Lavage salin pour l’échantillonnage du microenvironnement immunitaire nasal canin

Résumé

Le lavage nasal salin peut être utilisé pour échantillonner le microenvironnement immunitaire nasal canin. Parce que l’approche est relativement non invasive et ne perturbe pas les tissus nasaux, elle peut être réalisée en série. Les cellules et les protéines collectées à partir de la technique de lavage nasal peuvent être traitées pour diverses analyses de laboratoire.

Résumé

L’évaluation du microenvironnement immunitaire local de la cavité nasale canine peut être importante pour étudier la santé normale des tissus et les maladies, en particulier celles associées à une inflammation locale. Nous avons optimisé une technique pour évaluer le microenvironnement immunitaire nasal local des chiens via un lavage nasal en série. Brièvement, avec les chiens sous anesthésie et positionnés en décubitus sternal, une solution saline stérile préchauffée est rincée dans la narine affectée à l’aide d’un cathéter en caoutchouc souple flexible. Le reflux de fluide est collecté dans des tubes coniques, et ce processus est répété. Les fluides contenant les cellules et les protéines délogées sont regroupés, et les échantillons de lavage nasal sont filtrés à travers une crépine cellulaire pour éliminer les gros débris et le mucus. Les échantillons sont centrifugés et les pastilles de cellules sont isolées pour analyse. Une fois les échantillons traités, les analyses qui peuvent suivre le lavage nasal comprennent la cytométrie en flux, l’analyse transcriptomique des cellules par séquençage de l’ARN en vrac ou sur cellule unique, et/ou la quantification des cytokines présentes dans le liquide de lavage.

Introduction

Les chiens développent régulièrement des affections nasales inflammatoires tout au long de leur vie. La cause sous-jacente de la rhinite aiguë ou chronique chez le chien peut aller d’infectieuse (virale : par exemple, grippe, parainfluenza, herpèsvirus ; bactérienne [par exemple, Bordetella, mycoplasmes], fongique [par exemple, aspergillose, cryptococcose] ; parasitaire [par exemple, acariens nasaux]) à néoplasique (par exemple, tumeurs malignes sinusales, le plus souvent des histotypes de carcinome ou de sarcome) à des matériaux étrangers (par exemple, corps étranger, migration intranasale des dents déplacées) à une maladie parodontale, ainsi que la rhinite inflammatoire idiopathique canine 1,2,3,4,5,6,7.

En plus d’un examen physique, diverses approches sont utilisées pour évaluer l’état de la cavité sinuso-nasale chez les chiens souffrant d’inflammation nasale. Les procédures d’imagerie peuvent inclure des radiographies (dentaire, crâne), une tomodensitométrie (TDM) ou une imagerie par résonance magnétique (IRM). Une autre approche de l’imagerie de la cavité nasale est la rhinoscopie. L’échantillonnage des tissus peut impliquer l’acquisition d’écouvillons nasaux, d’échantillons de brosses ou de biopsies tissulaires, à partir desquels une évaluation cytologique et/ou histopathologique peut être effectuée, ainsi que la soumission d’échantillons pour une culture fongique ou bactérienne. Ces échantillons peuvent être obtenus par diverses approches, allant de l’échantillonnage « à l’aveugle » à la rhinoscopie guidée par l’imagerie ou l’imagerie avancée, et acquis par les narines, à partir du nasopharynx, ou par une approche chirurgicale de trépanation, de rhinotomie ou de sinusotomie.

Le lavage nasal, qui consiste à administrer une solution saline stérile dans la cavité nasale, a également été utilisé pour prélever des échantillons dans la cavité nasale canine à des fins diagnostiques et thérapeutiques. Une version alternative de la technique de lavage nasal qui a été utilisée pour les tumeurs nasales est appelée hydropulsion nasale, décrite comme un rinçage nasal puissant, qui peut déloger de grands échantillons de tumeurs pour une évaluation diagnostique ainsi que fournir un soulagement thérapeutique pour l’amélioration des signes cliniques associés au cancer du nez⁸.

Nous présentons ici une autre version de la technique de lavage nasal dans le but de collecter et d’analyser les cellules et les protéines du microenvironnement immunitaire nasal. Grâce à une approche douce et relativement non invasive, nous avons optimisé cette technique de lavage nasal pour l’échantillonnage en série du microenvironnement immunitaire nasal. Dans des essais impliquant des chiens présentant des cavités nasales non enflammées, une infection à herpèsvirus active et des tumeurs sinuso-nasales, nous avons démontré l’utilité du lavage nasal pour la collecte et le traitement d’échantillons pour des applications en aval ^9,10.

Dans ce manuscrit, nous décrivons une technique de lavage nasal salin pour l’échantillonnage en série du microenvironnement immunitaire nasal canin. Nous fournissons les détails du protocole pour acquérir efficacement l’échantillon de lavage nasal avec un minimum de perturbation des tissus, puis traiter les échantillons pour une variété d’analyses.

Protocole

Cette procédure de lavage nasal a été approuvée par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université d’État du Colorado et le conseil d’examen clinique (IACUC #2425). Un schéma de la méthode de lavage nasal est présenté à la figure 1.

1. Préparation au lavage nasal

1. La veille de la procédure de lavage nasal, remplissez cinq seringues de 20 ml avec une solution saline physiologique stérile (solution de chlorure de sodium à 0,9 %) et fermez avec un bouchon. Placez les seringues dans un incubateur réglé à 37 ^°C pour qu’elles puissent se réchauffer pendant la nuit.

2. Positionnement du chien pour le lavage nasal

1. Anesthésier le chien pour l’intervention (p. ex., par injection intraveineuse (IV) de dexmédétomidine (1-4 μg/kg) et de butorphanol (0,2-0,5 mg/kg) à travers un cathéter IV), suivie de l’administration de propofol IV (2-5 mg/kg) titré pour l’intubation ; Maintenez l’anesthésie avec 1-2 % d’isoflurane inhalé pour faire effet.) Confirmez la profondeur appropriée de l’anesthésie en vérifiant la réponse palpébrale et le tonus de la mâchoire.
2. Lubrifiez les yeux pour éviter le dessèchement pendant la procédure.
3. Surveiller la télémétrie cardiaque, la pression artérielle, la canographie et les valeurs d’oxymétrie de pouls tout au long de la procédure.
4. Positionnez le chien anesthésié en décubitus sternal. Placez la tête du chien de manière à ce qu’elle soit inclinée naturellement et confortablement vers le bas par rapport au bord de la table de traitement pour un prélèvement optimal d’échantillons de lavage nasal.
5. Gonflez le ballonnet de la sonde endotrachéale pour assurer une étanchéité des voies respiratoires.

3. Réalisation du lavage nasal

1. Coupez un cathéter en caoutchouc rouge stérile de 8 FR à la base de manière à ce qu’il s’adapte parfaitement à l’une des seringues préremplies de 20 ml contenant la solution saline chaude. Mesurez un cathéter en caoutchouc rouge stérile de sorte que l’extrémité distale du cathéter s’étende jusqu’à environ mi-chemin dans la cavité nasale lorsqu’elle est introduite par la narine. Si vous prélevez une tumeur nasale, utilisez l’imagerie ou le guidage rhinoscopique pour estimer l’emplacement de la face rostrale de la tumeur nasale afin de mesurer la longueur du cathéter en caoutchouc rouge afin que la pointe s’étende à la face rostrale de la tumeur.
2. Ensuite, coupez le cathéter à l’extrémité sur la longueur définie du cathéter intranasal afin que l’extrémité atterrisse à l’endroit approprié lorsqu’elle est insérée dans la cavité nasale. Cependant, prévoyez une longueur supplémentaire pour la base du cathéter s’étendant à l’extérieur de la narine (longueur du cathéter du point de fixation de la seringue à l’entrée de la narine, environ 3 à 5 cm). Appliquer une marque avec un marqueur permanent à l’extrémité inférieure du cathéter pour indiquer le point de départ, correspondant à l’entrée de la narine ; La longueur prédéterminée du cathéter s’étendra par voie intranasale, l’extrémité du cathéter étant positionnée à l’endroit souhaité dans la cavité nasale.
3. La réalisation de la procédure de lavage nasal nécessitera la participation de deux personnes. Désigner une personne (personne A) responsable de l’introduction du cathéter dans la cavité nasale et de l’administration du lavage, et la charge de l’autre personne (personne B) du prélèvement de l’échantillon à la sortie du nez.
4. Demandez à la personne A de se positionner devant et en dessous de la tête du chien. Avec des mains gantées, demandez à la personne A de guider doucement l’extrémité du cathéter en caoutchouc rouge dans la face médiale de la cavité nasale et de l’avancer jusqu’à ce que la marque sur le cathéter s’aligne avec la face externe de la narine. Au cours de ce processus, assurez-vous que le cathéter est connecté à la seringue contenant la solution saline stérile chauffée. Demandez à la personne B de tenir un tube conique de 50 ml sous la narine avec le cathéter en place.
5. La personne A obstrue doucement la narine controlatérale et commence à perfuser la solution saline dans la cavité nasale avec une pression lente et régulière ou avec une perfusion pulsée. Lorsque la tête du chien est positionnée vers le bas, la personne B recueille le liquide qui s’écoule de la cavité nasale par gravité dans le tube conique de 50 ml.
6. Répétez cette technique de lavage nasal pour un total de cinq lavages salins de 20 ml, en changeant les tubes coniques, au besoin, pour prélever les échantillons groupés. Noter le volume total de liquide de lavage nasal recueilli par rapport à la quantité de solution saline perfusée après la fin de l’intervention.
7. Une fois terminé, s’il est anesthésié avec de la dexmédétomidine, administrez par voie intramusculaire le même volume d’atipamézole que celui utilisé pour la dexmédétomidine, et permettez au chien de se remettre de l’anesthésie. Pour être prudent, gardez le chien en position couchée sternale avec la tête positionnée vers le bas pour faciliter le drainage supplémentaire de toute solution saline résiduelle du lavage nasal.

4. Traitement de l’échantillon de lavage nasal

1. Manipulez doucement et/ou pipetez les échantillons de lavage nasal contenus dans les tubes coniques pour briser les amas de débris et de cellules. Faites passer les échantillons de lavage nasal groupés à travers un filtre de filtrage cellulaire de 70 μm pour éliminer les gros débris et le mucus. Centrifuger les échantillons à 300 × g pendant 5 à 10 minutes pour former une pastille cellulaire.
2. Prélever le surnageant par aspiration à l’aide d’une pipette et le déposer dans un tube propre pour l’analyse des protéines d’intérêt.
3. Remettre en suspension les pastilles cellulaires dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou dans une solution préférée pour les tests cellulaires d’intérêt.
4. Pour éliminer les globules rouges des échantillons, effectuez une lyse ammonium-chlorure-potassium (ACK) pour collecter les cellules nucléées du lavage nasal^11,12.

Résultats

Avec cette méthode de lavage nasal, l’échantillon collecté apparaîtra légèrement trouble, éventuellement avec des morceaux visibles de débris cellulaires et de mucus lorsque le tube est tourbillonné. Un échantillon serait considéré comme contaminé par du sang périphérique si la procédure de lavage induit par inadvertance un saignement et que l’échantillon est teinté de rouge. Bien qu’une partie de la solution saline perfusée soit perdue pendant la procédure, un ...

Discussion

Le protocole de lavage nasal comporte plusieurs étapes critiques. En ce qui concerne le chien subissant la procédure de lavage nasal, le chien doit se trouver dans un plan d’anesthésie suffisamment profond pour qu’il ne réagisse pas à la mise en place du cathéter ou à l’administration du lavage. S’ils réagissent sous anesthésie, cela peut compromettre la qualité et la quantité de la collecte d’échantillons de lavage, ainsi qu’augmenter les risques de lésions aigu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL  Tubes	Eppendorf	05-402
1000 µL Pipette	VWR	89079-974
1x PBS	Corning	21-040-CV
20 mL Syringes	VWR	BD302830
50 mL Conical Tubes	VWR	89039-656
70 µm Cell Strainer	Fisherbrand	22-363-548
8FR Sterile Red Rubber Catheter	Med Vet International	50-252-2428
ACK Lysis Buffer	Gibco	A1049201
Centrifuge	Beckman Coulter	366816
Physiological Saline (0.9%)	Vetivex	17033-492-01
Vortex	VWR	10153-838