Visualisation non invasive de la morphologie microvasculaire du lit de l’ongle chez la souris par capillaroscopie

Résumé

La capillaroscopie est un outil accessible pour la visualisation directe, peu coûteuse et non invasive de la microvascularisation. L’objectif de ce protocole est de permettre aux chercheurs d’utiliser la capillaroscopie pour la visualisation de la morphologie microvasculaire périphérique dans les lits d’ongles de souris.

Résumé

L’imagerie des réseaux microcapillaires de la peau chez l’homme à l’aide de la capillaroscopie du pli de l’ongle (NFC) a souligné l’importance de la microcirculation en tant que système d’organe cible dans les maladies systémiques critiques. La capillaroscopie du pli de l’ongle est appliquée cliniquement pour détecter le dysfonctionnement microvasculaire périphérique et les anomalies dans une gamme d’affections systémiques, notamment les troubles rhumatismaux, cardiaques, oculaires (par exemple, le glaucome) et endocriniens (par exemple, l’hypertension et le diabète sucré). La NFC est utile non seulement pour détecter la perturbation systémique périphérique de la microvascularisation, mais aussi pour évaluer l’efficacité des médicaments. Cependant, il peut être difficile de traduire les résultats cliniques de la NFC en modèles de maladies animales. La détection d’un dysfonctionnement ou d’anomalies microvasculaires chez les animaux est souvent invasive (p. ex., endoscopique), réalisée ex vivo (p. ex., imagerie post-mortem des tissus) ou coûteuse, nécessitant de l’équipement spécialisé comme ceux utilisés dans les techniques de microtomodensitométrie et d’imagerie photoacoustique. La mise au point de techniques rapides, non invasives et peu coûteuses pour imager la microvascularisation périphérique dans des modèles animaux de la maladie est justifiée pour réduire les dépenses de recherche et augmenter la traduisibilité en clinique.

La capillaroscopie a déjà été utilisée pour visualiser la microvascularisation du pli de l’ongle dans des modèles animaux, y compris chez des cobayes et des souris, démontrant ainsi la capacité de la capillaroscopie en tant qu’outil d’imagerie non invasif dans des modèles animaux. Cette étude fournit un protocole qui applique la capillaroscopie à un lit d’ongle de souris, permettant aux chercheurs d’évaluer facilement et à moindre coût la morphologie de sa microvascularisation. Des images représentatives de l’architecture microvasculaire typique du lit de l’ongle chez des souris de type sauvage à l’aide de deux souches de laboratoire couramment utilisées, SV129/S6 et C57/B6J, sont fournies. D’autres études utilisant cette méthode sont essentielles pour appliquer la capillaroscopie sur le lit de l’ongle à un large éventail de modèles de maladies chez la souris présentant des anomalies microvasculaires périphériques.

Introduction

L’imagerie des réseaux microcapillaires périphériques chez l’homme à l’aide de la capillaroscopie du pli de l’ongle (NFC) a mis en évidence l’importance de la microcirculation en tant que système d’organe cible dans un large éventail de maladies systémiques¹. La capillaroscopie implique l’utilisation d’un microscope pour agrandir et visualiser les vaisseaux dans le pli de l’ongle in vivo. En tant que telle, il s’agit d’une technique largement utilisée en clinique pour détecter le dysfonctionnement microvasculaire périphérique et les anomalies dans une gamme d’affections systémiques, y compris les maladies rhumatismales ^2,3, cardiaques 4, oculaires (par exemple, le glaucome)^5,6 et endocriniennes (par exemple, l’hypertension et le diabète sucré ^7,8). Les changements morphologiques dans les capillaires du pli de l’ongle, y compris les hémorragies, l’augmentation de la tortuosité des vaisseaux et les régions avasculaires, sont facilement détectés à l’aide de la NFC. Ces anomalies morphologiques représentent des processus pathologiques tels qu’un remodelage microvasculaire excessif ou déficient ^9,10. La NFC est un outil de diagnostic utile pour détecter ces pathologies. De plus, cette technique est utile dans l’évaluation de l’efficacité des médicaments¹¹.

