olarak, bu teknik ilaç etkinliğinin değerlendirilmesinde yararlıdır11.

Bununla birlikte, klinik NFC bulgularını hayvan hastalık modellerine çevirmek birçok nedenden dolayı zordur. Hayvanlarda mikrovasküler sistemin görüntülenmesi tipik olarak invazivdir (ör., endoskopik), ex vivo (ör., dokuların ölüm sonrası görüntülenmesi) veya pahalıdır, mikrobilgisayarlı tomografi 12,13, koherens tomografianjiyografi 14 ve fotoakustik görüntüleme teknikleri15 gibi özel ekipman gerektirir. Periferik mikrovasküler patoloji, miyokard enfarktüsü16, hipertansiyon17, Alzheimer hastalığı18 gibi merkezi sinir sisteminin yaşa bağlı nörodejenerasyonları ve glokom19 gibi optik nöropatiler dahil olmak üzere çok çeşitli sistemik ve merkezi sinir sistemi hastalıklarında belirgin olduğundan, non-invaziv, uygun maliyetli bir in vivo görselleştirme tekniği oldukça faydalıdır.

Kapillaroskopi, kobay20 ve fareler21 dahil olmak üzere hayvan modellerinde tırnak kıvrımı mikrovaskülatürünü değerlendirmek için kullanılmıştır ve böylece non-invaziv bir görüntüleme aracı olarak yeteneğini göstermiştir. Burada tırnağın farklı bir yerine, tırnak yatağına kapillaroskopi uyguluyoruz. Fare tırnağının şeffaflığından yararlanan çivili kapillaroskopi, periferik mikrovaskülatür sisteminin görselleştirilmesi için yeni bir konum sunar. Kan hücresi hareketini izlemek için özellikle yararlı olanNFC ile karşılaştırıldığında 21,22, burada açıklanan çivili kapillaroskopi protokolü, mikrovasküler morfoloji ve yapının daha iyi gözlemlenmesi için daha geniş bir alan sağlar. Araştırmacıların, non-invaziv periferik vasküler görüntüleme için yeni bir yer olan fare çivi yataklı mikrovasküler sistemin morfolojisini kolay ve ucuz bir şekilde değerlendirmelerine olanak tanıyan bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, yaygın olarak kullanılan iki laboratuvar suşu (SV129 / S6 ve C57 / B6J) kullanarak vahşi tip farelerde tipik tırnak yatağı mikrovasküler mimarisinin temsili görüntülerini sağlar. Çivili kapillaroskopinin ucuz, non-invaziv bir mikrovasküler görüntüleme yöntemi olduğunu gösterdik. Bu keşif yöntemini kullanan daha ileri çalışmalar, patolojide periferik mikrovasküler anormalliklerin belirgin olduğu çok çeşitli fare hastalık modellerine çivili kapillaroskopi uygulamak için gerekli olacaktır.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler, Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi ve Massachusetts Genel Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Görüntüleme için fare tırnaklarının hazırlanması

NOT: Optimum damar berraklığı ve cilt iyileşmesi için, görüntülemeden önce en az 24 saat bekleyin.

  1. Fare tırnak yataklarının engelsiz görüntülenmesini sağlamak için, kapillaroskopi görüntülemesinden en az 24 saat önce kemirgen pençelerinden kürkü çıkarın (Şekil 1A). Fare pençelerinden kürkü çıkarmak için 1.1.1-1.1.6 adımlarını izleyin.
    1. Solunan izofluran anestezisi (% 5 karbondioksit ve% 95 oksijende% 2 izofluran) kullanarak hayvanı sakinleştirin. Ayak pedini her iki arka ayağınıza sıkıştırarak farenin yeterince uyuşturulduğunu onaylayın. Uygun şekilde uyuşturulursa, sarsıntı hareketi olmamalıdır (pedal çekme refleksi.) Bir refleks hareketi varsa, farenin izofluran altında tamamen anestezi altına girmesi için daha fazla zaman tanıyın. Pedal çekme refleksini tekrar test edin ve devam edin.
    2. Fare uygun şekilde uyuşturulduktan sonra, anestezi altındayken korneanın kurumasını önlemek için her iki göze kayganlaştırıcı bir göz jeli veya steril ilaçsız oftalmik merhem sürün.
    3. Hayvanı bir burun konisi kullanarak anestezi altında tutarak, bir aplikatör kullanarak tüm pençeye bol miktarda tüy dökücü krem sürün. Şekil 1B'de gösterildiği gibi tüm pençe ve tırnak yatağı alanlarını kaplamaya özen gösterin.
    4. Tüy dökücü kremi pençe üzerinde oda sıcaklığında (RT) 2 dakika bekletin.
    5. Tüy dökücü kremi temiz bir mendille nazikçe ovalayarak dikkatlice temizleyin.
    6. Pençeyi ılık, steril suda yıkayın.
      NOT: Şekil 1C'de gösterildiği gibi, pençelerde görüntüleme için engellenmemiş kürk ve tırnaklar bulunmamalıdır.
    7. Anesteziden güvenli bir şekilde iyileşmesini sağlamak için fareyi kafesine geri koyun. Bilinci yerine gelene kadar fareyi gözetimsiz bırakmayın. Fare bilincini geri kazandığında, diğer hayvanlarla birlikte orijinal kafese geri koyun.

