غسل المحلول الملحي لأخذ عينات من البيئة المكروية المناعية للأنف للكلاب

Summary

يمكن استخدام غسل الأنف الملحي لأخذ عينات من البيئة المكروية المناعية للأنف للكلاب. نظرا لأن هذا النهج غير جراحي نسبيا ولا يعطل أنسجة الأنف ، فيمكن إجراؤه بشكل متسلسل. يمكن معالجة الخلايا والبروتينات التي تم جمعها من تقنية غسل الأنف لإجراء تحليلات معملية مختلفة.

Abstract

يمكن أن يكون تقييم البيئة المناعية الموحدة لتجويف أنف مهما للتحقيق في صحة الأنسجة الطبيعية والحالات المرضية ، خاصة تلك المرتبطة بالالتهاب الموضعي. لقد قمنا بتحسين تقنية لتقييم البيئة المكروية المناعية للأنف المحلية للكلاب عن طريق غسل الأنف التسلسلي. باختصار ، مع وجود تحت التخدير ووضعها في الاستلقاء القصي ، يتم شطف المحلول الملحي المعقم الدافئ مسبقا في فتحة الأنف المصابة باستخدام قسطرة مطاطية ناعمة مرنة. يتم جمع التدفق العكسي للسوائل في أنابيب مخروطية ، وتتكرر هذه العملية. يتم تجميع السوائل التي تحتوي على خلايا وبروتينات منزوعة ، ويتم ترشيح عينات غسل الأنف المجمعة من خلال مصفاة خلوية لإزالة الحطام والمخاط الكبير. يتم طرد العينات ويتم عزل كريات الخلية لتحليلها. بمجرد معالجة العينات ، تشمل التحليلات التي قد تتبع غسل الأنف قياس التدفق الخلوي ، والتحليل النسخي للخلايا عبر تسلسل الحمض النووي الريبي السائب أو أحادي الخلية ، و / أو القياس الكمي للسيتوكينات الموجودة في سائل الغسيل.

Introduction

تصاب بشكل روتيني بأمراض التهابية أنفية طوال حياتها. يمكن أن يتراوح السبب الكامن وراء التهاب الأنف الحاد أو المزمن في من المعدية (الفيروسية: على سبيل المثال ، الأنفلونزا ، نظير الأنفلونزا ، فيروسات الهربس ؛ البكتيرية [على سبيل المثال ، بورديتيلا ، الميكوبلازما] ، الفطريات [على سبيل المثال ، داء الرشاشيات ، داء المشفرات] ؛ الطفيلي [على سبيل المثال ، عث الأنف]) إلى الأورام (على سبيل المثال ، الأورام الخبيثة الجيبية ، الأكثر شيوعا الأنسجة النسيجية أو الساركوما) إلى المواد الغريبة (على سبيل المثال ، جسم غريب ، الهجرة داخل الأنف للأسنان النازحة) إلى أمراض اللثة ، وكذلك التهاب الأنف الالتهابي مجهول السبب للكلاب^{1،2،3،4،5،6،7}.

بالإضافة إلى الفحص البدني ، يتم استخدام طرق مختلفة لتقييم حالة التجويف الجيبي العصبي في المصابة بالتهاب الأنف. قد تشمل إجراءات التصوير الصور الشعاعية (الأسنان والجمجمة) أو التصوير المقطعي المحوسب (CT) أو التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI). طريقة أخرى لتصوير تجويف الأنف هي تنظير الأنف. يمكن أن يتضمن أخذ عينات الأنسجة الحصول على مسحات الأنف أو عينات الفرشاة أو خزعات الأنسجة ، والتي يمكن من خلالها إجراء التقييم الخلوي و / أو النسيجي المرضي ، بالإضافة إلى تقديم عينة للزراعة الفطرية أو البكتيرية. يمكن الحصول على هذه العينات في مجموعة متنوعة من الأساليب ، بدءا من أخذ العينات "العمياء" ، إلى التوجيه بالصور بتنظير الأنف أو التصوير المتقدم ، ويتم الحصول عليها من خلال الأنف ، من البلعوم الأنفي ، أو بنهج جراحي للتنقيب أو بضع الأنف أو بضع الجيوب الأنفي.

كما تم استخدام غسل الأنف ، الذي يتضمن إعطاء محلول ملحي معقم في تجويف الأنف ، لأخذ عينات من تجويف أنف لأغراض التشخيص والعلاج. يطلق على نسخة بديلة من تقنية غسل الأنف التي تم استخدامها لأورام الأنف اسم النبض المائي الأنفي ، والذي يوصف بأنه احمرار الأنف القوي ، والذي يمكن أن يزيح عينات الورم الكبيرة للتقييم التشخيصي بالإضافة إلى توفير الراحة العلاجية لتحسين العلامات السريرية المرتبطة بسرطان^{الأنف 8}.

نقدم هنا نسخة أخرى من تقنية غسل الأنف للغرض المقصود هو جمع وتحليل الخلايا والبروتينات في البيئة المكروية المناعية للأنف. من خلال نهج لطيف وغير جراحي نسبيا ، قمنا بتحسين تقنية غسل الأنف هذه لأخذ عينات البيئة المكروية المناعية الأنفية التسلسلية. في التجارب التي شملت المصابة بتجاويف الأنف غير الملتهبة ، وعدوى فيروس الهربس النشطة ، وأورام الجيوب الأنفية ، أثبتنا فائدة غسل الأنف لجمع ومعالجة العينات للتطبيقات النهائية^9،10.

في هذه المخطوطة ، نصف تقنية غسل الأنف الملحي لأخذ عينات متسلسلة من البيئة المكروية المناعية للأنف للكلاب. نحن نقدم تفاصيل البروتوكول للحصول على عينة غسل الأنف بشكل فعال مع الحد الأدنى من اضطراب الأنسجة ثم معالجة العينات لمجموعة متنوعة من التحليلات.

Protocol

تمت الموافقة على إجراء غسل الأنف هذا من قبل لجنة رعاية المؤسسي بجامعة ولاية كولورادو ومجلس المراجعة السريرية (IACUC # 2425). يتم تقديم رسم تخطيطي لطريقة غسل الأنف في الشكل 1.

1. التحضير لغسل الأنف

1. في اليوم السابق لإجراء غسل الأنف ، املأ خمس محاقن سعة 20 مل بمحلول ملحي فسيولوجي معقم (محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪) وأغلقه بغطاء. ضع المحاقن في حاضنة مضبوطة على 37 ^درجةمئوية حتى تسخن طوال الليل.

2. وضع لغسل الأنف

1. تخدير للإجراء (على سبيل المثال ، عن طريق الحقن الوريدي (IV) من ديكسميديتوميدين (1-4 ميكروغرام / كغ) وبوتورفانول (0.2-0.5 مجم / كغ) من خلال قسطرة وريدية) ، متبوعا بإعطاء البروبوفول الوريدي (2-5 مجم / كغ) معايرة للتأثير على التنبيب ؛ الحفاظ على التخدير مع 1-2٪ من الأيزوفلوران المستنشق لتأثير.) تأكد من عمق التخدير المناسب عن طريق التحقق من الاستجابة الجفنية ونغمة الفك.
2. قم بتليين العينين لمنع الجفاف أثناء العملية.
3. مراقبة قيم قياس القلب عن بعد وضغط الدم وتصوير الرأسمالية وقياس التأكسج النبضي طوال العملية.
4. ضع المخدر في الاستلقاء القصي. ضع رأس بحيث يكون بزاوية طبيعية ومريحة بزاوية لأسفل من حافة طاولة العلاج لجمع عينات غسل الأنف بشكل مثالي.
5. قم بتضخيم سوار الأنبوب الرغامي لضمان إحكام إغلاق مجرى الهواء.

3. إجراء غسل الأنف

1. قم بقص قسطرة مطاطية حمراء معقمة 8 FR في القاعدة بحيث تتناسب بشكل مريح مع إحدى المحاقن المعبأة مسبقا سعة 20 مل والتي تحتوي على المحلول الملحي الدافئ. قم بقياس قسطرة مطاطية حمراء معقمة بحيث يمتد الطرف البعيد للقسطرة إلى منتصف الطريق تقريبا إلى تجويف الأنف عند إدخاله من خلال فتحة الأنف. في حالة أخذ عينات من ورم أنفي، استخدم التصوير أو التوجيه بنظير الأنف لتقدير موقع الجانب المنقاري للورم الأنفي لقياس طول القسطرة المطاطية الحمراء بحيث يمتد الطرف إلى الجانب المنقاري للورم.
2. بعد ذلك ، قم بقص القسطرة عند الطرف لطول القسطرة داخل الأنف المحدد بحيث يهبط الطرف في المكان المناسب عند إدخاله في تجويف الأنف. ومع ذلك ، اسمح بطول إضافي لقاعدة القسطرة الممتدة خارج فتحة الأنف (طول القسطرة من نقطة تثبيت المحقنة إلى مدخل فتحة الأنف ، حوالي 3-5 سم). ضع علامة بعلامة دائمة على الطرف الأساسي للقسطرة للإشارة إلى نقطة البداية ، المقابلة لمدخل فتحة الأنف ؛ يمتد طول القسطرة المحدد مسبقا داخل الأنف ، مع وضع طرف القسطرة في المكان المطلوب داخل تجويف الأنف.
3. سيتطلب إجراء عملية غسل الأنف مشاركة شخصين. اجعل شخصا واحدا (الشخص أ) مسؤولا عن تغذية القسطرة في تجويف الأنف وإدارة الغسيل والشخص الآخر (الشخص ب) لجمع العينة عند خروجها من الأنف.
4. اجعل الشخص أ يضع نفسه أمام رأس وتحته. بأيدي مرتدية القفازات ، اطلب من الشخص A توجيه طرف القسطرة المطاطية الحمراء برفق إلى الجانب الإنسي من تجويف الأنف وتقدمه حتى تصطف العلامة الموجودة على القسطرة مع الجانب الخارجي لفتحة الأنف. خلال هذه العملية ، تأكد من توصيل القسطرة بالمحقنة التي تحتوي على محلول ملحي معقم دافئ. اطلب من الشخص ب حمل أنبوب مخروطي سعة 50 مل أسفل فتحة الأنف مع وضع القسطرة في مكانها.
5. الشخص أ يسد فتحة الأنف المقابلة برفق ويبدأ في ضخ المحلول الملحي في تجويف الأنف بضغط بطيء وثابت أو بتسريب نبضي. عندما يتم وضع رأس بزاوية هبوطية ، يقوم الشخص ب بجمع السائل الذي يخرج من تجويف الأنف عن طريق الجاذبية إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.
6. كرر تقنية غسل الأنف هذه لما يصل إلى خمسة غسلات ملحية سعة 20 مل ، وتغيير الأنابيب المخروطية ، حسب الحاجة ، لجمع العينات المجمعة. سجل الحجم الإجمالي لسائل غسل الأنف الذي تم جمعه بالنسبة لكمية المحلول الملحي المنقوعة بعد الانتهاء من الإجراء.
7. بمجرد الانتهاء ، إذا تم تخديره باستخدام ديكسميديتوميدين ، فقم بإعطاء نفس حجم الأتيباميزول عن طريق الحقن العضلي المستخدم في ديكسميديتوميدين ، والسماح للكلب بالتعافي من التخدير. لتوخي الحذر ، حافظ على في حالة استلقاء قصي مع وضع الرأس لأسفل لتسهيل تصريف إضافي لأي محلول ملحي متبقي من غسل الأنف.

4. معالجة عينة غسل الأنف

1. قم بدوامة و / أو ماصة عينات غسل الأنف الموجودة داخل الأنابيب المخروطية برفق لتفتيت كتل الحطام والخلايا. مرر عينات غسل الأنف المجمعة عبر مرشح إجهاد خلية 70 ميكرومتر لإزالة الحطام والمخاط الكبير. الطرد المركزي للعينات عند 300 × جم لمدة 5-10 دقائق لتشكيل حبيبات خلية.
2. اجمع المادة الطافية عن طريق الشفط باستخدام ماصة وقم بإيداعها في أنبوب نظيف لتحليل البروتينات ذات الأهمية.
3. أعد تعليق كريات الخلايا في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أو المحلول المفضل لفحوصات الخلية ذات الأهمية.
4. لإزالة خلايا الدم الحمراء من العينات ، قم بإجراء تحلل كلوريد الأمونيوم والبوتاسيوم (ACK) لجمع الخلايا المنواة من غسل الأنف^11،12.

النتائج

باستخدام طريقة غسل الأنف هذه ، ستظهر العينة التي تم جمعها غائمة قليلا ، وربما مع قطع مرئية من الحطام الخلوي والمخاط عند تحريك الأنبوب. تعتبر العينة ملوثة بالدم المحيطي إذا أدى إجراء الغسيل إلى نزيف عن غير قصد ، وكانت العينة مشوبة باللون الأحمر. في حين أن بعض المحلول الملح...

Discussion

هناك العديد من الخطوات الحاسمة في بروتوكول غسل الأنف. فيما يتعلق بالكلب الذي يخضع لعملية غسل الأنف ، يجب أن يكون ضمن مستوى عميق بما فيه الكفاية من التخدير حتى لا يتفاعل مع وضع القسطرة أو إدارة الغسيل. إذا كانت متفاعلة تحت التخدير ، فقد يضر ذلك بجودة وكمية جمع عينات الغسيل ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL  Tubes	Eppendorf	05-402
1000 µL Pipette	VWR	89079-974
1x PBS	Corning	21-040-CV
20 mL Syringes	VWR	BD302830
50 mL Conical Tubes	VWR	89039-656
70 µm Cell Strainer	Fisherbrand	22-363-548
8FR Sterile Red Rubber Catheter	Med Vet International	50-252-2428
ACK Lysis Buffer	Gibco	A1049201
Centrifuge	Beckman Coulter	366816
Physiological Saline (0.9%)	Vetivex	17033-492-01
Vortex	VWR	10153-838