Cependant, il est difficile de transposer les résultats cliniques de la NFC à des modèles animaux de la maladie pour de nombreuses raisons. La visualisation de la microvascularisation chez les animaux est généralement invasive (p. ex., endoscopique), réalisée ex vivo (p. ex., imagerie post-mortem des tissus) ou coûteuse, nécessitant de l’équipement spécialisé tel que la microtomodensitométrie ^12,13, la tomographie de cohérence¹⁴ et les techniques d’imagerie photoacoustique¹⁵. Étant donné que la pathologie microvasculaire périphérique est évidente dans un large éventail de maladies systémiques et du système nerveux central, y compris l’infarctus du myocarde¹⁶, l’hypertension¹⁷, les neurodégénérescences du système nerveux central liées à l’âge telles que la maladie d’Alzheimer¹⁸ et les neuropathies optiques telles que le glaucome¹⁹, une technique de visualisation in vivo non invasive et rentable est très bénéfique.

La capillaroscopie a été utilisée pour évaluer la microvascularisation du pli de l’ongle dans des modèles animaux, y compris des cobayes²⁰ et des souris²¹, démontrant ainsi sa capacité en tant qu’outil d’imagerie non invasif. Ici, nous appliquons la capillaroscopie à une autre partie de l’ongle, le lit de l’ongle. En exploitant la transparence de l’ongle de la souris, la capillaroscopie sur l’ongle introduit un nouvel emplacement pour la visualisation de la microvascularisation périphérique. Par rapport à la NFC, qui est particulièrement utile pour surveiller le mouvement des cellules sanguines^21,22, le protocole de capillaroscopie sur le lit de l’ongle décrit ici offre une zone plus large pour une meilleure observation de la morphologie et de la structure microvasculaires. Nous fournissons un protocole qui permet aux chercheurs d’évaluer facilement et à moindre coût la morphologie de la microvascularisation du lit de l’ongle de souris, qui est un nouvel emplacement pour l’imagerie vasculaire périphérique non invasive. Ce protocole fournit des images représentatives de l’architecture microvasculaire typique du lit de l’ongle chez les souris de type sauvage en utilisant deux souches de laboratoire couramment utilisées (SV129/S6 et C57/B6J). Nous montrons que la capillaroscopie onglée est une modalité d’imagerie microvasculaire peu coûteuse et non invasive. D’autres études utilisant cette méthode exploratoire seront essentielles pour appliquer la capillaroscopie onglée à un large éventail de modèles murins de maladies où des anomalies microvasculaires périphériques sont évidentes en pathologie.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Centre médical de l’Université Vanderbilt et du Massachusetts General Hospital.

1. Préparation des ongles de souris pour l’imagerie

REMARQUE : Pour une clarté vasculaire optimale et une récupération cutanée, attendez au moins 24 h avant l’imagerie.

1. Pour permettre une imagerie sans obstruction des ongles de souris, retirez la fourrure des pattes des rongeurs au moins 24 h avant l’imagerie par capillaroscopie (Figure 1A). Pour enlever la fourrure des pattes de souris, suivez les étapes 1.1.1-1.1.6.
   1. Sédater l’animal à l’aide d’un anesthésique à l’isoflurane inhalé (2 % d’isoflurane dans 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’oxygène). Vérifiez que la souris est correctement anesthésiée en pinçant le coussinet du pied sur les deux pattes arrière. S’il est correctement anesthésié, il ne devrait pas y avoir de mouvement saccadé (réflexe de retrait de la pédale). S’il y a un mouvement réflexe, laissez la souris plus de temps sous l’isoflurane pour être complètement anesthésiée. Retestez le réflexe de retrait de la pédale et continuez.
   2. Une fois que la souris est correctement anesthésiée, appliquez un gel lubrifiant pour les yeux ou une pommade ophtalmique stérile non médicamenteuse sur les deux yeux pour éviter le dessèchement de la cornée sous anesthésie.
   3. En maintenant l’animal sous anesthésie à l’aide d’un cône nasal, appliquez une quantité généreuse de crème dépilatoire sur toute la patte à l’aide d’un applicateur. Prenez soin de couvrir toute la zone des pattes et du lit de l’ongle, comme illustré à la figure 1B.
   4. Laissez la crème dépilatoire sur la patte pendant 2 min à température ambiante (RT).
   5. Nettoyez soigneusement la crème dépilatoire en la frottant doucement avec un mouchoir propre.
   6. Lavez la patte dans de l’eau tiède et stérile.
      REMARQUE : Les pattes doivent être exemptes de fourrure et les ongles doivent être dégagés pour l’imagerie, comme illustré à la figure 1C.
   7. Remettez la souris dans sa cage pour assurer une récupération en toute sécurité de l’anesthésie. Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elle ait repris conscience. Une fois que la souris a repris conscience, remettez-la dans la cage d’origine en compagnie d’autres animaux.

2. Imagerie par capillaroscopie clouée in vivo

1. Après un temps de récupération d’au moins 24 heures après l’épilation, installer l’appareil de capillaroscopie dans une pièce à température contrôlée (maintenue entre 21,5 et 22,5 °C), comme le montre la figure 2A. La configuration complète pour l’imagerie du lit de l’ongle comprend 1) un équipement d’anesthésie à l’isoflurane, 2) un cône de nez d’anesthésie, 3) une platine animale réglable, 4) un microscope de capillaroscopie et 5) un ordinateur portable avec un logiciel vidéo pour l’imagerie.
2. Sédater l’animal à l’aide d’un anesthésique à l’isoflurane inhalé (2 % d’isoflurane dans 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’oxygène).
   1. Vérifiez que la souris est correctement anesthésiée en pinçant le coussinet du pied sur les deux pattes arrière. S’il est correctement anesthésié, il ne devrait pas y avoir de mouvement saccadé (réflexe de retrait de la pédale). S’il y a un mouvement réflexe, revenez à l’étape 1.1.1 et laissez à la souris plus de temps pour être complètement anesthésiée. Ensuite, testez à nouveau le réflexe de retrait de la pédale et continuez.
   2. Une fois que la souris est correctement anesthésiée, appliquez un gel lubrifiant pour les yeux ou une pommade ophtalmique stérile non médicamenteuse sur les deux yeux pour éviter le dessèchement de la cornée pendant l’anesthésie.
3. En maintenant l’animal sous sédation, placez la patte arrière, côté palmaire vers le haut, sur la plate-forme de ruban de laboratoire sous l’objectif, comme le montre la figure 2B, zoom.
4. Écartez doucement les orteils pour séparer les ongles sous l’objectif du microscope à l’aide d’un applicateur. Assurez-vous que les lits d’ongles sont séparés les uns des autres pour une imagerie optimale des vaisseaux.
   REMARQUE : La figure 2C montre la configuration complète de l’imagerie montrant l’image du navire sur le logiciel vidéo de l’ordinateur portable.
5. Pour réduire l’éblouissement et améliorer la concentration, appliquez généreusement de l’huile d’immersion (huile de maïs) sur la patte, assurant une couverture complète de l’ongle. Ajoutez du ruban adhésif blanc ou similaire sous la patte de la souris pour améliorer le contraste et la visualisation du lit du vaisseau (figure 3 ; flèche 3).
6. Concentrez-vous sur l’ongle sur le deuxième doigt de la patte arrière ; Chez la souris, c’est le plus gros ongle et le plus facile à imager. Pour faire la mise au point sur la griffe de la souris, utilisez les ajusteurs de platine x et y (Figure 3 ; flèche 4) et la molette de grossissement (jusqu’à 280x sur cet instrument ; Graphique 3 ; flèche 1).
7. Tournez l’objectif pour réduire le positionnement de l’éblouissement afin de voir le réseau de vaisseaux de l’ongle (Figure 3 ; flèche 2).
   REMARQUE : Si les récipients deviennent difficiles à voir ou si le temps d’imagerie est prolongé, réappliquez généreusement l’huile d’immersion. Les pattes des souris sont plus petites que les pattes arrière ; Ainsi, il est recommandé de réaliser l’imagerie sur les pattes arrière.
8. Connectez le capillaroscope à un ordinateur portable via une connexion USB (Universal Serial Bus).
9. Ouvrez l’application logicielle vidéo Debut sur l’ordinateur portable.
   REMARQUE : Vérifiez que l’appareil est correctement connecté à l’ordinateur portable dans les paramètres.
10. Sur l’écran de l’ordinateur portable, visualisez ce qui est magnifié par le capillaroscope et concentrez-vous sur le lit de l’ongle en ajustant les ajusteurs de platine x et y et la molette de grossissement pour obtenir une image claire.
11. Une fois que le microscope est focalisé et qu’une image claire du réseau de vaisseaux dans le lit de l’ongle est visible, enregistrez une vidéo en appuyant sur le bouton d’enregistrement rouge de Debut ou d’un logiciel vidéo similaire (Figure 2C).
12. Enregistrez chaque vidéo dans le dossier de projet approprié et étiquetez chaque vidéo en conséquence.

3. Enregistrer des images de lit de clou

1. Ouvrez la vidéo du clou dans le logiciel et choisissez manuellement une image dans la vidéo où les récipients sont clairement nets.
2. À l’aide de l’outil de capture d’écran sur l’ordinateur, prenez une capture d’écran de la première vidéo montrant une vascularisation claire de l’ongle. Enregistrer l’image.
3. Ouvrez l’image de capture d’écran dans le logiciel ImageJ en cliquant sur Fichier et Ouvrir ; Sélectionnez le fichier dans son dossier de destination.
4. Si nécessaire, ajustez la luminosité et le contraste en sélectionnant Image > Ajuster > luminosité/contraste. Cet outil peut aider à modifier le contraste des images pour mieux visualiser la morphologie du vaisseau.
5. Une fois l’image ajustée, cliquez sur Définir dans l’outil Luminosité/Contraste .
6. Enregistrez l’image en tant que fichier TIFF en cliquant sur Fichier , puis sur Enregistrer sous.

Résultats

En utilisant la méthode de capillaroscopie décrite ici, la morphologie vasculaire du lit de l’ongle peut être facilement imagée, comme le montre la figure 4A. Le système vasculaire typique du lit de l’ongle chez une souris présente trois caractéristiques cohérentes, comme le souligne la figure 4B : chaque lit de l’ongle a 1) un vaisseau afférent, 2) un vaisseau efférent et 3) un réseau de capillaires reliant à ...

Discussion

En résumé, nous fournissons un protocole permettant aux chercheurs d’évaluer facilement et à moindre coût la morphologie de la microvascularisation du lit de l’ongle de souris, un nouvel emplacement pour l’imagerie vasculaire périphérique non invasive. À l’instar des méthodes NFC utilisées chez les cobayes²⁰ et les souris²¹, la principale force du protocole décrit ici est qu’il permet une évaluation rapide et non invas...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic Charcoal Filter Cannister	ReFresh	EZ-258
Capillaroscope	Jiahua Electronic Instrument Co., Jiangsu, China	JH-1004
Compressed gas (5% carbon dioxide, 95% oxygen)	Airgas	UN3156
Corn oil	Sigma	C8-267
Debut video capture software	Debut		Available free online.
Eye spears	BVI Weck- Cel	0008680	For application and removal of hair removal cream.
Hair removal cream	Nair	610370323649
Isoflurane 250 mL bottle	Piramal critical care	NDC  6679401725
Lab jack	Fisherbrand	14-673-52	Used as a platform to hold the mouse.
Nose cone (low profile anesthesia mask)	Kent Scientific	SOMNO-0801
Transfer pipettes	Fisherbrand	13-711-9AM	Apply corn oil generously to mouse paw as an immersion oil.
USB Video capture card	VIXLW	BR116
Vetequip	VWR	89012-492	Isoflurane equipment
White labeling tape	Fisherbrand	15-958	Used to create a white/contrasting background under mouse paw when taking images.