2. İn vivo çivili kapillaroskopi görüntüleme

  1. Kürkün çıkarılmasından sonra en az 24 saatlik iyileşme süresinin ardından, kapillaroskopi ekipmanını Şekil 2A'da gösterildiği gibi sıcaklık kontrollü bir odaya (21.5-22.5 °C arasında tutulur) kurun. Çivi yatağı görüntüleme için eksiksiz kurulum, 1) izofluran anestezi ekipmanı, 2) bir anestezi burun konisi, 3) ayarlanabilir bir hayvan aşaması, 4) bir kapillaroskopi mikroskobu ve 5) görüntüleme için video yazılımına sahip bir dizüstü bilgisayar içerir.
  2. Solunan izofluran anestezisi (% 5 karbondioksit ve% 95 oksijende% 2 izofluran) kullanarak hayvanı sakinleştirin.
    1. Ayak pedini her iki arka ayağınıza sıkıştırarak farenin yeterince uyuşturulduğunu onaylayın. Uygun şekilde uyuşturulursa, sarsıntı hareketi olmamalıdır (pedal çekme refleksi.) Bir refleks hareketi varsa, adım 1.1.1'e dönün ve farenin tamamen uyuşturulması için daha fazla zaman tanıyın. Ardından, pedal çekme refleksini tekrar test edin ve devam edin.
    2. Fare uygun şekilde uyuşturulduktan sonra, anestezi sırasında korneanın kurumasını önlemek için her iki göze kayganlaştırıcı göz jeli veya steril ilaçsız oftalmik merhem sürün.
  3. Hayvanı sedasyon altında tutarak, Şekil 2B'de gösterildiği gibi, arka pençe volar tarafını objektifin altındaki laboratuvar bant platformunun üzerine gelecek şekilde konumlandırın, yakınlaştırma.
  4. Bir aplikatör kullanarak mikroskop objektifi altında tırnakları ayırmak için ayak parmaklarını nazikçe açın. Optimum damar görüntüleme için tırnak yataklarının birbirinden ayrıldığından emin olun.
    NOT: Şekil 2C , dizüstü bilgisayar video yazılımında gemi resmini gösteren tam görüntüleme kurulumunu göstermektedir.
  5. Parlamayı azaltmak ve odaklanmayı iyileştirmek için, pençeye cömertçe daldırma yağı (mısır yağı) uygulayın ve tam tırnak kaplaması sağlayın. Kontrastı artırmak ve damar yatağının görselleştirilmesini iyileştirmek için fare pençesinin altına beyaz bant veya benzeri bir şey ekleyin (Şekil 3; ok 3).
  6. Arka pençenin ikinci basamağındaki çiviye odaklanın; Farelerde, bu en büyük çividir ve görüntülenmesi en kolay olanıdır. Fare tırnağını odaklamak için x ve y stage ayarlayıcılarını (Şekil 3; ok 4) ve büyütme tekerleğini (bu alette 280x'e kadar; Şekil 3; ok 1).
  7. Tırnak damarı ağını görünür hale getirmek için parlamanın konumunu azaltmak için hedefi çevirin (Şekil 3; ok 2).
    NOT: Damarları görmek zorlaşırsa veya görüntüleme süresi uzarsa, daldırma yağını cömertçe yeniden uygulayın. Farelerin yazı tipi pençeleri arka pençelerinden daha küçüktür; Bu nedenle, görüntülemenin arka pençelerde yapılması önerilir.
  8. Kapilleroskopu evrensel seri veri yolu (USB) bağlantısı aracılığıyla bir dizüstü bilgisayara bağlayın.
  9. Dizüstü bilgisayarda Debut video yazılım uygulamasını açın.
    NOT: Ayarlarda cihazın dizüstü bilgisayara düzgün şekilde bağlandığını doğrulayın.
  10. Dizüstü bilgisayar ekranında, kılçık tarafından neyin büyütüldüğünü görselleştirin ve net bir görüntü elde etmek için x ve y kademe ayarlayıcılarını ve büyütme tekerleğini ayarlayarak tırnak yatağına odaklanın.
  11. Mikroskop odaklandıktan ve çivi yatağındaki damar ağının net bir görüntüsü görüldükten sonra, Debut'taki kırmızı kayıt düğmesine veya benzer bir video yazılım programına basarak bir video kaydedin (Şekil 2C).
  12. Her videoyu uygun proje klasörüne kaydedin ve her videoyu uygun şekilde etiketleyin.

