Köpek Nazal İmmün Mikroçevresinin Örneklenmesi için Tuzlu Su Lavajı

Özet

Tuzlu burun lavajı, köpek burun bağışıklık mikroçevresini örneklemek için kullanılabilir. Yaklaşım nispeten non-invaziv olduğu ve burun dokularını bozmadığı için seri olarak uygulanabilir. Nazal lavaj tekniğinden toplanan hücreler ve proteinler çeşitli laboratuvar analizleri için işlenebilir.

Özet

Köpek burun boşluğunun lokal bağışıklık mikro ortamının değerlendirilmesi, normal doku sağlığı ve hastalık durumlarının, özellikle de lokal inflamasyonla ilişkili olanların araştırılması için önemli olabilir. Seri nazal lavaj yoluyla köpeklerin lokal nazal bağışıklık mikro çevresini değerlendirmek için bir tekniği optimize ettik. Kısaca, anestezi altındaki köpeklerde ve sternal yaslanma pozisyonunda, önceden ısıtılmış steril salin, esnek bir yumuşak kauçuk kateter kullanılarak etkilenen burun deliğine akıtılır. Sıvı geri akışı konik borularda toplanır ve bu işlem tekrarlanır. Yerinden çıkmış hücreler ve proteinler içeren sıvılar toplanır ve havuzlanan nazal lavaj örnekleri, büyük döküntüleri ve mukusu uzaklaştırmak için bir hücre süzgecinden süzülür. Numuneler santrifüjlenir ve hücre peletleri analiz için izole edilir. Numuneler işlendikten sonra, nazal lavajı takip edebilecek analizler arasında akış sitometrisi, toplu veya tek hücreli RNA dizilimi yoluyla hücrelerin transkriptomik analizi ve/veya lavaj sıvısında bulunan sitokinlerin miktar tayini yer alır.

Giriş

Köpekler yaşamları boyunca rutin olarak inflamatuar burun rahatsızlıkları geliştirirler. Köpeklerde akut veya kronik rinitin altında yatan neden, bulaşıcı (viral: örneğin, grip, parainfluenza, herpesvirüsler; bakteriyel [örneğin, Bordetella, mikoplazmalar], mantar [örneğin, aspergilloz, kriptokokoz]; parazitik [örneğin, burun akarları]) neoplastik (örneğin, sinonazal maligniteler, en yaygın olarak karsinom veya sarkom histotipleri) yabancı maddelere (örneğin, yabancı cisim, yer değiştirmiş dişlerin intranazal göçü) periodontal hastalığa kadar değişebilir. yanı sıra köpek idiyopatik inflamatuar rinit 1,2,3,4,5,6,7.

Fizik muayeneye ek olarak, burun iltihabı olan köpeklerde sinonazal boşluğun durumunu değerlendirmek için çeşitli yaklaşımlar kullanılır. Görüntüleme prosedürleri radyografileri (diş, kafatası), bilgisayarlı tomografi (BT) veya manyetik rezonans görüntülemeyi (MRI) içerebilir. Burun boşluğunu görüntülemek için başka bir yaklaşım rinoskopidir. Doku örneklemesi, sitolojik ve/veya histopatolojik değerlendirmenin yapılabileceği burun sürüntüleri, fırça örnekleri veya doku biyopsilerinin alınmasını ve ayrıca mantar veya bakteri kültürü için örnek gönderimini içerebilir. Bu örnekler, "kör" örneklemeden, rinoskopi veya ileri görüntüleme ile görüntü kılavuzluğuna kadar çeşitli yaklaşımlarla elde edilebilir ve burun bölgesinden, nazofarenksten veya trefinasyon, rinotomi veya sinüzotomi gibi cerrahi bir yaklaşımla elde edilebilir.

Burun boşluğuna steril salin uygulanmasını içeren burun lavajı, teşhis ve tedavi amaçlı köpek burun boşluğundan numune almak için de kullanılmıştır. Nazal tümörler için kullanılan nazal lavaj tekniğinin alternatif bir versiyonu, nazal hidropulsiyon olarak adlandırılır ve tanısal değerlendirme için büyük tümör örneklerini yerinden çıkarabilen ve aynı zamanda nazal kanser ile ilişkili klinik belirtilerin iyileştirilmesi için terapötik rahatlama sağlayan güçlü burun kızarması olarak tanımlanır⁸.

