Nicht-invasive Visualisierung der mikrovaskulären Nagelbettmorphologie bei Mäusen mittels Kapillaroskopie

Zusammenfassung

Die Kapillaroskopie ist ein zugängliches Werkzeug für die direkte, kostengünstige und nicht-invasive Visualisierung von Mikrogefäßen. Ziel dieses Protokolls ist es, Forscher in die Lage zu versetzen, die Kapillaroskopie zur Visualisierung der peripheren mikrovaskulären Morphologie in den Nagelbetten von Mäusen zu nutzen.

Zusammenfassung

Die Darstellung von Mikrokapillarnetzwerken der Haut beim Menschen mittels Nagelfalzkapillaroskopie (NFC) hat die Bedeutung der Mikrozirkulation als Zielorgansystem bei kritischen systemischen Erkrankungen unterstrichen. Die Nagelfalzkapillaroskopie wird klinisch angewendet, um periphere mikrovaskuläre Dysfunktionen und Anomalien bei einer Reihe von systemischen Erkrankungen zu erkennen, einschließlich rheumatischer, kardialer, okulärer (z. B. Glaukom) und endokriner Erkrankungen (z. B. Bluthochdruck und Diabetes mellitus). NFC ist nicht nur bei der Erkennung peripherer systemischer Mikrovaskulaturstörungen nützlich, sondern auch bei der Beurteilung der Wirksamkeit von Arzneimitteln. Die Übertragung klinischer NFC-Befunde auf Tierseuchenmodelle kann jedoch eine Herausforderung darstellen. Die Erkennung von mikrovaskulären Dysfunktionen oder Anomalien bei Tieren ist oft invasiv (z. B. endoskopisch), wird ex vivo durchgeführt (z. B. postmortale Bildgebung von Geweben) oder ist teuer und erfordert spezielle Geräte, wie sie in der Mikrocomputertomographie und photoakustischen Bildgebungsverfahren verwendet werden. Die Entwicklung schneller, nicht-invasiver und kostengünstiger Techniken zur Abbildung peripherer Mikrogefäße in Tiermodellen für Krankheiten ist gerechtfertigt, um die Forschungskosten zu senken und die Übertragbarkeit auf die Klinik zu erhöhen.

Die Kapillaroskopie wurde bereits früher zur Visualisierung der nagelfalzartigen Mikrovaskulatur in Tiermodellen, einschließlich Meerschweinchen und Mäusen, eingesetzt, was die Leistungsfähigkeit der Kapillaroskopie als nicht-invasives Bildgebungswerkzeug in Tiermodellen demonstriert. Diese Studie stellt ein Protokoll zur Verfügung, das die Kapillaroskopie auf ein Nagelbett einer Maus anwendet, was es den Forschern ermöglicht, die Morphologie ihrer Mikrovaskulatur einfach und kostengünstig zu beurteilen. Es werden repräsentative Bilder der typischen mikrovaskulären Architektur in Wildtyp-Mäusen unter Verwendung von zwei häufig verwendeten Laborstämmen, SV129/S6 und C57/B6J, bereitgestellt. Weitere Studien mit dieser Methode sind unerlässlich, um die Nagelbettkapillaroskopie auf ein breites Spektrum von Mauskrankheitsmodellen mit peripheren mikrovaskulären Anomalien anzuwenden.

Einleitung

Die Bildgebung peripherer Mikrokapillarnetzwerke beim Menschen mittels Nagelfalzkapillaroskopie (NFC) hat die Bedeutung der Mikrozirkulation als Zielorgansystem bei einer Vielzahl von systemischen Erkrankungen hervorgehoben¹. Bei der Kapillaroskopie wird ein Mikroskop verwendet, um Gefäße im Nagelfalz in vivo zu vergrößern und sichtbar zu machen. Als solche handelt es sich um eine Technik, die in der Klinik weit verbreitet ist, um periphere mikrovaskuläre Dysfunktionen und Anomalien bei einer Reihe von systemischen Erkrankungen zu erkennen, darunter rheumatische ^2,3, kardiale 4, okuläre (z. B. Glaukom)^5,6 und endokrine Erkrankungen (z. B. Bluthochdruck und Diabetes mellitus ^7,8). Morphologische Veränderungen in den Nagelfaltkapillaren, einschließlich Blutungen, erhöhter Gefäßtortuosität und avaskulärer Regionen, können mit NFC leicht erkannt werden. Diese morphologischen Anomalien repräsentieren pathologische Prozesse wie einen übermäßigen oder mangelhaften mikrovaskulären Umbau ^9,10. NFC ist ein nützliches Diagnosewerkzeug zur Erkennung dieser Pathologien. Darüber hinaus ist diese Technik nützlich bei der Beurteilung der Wirksamkeit von Arzneimitteln¹¹.