3. Tırnak yatağı görüntülerini kaydetme

  1. Çivi yatağı videosunu yazılımda açın ve videoda damarların net bir şekilde odaklandığı bir kareyi manuel olarak seçin.
  2. Bilgisayardaki Ekran Görüntüsü aracını kullanarak, tırnaktaki net damar sistemini gösteren ilk video ekranının ekran görüntüsünü alın. Resmi kaydedin.
  3. Dosya ve Aç'a tıklayarak ekran görüntüsü görüntüsünü ImageJ yazılımında açın; Dosyayı hedef klasöründen seçin.
  4. Gerekirse, Görüntü > Parlaklığı/Kontrastı Ayarla > seçerek parlaklığı ve kontrastı ayarlayın. Bu araç, damar morfolojisini daha iyi görselleştirmek için görüntülerin kontrastını değiştirmeye yardımcı olabilir.
  5. Görüntü ayarlandıktan sonra, Parlaklık/Kontrast aracında Ayarla'ya tıklayın.
  6. Dosya'ya ve ardından Farklı kaydet'e tıklayarak görüntüyü bir TIFF dosyası olarak kaydedin.

Sonuçlar

Burada tarif edilen kapillaroskopi yöntemi kullanılarak, Şekil 4A'da gösterildiği gibi çivili vasküler morfoloji kolayca görüntülenebilir. Bir faredeki tipik tırnak yatağı damar sistemi, Şekil 4B'de vurgulandığı gibi üç tutarlı özellik sergiler: her tırnak yatağında 1) afferent bir damar, 2) bir efferent damar ve 3) hem afferent hem de efferent damarları birbirine bağlayan bir kılcal damar ağı vardı...

Tartışmalar

Özetle, araştırmacıların, non-invaziv periferik vasküler görüntüleme için yeni bir yer olan fare tırnağı mikrovaskülatürünün morfolojisini kolay ve ucuz bir şekilde değerlendirmelerine olanak tanıyan bir protokol sunuyoruz. Gine domuzlarında20 ve farelerde21 kullanılan NFC yöntemleri gibi, burada açıklanan protokolün en büyük gücü, fare hastalık modellerinde periferik mikrovaskülatür sisteminin hızlı ve in...

Açıklamalar

Bu işle ilgisi olmayan Dr. Pasquale, Twenty Twenty'nin ücretli bir danışmanıydı. Bu işle ilgisi olmayan Clara Cousins, Cartography Biosciences'ın ücretli bir danışmanıdır. Diğer yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Lauren K. Wareham'a verilen sınırsız departman fonları ile finanse edildi. Dr. Pasquale, Glokom Vakfı (NYC) tarafından ve Körlüğü Önleme Araştırmaları'ndan (NYC) sınırsız bir meydan okuma hibesi ile desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthetic Charcoal Filter CannisterReFreshEZ-258
Capillaroscope Jiahua Electronic Instrument Co., Jiangsu, ChinaJH-1004
Compressed gas (5% carbon dioxide, 95% oxygen)AirgasUN3156
Corn oilSigmaC8-267 
Debut video capture softwareDebutAvailable free online.
Eye spearsBVI Weck- Cel0008680For application and removal of hair removal cream.
Hair removal creamNair 610370323649
Isoflurane 250 mL bottlePiramal critical careNDC  6679401725
Lab jack Fisherbrand14-673-52Used as a platform to hold the mouse.
Nose cone (low profile anesthesia mask)Kent ScientificSOMNO-0801
Transfer pipettesFisherbrand13-711-9AMApply corn oil generously to mouse paw as an immersion oil.
USB Video capture cardVIXLWBR116
VetequipVWR89012-492Isoflurane equipment
White labeling tape Fisherbrand15-958Used to create a white/contrasting background under mouse paw when taking images.