Burada, nazal immün mikroçevrenin hücrelerini ve proteinlerini toplamak ve analiz etmek amacıyla nazal lavaj tekniğinin başka bir versiyonunu sunuyoruz. Nazik, nispeten invaziv olmayan bir yaklaşımla, bu nazal lavaj tekniğini seri nazal immün mikroçevre örneklemesi için optimize ettik. İltihapsız burun boşlukları, aktif herpes virüsü enfeksiyonu ve sinonazal tümörleri olan köpekleri içeren denemelerde, aşağı akış uygulamaları için numunelerin toplanması ve işlenmesi için nazal lavajın faydasını gösterdik ^9,10.

Bu yazıda, köpek nazal immün mikroçevresinin seri örneklemesi için bir tuzlu burun lavajı tekniği tanımlanmıştır. Nazal lavaj örneğinin dokularda minimum bozulma ile etkili bir şekilde elde edilmesi ve ardından örneklerin çeşitli analizler için işlenmesi için protokol ayrıntıları sağlıyoruz.

Protokol

Bu nazal lavaj prosedürü, Colorado Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Klinik İnceleme Kurulu (IACUC # 2425) tarafından onaylanmıştır. Nazal lavaj yönteminin bir şeması Şekil 1'de sunulmuştur.

1. Burun lavajı için hazırlık

1. Nazal lavaj işleminden bir gün önce, beş adet 20 mL'lik şırıngayı steril fizyolojik salin (% 0.9 sodyum klorür çözeltisi) ile doldurun ve bir kapakla kapatın. Şırıngaları, gece boyunca ısınabilmeleri için 37 ^°C'ye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin.

2. Köpeği burun lavajı için konumlandırma

1. Prosedür için köpeği uyuşturun (ör., intravenöz (IV) deksmedetomidin (1-4 μg / kg) ve butorphanol (0.2-0.5 mg / kg) enjeksiyonu ile bir IV kateter aracılığıyla), ardından propofol IV (2-5 mg / kg) entübasyon için titre edilir; Etkili olması için% 1-2 inhalan izofluran ile anesteziyi sürdürün.) Palpebral yanıtı ve çene tonusunu kontrol ederek uygun anestezi derinliğini onaylayın.
2. İşlem sırasında kurumasını önlemek için gözleri yağlayın.
3. İşlem boyunca kardiyak telemetri, kan basıncı, kapnografi ve nabız oksimetre değerlerini izleyin.
4. Anestezi uygulanmış köpeği sternal yaslanacak şekilde konumlandırın. Köpeğin kafasını, optimum nazal lavaj örneği toplamak için tedavi masasının kenarından aşağı doğru bir açıyla doğal ve rahat bir açıyla açılandıracak şekilde yerleştirin.
5. Hava yolunun sıkı bir şekilde kapatılmasını sağlamak için endotrakeal tüpün manşetini şişirin.

3. Burun lavajının yapılması

1. Tabanda 8 FR steril, kırmızı kauçuk kateter, ılık salin içeren önceden doldurulmuş 20 mL şırıngalardan birine sıkıca oturacak şekilde kesin. Steril bir kırmızı kauçuk kateter ölçün, böylece kateterin distal ucu burun deliğinden sokulduğunda burun boşluğunun yaklaşık ortasına kadar uzanacaktır. Bir burun tümöründen numune alıyorsanız, kırmızı kauçuk kateterin uzunluğunu ölçmek için burun tümörünün rostral yönünün konumunu tahmin etmek için görüntüleme veya rinoskopik rehberlik kullanın, böylece uç tümörün rostral yönüne uzanacaktır.
2. Daha sonra burun boşluğuna yerleştirildiğinde ucun uygun yere inmesi için tanımlanan burun içi kateter uzunluğu için kateteri uçtan kesin. Bununla birlikte, burun deliğinin dışına uzanan kateter tabanı için ek uzunluk bırakın (şırınga sabitleme noktasından burun deliği girişine kadar kateter uzunluğu, yaklaşık 3-5 cm). Burun deliği girişine karşılık gelen başlangıç noktasını belirtmek için kateterin taban ucuna kalıcı bir işaretleyici ile bir işaret uygulayın; Önceden belirlenen kateter uzunluğu, kateter ucu burun boşluğu içinde istenen yere yerleştirilerek intranazal olarak uzanacaktır.
3. Nazal lavaj prosedürünün gerçekleştirilmesi iki kişinin katılımını gerektirecektir. Bir kişiyi (Kişi A) kateteri burun boşluğuna beslemekten ve lavajı uygulamaktan ve diğer kişiyi (Kişi B) numuneyi burundan çıkarken almaktan sorumlu tutun.
4. A Kişisinin kendisini köpeğin başının önünde ve altında konumlandırmasını sağlayın. Eldivenli ellerle, A Kişisinin kırmızı lastik kateterin ucunu nazikçe burun boşluğunun medial yönüne yönlendirmesini ve kateter üzerindeki işaret burun deliğinin dış yüzü ile aynı hizaya gelene kadar ilerletmesini sağlayın. Bu işlem sırasında, kateterin ısıtılmış steril salin içeren şırıngaya bağlı olduğundan emin olun. B Kişisinin, kateter yerindeyken burun deliğinin altında 50 mL'lik konik bir tüp tutmasını sağlayın.
5. A kişisi, kontralateral burun deliğini nazikçe tıkar ve salini yavaş, sabit bir basınçla veya darbeli bir infüzyonla burun boşluğuna infüze etmeye başlar. Köpeğin kafası aşağı doğru bir açıyla konumlandırıldığından, B kişisi yerçekimi yoluyla burun boşluğundan dışarı akan sıvıyı 50 mL'lik konik tüpe toplar.
6. Bu nazal lavaj tekniğini toplam beş adet 20 mL tuzlu su lavajı için tekrarlayın ve havuzlanan numuneleri toplamak için gerektiğinde konik tüpleri değiştirin. İşlemin tamamlanmasının ardından infüze edilen salin miktarına göre toplanan toplam nazal lavaj sıvısı hacmini kaydedin.
7. Tamamlandıktan sonra, deksmedetomidin ile anestezi yapılırsa, deksmedetomidin için kullanılanla aynı hacimde atipamezolün intramüsküler olarak uygulayın ve köpeğin anesteziden kurtulmasına izin verin. Dikkatli olmak için, nazal lavajdan kalan tuzlu suyun ek drenajını kolaylaştırmak için köpeği baş aşağı bakacak şekilde sternal yaslanmada tutun.

4. Nazal lavaj örneğinin işlenmesi

1. Kalıntı ve hücre kümelerini parçalamak için konik tüplerin içinde bulunan nazal lavaj örneklerini nazikçe girdaplayın ve/veya pipetleyin. Büyük kalıntıları ve mukusu gidermek için havuzlanmış nazal lavaj örneklerini 70 μm'lik bir hücre süzme filtresinden geçirin. Bir hücre peleti oluşturmak için numuneleri 300 × g'da 5-10 dakika santrifüjleyin.
2. Süpernatanı bir pipetle aspirasyon yoluyla toplayın ve ilgilenilen proteinlerin analizi için temiz bir tüpe koyun.
3. Hücre peletlerini fosfat tamponlu salin (PBS) veya ilgilenilen hücre tahlilleri için tercih edilen çözelti içinde yeniden süspanse edin.
4. Örneklerden kırmızı kan hücrelerini temizlemek için, nazal lavajdan çekirdekli hücreleri toplamak için amonyum-klorür-potasyum (ACK) lizisi gerçekleştirin^11,12.

Sonuçlar

Bu nazal lavaj yöntemiyle, toplanan örnek, tüp döndürüldüğünde muhtemelen görünür hücresel kalıntı ve mukus parçaları ile birlikte hafif bulanık görünecektir. Lavaj prosedürü yanlışlıkla kanamaya neden olursa ve numune kırmızıya boyanırsa, bir numune periferik kanla kontamine olarak kabul edilir. İnfüzyon edilen salinin bir kısmı prosedür sırasında kaybolacak olsa da, infüze edilen salin burun deliğinden tüpe geri akmazsa negatif bir lavaj düşün?...

Tartışmalar

Nazal lavaj protokolünde birkaç kritik adım vardır. Nazal lavaj prosedürü uygulanan köpekle ilgili olarak, köpeğin kateter yerleştirilmesine veya lavaj uygulamasına tepki vermemesi için yeterince derin bir anestezi düzlemi içinde olması gerekir. Anestezi altında reaktif olurlarsa, bu, lavaj örneği toplamanın kalitesini ve miktarını tehlikeye atabilir ve ayrıca intranazal kateterden gelen lokal travma veya lavaj sıvısını aspire eden köpek için akut burun dokusu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL  Tubes	Eppendorf	05-402
1000 µL Pipette	VWR	89079-974
1x PBS	Corning	21-040-CV
20 mL Syringes	VWR	BD302830
50 mL Conical Tubes	VWR	89039-656
70 µm Cell Strainer	Fisherbrand	22-363-548
8FR Sterile Red Rubber Catheter	Med Vet International	50-252-2428
ACK Lysis Buffer	Gibco	A1049201
Centrifuge	Beckman Coulter	366816
Physiological Saline (0.9%)	Vetivex	17033-492-01
Vortex	VWR	10153-838