Die Übertragung klinischer NFC-Ergebnisse auf Tiermodelle von Krankheiten ist jedoch aus vielen Gründen eine Herausforderung. Die Visualisierung von Mikrogefäßen bei Tieren ist in der Regel invasiv (z. B. endoskopisch), wird ex vivo durchgeführt (z. B. postmortale Bildgebung von Geweben) oder ist teuer und erfordert spezielle Geräte wie Mikrocomputertomographie^12,13, Kohärenztomographie-Angiographie¹⁴ und photoakustische Bildgebungsverfahren¹⁵. Da die periphere mikrovaskuläre Pathologie bei einem breiten Spektrum von systemischen Erkrankungen und Erkrankungen des Zentralnervensystems offensichtlich ist, darunter Myokardinfarkt¹⁶, Bluthochdruck¹⁷, altersbedingte Neurodegenerationen des Zentralnervensystems wie die Alzheimer-Krankheit¹⁸ und Optikusneuropathien wie das Glaukom¹⁹, ist eine nicht-invasive, kostengünstige In-vivo-Visualisierungstechnik von großem Vorteil.

Die Kapillaroskopie wurde verwendet, um die nagelgefaltete Mikrovaskulatur in Tiermodellen, einschließlich Meerschweinchen²⁰ und Mäusen²¹, zu bewerten, was ihre Leistungsfähigkeit als nicht-invasives Bildgebungswerkzeug demonstriert. Hier wenden wir die Kapillaroskopie an einer anderen Stelle des Nagels an, dem Nagelbett. Die Nagelbettkapillaroskopie nutzt die Transparenz des Mausnagels und eröffnet einen neuartigen Ort für die Visualisierung peripherer Mikrogefäße. Im Vergleich zu NFC, das besonders nützlich für die Überwachung der Bewegung von Blutzellen ist^21,22, bietet das hier beschriebene Nagelbett-Kapillaroskopie-Protokoll einen größeren Bereich für eine bessere Beobachtung der mikrovaskulären Morphologie und Struktur. Wir stellen ein Protokoll zur Verfügung, das es Forschern ermöglicht, die Morphologie von Nagelbett-Mikrogefäßen von Mäusen einfach und kostengünstig zu beurteilen, was ein neuartiger Ort für die nicht-invasive periphere Gefäßbildgebung ist. Dieses Protokoll liefert repräsentative Bilder der typischen mikrovaskulären Architektur von Wildtyp-Mäusen unter Verwendung von zwei häufig verwendeten Laborstämmen (SV129/S6 und C57/B6J). Wir zeigen, dass die Nagelbettkapillaroskopie eine kostengünstige, nicht-invasive mikrovaskuläre Bildgebungsmodalität ist. Weitere Studien mit dieser explorativen Methode werden unerlässlich sein, um die Nagelbettkapillaroskopie auf eine Vielzahl von Mausmodellen anzuwenden, bei denen periphere mikrovaskuläre Anomalien in der Pathologie offensichtlich sind.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Vanderbilt University Medical Center und des Massachusetts General Hospital zugelassen.

1. Vorbereitung der Mausnägel für die Bildgebung

HINWEIS: Für eine optimale Gefäßklarheit und Hautregeneration sollten Sie mindestens 24 Stunden vor der Bildgebung warten.

1. Um eine ungehinderte Bildgebung von Nagelbetten von Mäusen zu ermöglichen, entfernen Sie das Fell von den Nagetierpfoten mindestens 24 Stunden vor der Kapillaroskopie-Bildgebung (Abbildung 1A). Um das Fell von Mauspfoten zu entfernen, befolgen Sie die Schritte 1.1.1-1.1.6.
   1. Betäuben Sie das Tier mit inhalativer Isofluran-Anästhesie (2 % Isofluran in 5 % Kohlendioxid/95 % Sauerstoff). Vergewissern Sie sich, dass die Maus ausreichend betäubt ist, indem Sie den Fußballen an beiden Hinterfüßen einklemmen. Bei richtiger Betäubung sollte es keine ruckartige Bewegung geben (Pedalentzugsreflex). Wenn es zu einer Reflexbewegung kommt, lassen Sie der Maus unter Isofluran mehr Zeit, um vollständig betäubt zu werden. Wiederholen Sie den Test auf den Pedalrückzugsreflex und fahren Sie fort.
   2. Nachdem die Maus richtig betäubt wurde, tragen Sie ein Gleit-Augengel oder eine sterile, nicht medikamentöse Augensalbe auf beide Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut während der Narkose zu verhindern.
   3. Halten Sie das Tier mit einem Nasenkonus unter Narkose und tragen Sie mit einem Applikator eine großzügige Menge Haarentfernungscreme auf die gesamte Pfote auf. Achten Sie darauf, dass die gesamte Pfoten- und Nagelbettfläche bedeckt ist, wie in Abbildung 1B gezeigt.
   4. Lassen Sie die Haarentfernungscreme 2 Minuten bei Raumtemperatur (RT) auf der Pfote.
   5. Reinigen Sie die Haarentfernungscreme vorsichtig, indem Sie sie vorsichtig mit einem sauberen Tuch abreiben.
   6. Wasche die Pfote in lauwarmem, sterilem Wasser.
      HINWEIS: Die Pfoten sollten für die Bildgebung frei von Fell und Nägeln sein, wie in Abbildung 1C gezeigt.
   7. Bringen Sie die Maus wieder in ihren Käfig zurück, um eine sichere Genesung von der Narkose zu gewährleisten. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder zu Bewusstsein gekommen ist. Sobald die Maus wieder zu Bewusstsein gekommen ist, bringe sie in Begleitung anderer Tiere in den ursprünglichen Käfig zurück.

2. In-vivo-Bildgebung der Nagelbettkapillaroskopie

1. Nach einer Erholungszeit von mindestens 24 Stunden nach der Fellentfernung stellen Sie das Kapillaroskopiegerät in einem klimatisierten Raum (zwischen 21,5 und 22,5 °C) auf, wie in Abbildung 2A gezeigt. Das komplette Setup für die Nagelbett-Bildgebung umfasst 1) ein Isofluran-Anästhesiegerät, 2) einen Anästhesie-Nasenkonus, 3) einen verstellbaren Tiertisch, 4) ein Kapillaroskopie-Mikroskop und 5) einen Laptop mit Videosoftware für die Bildgebung.
2. Betäuben Sie das Tier mit inhalativer Isofluran-Anästhesie (2 % Isofluran in 5 % Kohlendioxid/95 % Sauerstoff).
   1. Vergewissern Sie sich, dass die Maus ausreichend betäubt ist, indem Sie den Fußballen an beiden Hinterfüßen einklemmen. Bei richtiger Betäubung sollte es keine ruckartige Bewegung geben (Pedalentzugsreflex). Wenn es eine Reflexbewegung gibt, kehren Sie zu Schritt 1.1.1 zurück und lassen Sie der Maus mehr Zeit, um vollständig betäubt zu werden. Testen Sie dann erneut den Pedalrückzugsreflex und fahren Sie fort.
   2. Nachdem die Maus richtig betäubt wurde, tragen Sie Gleitgel für die Augen oder eine sterile, nicht medikamentöse Augensalbe auf beide Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut während der Anästhesie zu verhindern.
3. Halten Sie das Tier unter Sedierung und positionieren Sie die Hinterpfote mit der volaren Seite nach oben auf der Laborbandplattform unterhalb des Objektivs, wie in Abbildung 2B (Zoom) gezeigt.
4. Spreizen Sie die Zehen vorsichtig, um die Nägel unter dem Mikroskopobjektiv mit einem Applikator zu trennen. Stellen Sie sicher, dass die Nagelbetten für eine optimale Gefäßbildgebung voneinander getrennt sind.
   HINWEIS: Abbildung 2C zeigt das vollständige Bildgebungs-Setup mit dem Schiffsbild auf der Laptop-Videosoftware.
5. Um Blendung zu reduzieren und die Konzentration zu verbessern, tragen Sie großzügig Immersionsöl (Maisöl) auf die Pfote auf, um eine vollständige Nagelabdeckung zu gewährleisten. Fügen Sie weißes Klebeband oder Ähnliches unter der Mauspfote hinzu, um den Kontrast zu erhöhen und die Visualisierung des Gefäßbettes zu verbessern (Abbildung 3; Pfeil 3).
6. Konzentrieren Sie sich auf den Nagel an der zweiten Zehe der Hinterpfote; Bei Mäusen ist dies der größte Nagel und am einfachsten abzubilden. Um den Mausnagel zu fokussieren, verwenden Sie die Einsteller des x- und y-Tisches (Abbildung 3; Pfeil 4) und das Vergrößerungsrad (bis zu 280x bei diesem Instrument; Abbildung 3; Pfeil 1).
7. Drehen Sie das Objektiv, um die Positionierung der Blendung zu reduzieren und das Nagelgefäßnetzwerk sichtbar zu machen (Abbildung 3; Pfeil 2).
   HINWEIS: Wenn die Gefäße schwer zu sehen sind oder sich die Bildgebungszeit verlängert, tragen Sie das Immersionsöl großzügig erneut auf. Die Taufpfoten der Mäuse sind kleiner als die Hinterpfoten; Daher wird empfohlen, die Bildgebung an den Hinterpfoten durchzuführen.
8. Verbinden Sie das Kapillaroskop über eine USB-Verbindung (Universal Serial Bus) mit einem Laptop.
9. Öffnen Sie die Videosoftware-Anwendung Debut auf dem Laptop.
   HINWEIS: Stellen Sie in den Einstellungen sicher, dass das Gerät ordnungsgemäß mit dem Laptop verbunden ist.
10. Visualisieren Sie auf dem Laptop-Bildschirm, was vom Kapillaroskop vergrößert wird, und fokussieren Sie sich auf das Nagelbett, indem Sie die Einsteller des x- und y-Tisches und das Vergrößerungsrad einstellen, um ein klares Bild zu erhalten.
11. Sobald das Mikroskop fokussiert ist und ein klares Bild des Gefäßnetzwerks im Nagelbett zu sehen ist, nehmen Sie ein Video auf, indem Sie die rote Aufnahmetaste in Debut oder einem ähnlichen Videosoftwareprogramm drücken (Abbildung 2C).
12. Speichern Sie jedes Video im entsprechenden Projektordner und beschriften Sie jedes Video entsprechend.

3. Speichern von Nagelbettbildern

1. Öffnen Sie das Nagelbett-Video in der Software und wählen Sie manuell ein Bild im Video aus, in dem die Schiffe scharf sind.
2. Erstellen Sie mit dem Screenshot-Tool auf dem Computer einen Screenshot des ersten Videobildschirms, der ein klares Gefäßsystem im Nagel zeigt. Bild speichern.
3. Öffnen Sie das Screenshot-Bild in der ImageJ-Software, indem Sie auf Datei und Öffnen klicken. Wählen Sie die Datei aus dem Zielordner aus.
4. Passen Sie bei Bedarf die Helligkeit und den Kontrast an, indem Sie Bild > Helligkeit/Kontrast > anpassen auswählen. Mit diesem Werkzeug können Sie den Kontrast der Bilder ändern, um die Gefäßmorphologie besser zu visualisieren.
5. Nachdem das Bild angepasst wurde, klicken Sie im Helligkeits-/Kontrastwerkzeug auf Festlegen.
6. Speichern Sie das Bild als TIFF-Datei, indem Sie auf Datei und dann auf Speichern unter klicken.

Ergebnisse

Mit der hier beschriebenen Kapillaroskopie-Methode kann die Morphologie der Nagelbettgefäße leicht abgebildet werden, wie in Abbildung 4A dargestellt. Ein typisches Nagelbettgefäßsystem einer Maus weist drei konsistente Merkmale auf, wie in Abbildung 4B hervorgehoben: Jedes Nagelbett hat 1) ein afferentes Gefäß, 2) ein efferentes Gefäß und 3) ein Netzwerk von Kapillaren, die sowohl das afferente als auch das efferente Ge...

Diskussion

Zusammenfassend stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, das es Forschern ermöglicht, die Morphologie von Nagelbett-Mikrogefäßen der Maus einfach und kostengünstig zu beurteilen, ein neuartiger Ort für die nicht-invasive periphere Gefäßbildgebung. Wie bei den NFC-Methoden, die bei Meerschweinchen²⁰ und Mäusen²¹ verwendet werden, besteht die Hauptstärke des hier beschriebenen Protokolls darin, dass es eine schnelle und nicht-invasi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic Charcoal Filter Cannister	ReFresh	EZ-258
Capillaroscope	Jiahua Electronic Instrument Co., Jiangsu, China	JH-1004
Compressed gas (5% carbon dioxide, 95% oxygen)	Airgas	UN3156
Corn oil	Sigma	C8-267
Debut video capture software	Debut		Available free online.
Eye spears	BVI Weck- Cel	0008680	For application and removal of hair removal cream.
Hair removal cream	Nair	610370323649
Isoflurane 250 mL bottle	Piramal critical care	NDC  6679401725
Lab jack	Fisherbrand	14-673-52	Used as a platform to hold the mouse.
Nose cone (low profile anesthesia mask)	Kent Scientific	SOMNO-0801
Transfer pipettes	Fisherbrand	13-711-9AM	Apply corn oil generously to mouse paw as an immersion oil.
USB Video capture card	VIXLW	BR116
Vetequip	VWR	89012-492	Isoflurane equipment
White labeling tape	Fisherbrand	15-958	Used to create a white/contrasting background under mouse paw when taking images.