Referanslar

  1. El Miedany, Y., Ismail, S., Wadie, M., Hassan, M. Nailfold capillaroscopy: tips and challenges. Clin Rheumatol. 41 (12), 3629-3640 (2022).
  2. Etehad Tavakol, M., Fatemi, A., Karbalaie, A., Emrani, Z., Erlandsson, B. -. E. Nailfold capillaroscopy in rheumatic diseases: Which parameters should be evaluated. BioMed Res Int. 2015 (1), 974530 (2015).
  3. Cutolo, M., Smith, V. Detection of microvascular changes in systemic sclerosis and other rheumatic diseases. Nat Rev Rheumatol. 17 (11), 665-677 (2021).
  4. Lim, M. W. S., et al. Nailfold video-capillaroscopy in the study of cardiovascular disease: a systematic review. Blood Press Monit. 28 (1), 24-32 (2023).
  5. Philip, S., Najafi, A., Tantraworasin, A., Pasquale, L. R., Ritch, R. Nailfold capillaroscopy of resting peripheral blood flow in exfoliation glaucoma and primary open-angle glaucoma. JAMA Ophthalmol. 137 (6), 618-625 (2019).
  6. Taniguchi, E. V., et al. Peripheral microvascular abnormalities associated with open-angle glaucoma. Ophthalmol Glaucoma. 6 (3), 291-299 (2023).
  7. Maldonado, G., Guerrero, R., Paredes, C., Ríos, C. Nailfold capillaroscopy in diabetes mellitus. Microvasc Res. 112, 41-46 (2017).
  8. Gurfinkel, Y. I., Sasonko, M., Priezzhev, A. Digital capillaroscopy as important tool for early diagnostics of arterial hypertension Proc. SPIE 9448, Saratov Fall Meeting 2014: Optical Technologies in Biophysics and Medicine XVI; Laser Physics and Photonics XVI; and Computational Biophysics. , 944804 (2015).
  9. Santamaría, R., González-Álvarez, M., Delgado, R., Esteban, S., Arroyo, A. G. Remodeling of the microvasculature: May the blood flow be with you. Front Physiol. 11, 586852 (2020).
  10. Pries, A. R., Secomb, T. W. Making microvascular networks work: angiogenesis, remodeling, and pruning. Physiology. 29 (6), 446-455 (2014).
  11. Cutolo, M., Smith, V. State of the art on nailfold capillaroscopy: a reliable diagnostic tool and putative biomarker in rheumatology. Rheumatology. 52 (11), 1933-1940 (2013).
  12. Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282 (5), R1267-R1279 (2002).
  13. Zagorchev, L., et al. Micro computed tomography for vascular exploration. J Angiogenes Res. 2, 7 (2010).
  14. Untracht, G. R., et al. Pilot study of optical coherence tomography angiography-derived microvascular metrics in hands and feet of healthy and diabetic people. Sci Rep. 13 (1), 1122 (2023).
  15. Mirg, S., Turner, K. L., Chen, H., Drew, P. J., Kothapalli, S. -. R. Photoacoustic imaging for microcirculation. Microcirculation. 29 (6-7), e12776 (2022).
  16. Gkontra, P., et al. Dynamic changes in microvascular flow conductivity and perfusion after myocardial infarction shown by image-based modeling. J Am Heart Assoc. 8 (7), e011058 (2019).
  17. Laurent, S., Agabiti-Rosei, C., Bruno, R. M., Rizzoni, D. Microcirculation and macrocirculation in hypertension: A dangerous cross-link. Hypertension. 79 (3), 479-490 (2022).
  18. Kisler, K., Nelson, A. R., Montagne, A., Zlokovic, B. V. Cerebral blood flow regulation and neurovascular dysfunction in Alzheimer disease. Nat Rev Neurosci. 18 (7), 419-434 (2017).
  19. Wareham, L. K., Calkins, D. J. The neurovascular unit in glaucomatous neurodegeneration. Front Cell Dev Biol. 8, 452 (2020).
  20. Mandujano, A., Golubov, M. Animal models of systemic sclerosis: using nailfold capillaroscopy as a potential tool to evaluate microcirculation and microangiopathy: a narrative review. Life. 12 (5), 703 (2022).
  21. Kim, M. Nail fold capillaroscopy as a potential tool to evaluate breast tumor. J Anal Sci Technol. 15 (1), 35 (2024).
  22. McKay, G. N., et al. Visualization of blood cell contrast in nailfold capillaries with high-speed reverse lens mobile phone microscopy. Biomed Opt Express. 11 (4), 2268-2276 (2020).
  23. Zhang, X., Qian, X., Tao, C., Liu, X. In vivo imaging of microvasculature during anesthesia with high-resolution photoacoustic microscopy. Ultrasound Med Biol. 44 (5), 1110-1118 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Non invaziv G r nt lemeivili Mikrovask ler MorfolojiKapillaroskopiMikrokapiller A larPeriferik Mikrovask ler DisfonksiyonHayvan Hastal ModelleriSistemik Durumlarla Etkinlik De erlendirmesiG r nt leme TeknikleriYabani Tip FarelerSV129 S6 Su uC57 B6J Su uAra t rma ProtokolMikrovask ler Mimari

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır