Lavagem salina para amostragem do microambiente imunológico nasal canino

Resumo

A lavagem nasal salina pode ser usada para coletar amostras do microambiente imunológico nasal canino. Como a abordagem é relativamente não invasiva e não rompe os tecidos nasais, ela pode ser realizada em série. Células e proteínas coletadas da técnica de lavagem nasal podem ser processadas para várias análises laboratoriais.

Resumo

Avaliar o microambiente imunológico local da cavidade nasal canina pode ser importante para investigar condições normais de saúde e doença dos tecidos, particularmente aquelas associadas à inflamação local. Otimizamos uma técnica para avaliar o microambiente imune nasal local de cães por meio de lavagem nasal seriada. Resumidamente, com cães sob anestesia e posicionados em decúbito esternal, solução salina estéril pré-aquecida é lavada na narina afetada usando um cateter de borracha macia flexível. O refluxo do fluido é coletado em tubos cônicos e esse processo é repetido. Os fluidos contendo células e proteínas desalojadas são agrupados e as amostras de lavagem nasal agrupadas são filtradas através de um filtro de células para remover grandes detritos e muco. As amostras são centrifugadas e os pellets celulares são isolados para análise. Uma vez que as amostras tenham sido processadas, as análises que podem seguir a lavagem nasal incluem citometria de fluxo, análise transcriptômica de células via RNA seq em massa ou de célula única e/ou quantificação de citocinas presentes no fluido de lavagem.

Introdução

Os cães desenvolvem rotineiramente condições nasais inflamatórias ao longo da vida. A causa subjacente da rinite aguda ou crônica em cães pode variar de infecciosa (viral: por exemplo, gripe, parainfluenza, herpesvírus; bacteriana [por exemplo, Bordetella, micoplasmas], fúngica [por exemplo, aspergilose, criptococose]; parasitária [por exemplo, ácaros nasais]) a neoplásica (por exemplo, neoplasias nasossinusais, mais comumente histotipos de carcinoma ou sarcoma) a material estranho (por exemplo, corpo estranho, migração intranasal de dentes deslocados) a doença periodontal, bem como rinite inflamatória idiopática canina 1,2,3,4,5,6,7.

Além de um exame físico, várias abordagens são usadas para avaliar a condição da cavidade nasossinusal em cães com inflamação nasal. Os procedimentos de imagem podem incluir radiografias (dentária, crânio), tomografia computadorizada (TC) ou ressonância magnética (RM). Outra abordagem para a imagem da cavidade nasal é a rinoscopia. A amostragem de tecido pode envolver a aquisição de swabs nasais, amostras de escova ou biópsias de tecido, a partir das quais pode ser realizada avaliação citológica e/ou histopatológica, bem como o envio de amostras para cultura fúngica ou bacteriana. Essas amostras podem ser obtidas em uma variedade de abordagens, desde amostragem "cega" até guiada por imagem com rinoscopia ou imagem avançada, e adquiridas através das narinas, da nasofaringe ou com uma abordagem cirúrgica de trepanação, rinotomia ou sinusotomia.

A lavagem nasal, que envolve a administração de solução salina estéril na cavidade nasal, também tem sido usada para amostragem da cavidade nasal canina para fins diagnósticos e terapêuticos. Uma versão alternativa da técnica de lavagem nasal que tem sido usada para tumores nasais é denominada hidropulsão nasal, descrita como lavagem nasal forçada, que pode desalojar grandes amostras tumorais para avaliação diagnóstica, bem como fornecer alívio terapêutico para a melhora dos sinais clínicos associados ao câncer nasal⁸.

Apresentamos aqui outra versão da técnica de lavagem nasal com o objetivo pretendido de coletar e analisar células e proteínas do microambiente imunológico nasal. Por meio de uma abordagem suave e relativamente não invasiva, otimizamos essa técnica de lavagem nasal para amostragem serial de microambiente imunológico nasal. Em ensaios envolvendo cães com fossas nasais não inflamadas, infecção ativa por herpesvírus e tumores nasossinusais, demonstramos a utilidade da lavagem nasal para a coleta e processamento de amostras para aplicações a jusante ^9,10.

Neste manuscrito, descrevemos uma técnica de lavagem nasal salina para amostragem seriada do microambiente imune nasal canino. Fornecemos detalhes do protocolo para adquirir a amostra de lavagem nasal de forma eficaz, com o mínimo de interrupção dos tecidos e, em seguida, processar as amostras para uma variedade de análises.

Protocolo

Este procedimento de lavagem nasal foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual do Colorado e pelo Conselho de Revisão Clínica (IACUC # 2425). Um esquema do método de lavagem nasal é apresentado na Figura 1.

1. Preparação para a lavagem nasal

1. No dia anterior ao procedimento de lavagem nasal, encha cinco seringas de 20 mL com soro fisiológico estéril (solução de cloreto de sódio a 0,9%) e feche com uma tampa. Coloque as seringas em uma incubadora ajustada para 37 ^oC para que possam aquecer durante a noite.

2. Posicionando o cão para a lavagem nasal

1. Anestesiar o cão para o procedimento (por exemplo, com injeção intravenosa (IV) de dexmedetomidina (1-4 μg/kg) e butorfanol (0,2-0,5 mg/kg) através de um cateter IV), seguido pela administração de propofol IV (2-5 mg/kg) titulado para efeito para intubação; manter a anestesia com 1-2% de isoflurano inalante para efeito.) Confirme a profundidade apropriada da anestesia verificando a resposta palpebral e o tônus da mandíbula.
2. Lubrifique os olhos para evitar o ressecamento durante o procedimento.
3. Monitore os valores de telemetria cardíaca, pressão arterial, capnografia e oximetria de pulso durante todo o procedimento.
4. Posicione o cão anestesiado em decúbito esternal. Coloque a cabeça do cão de forma que fique inclinada de forma natural e confortável em um ângulo descendente a partir da borda da mesa de tratamento para uma coleta ideal de amostras de lavagem nasal.
5. Infle o manguito do tubo endotraqueal para garantir uma vedação firme das vias aéreas.

3. Realização da lavagem nasal

1. Corte um cateter de borracha vermelha estéril de 8 FR na base para que ele se encaixe perfeitamente em uma das seringas pré-cheias de 20 mL contendo a solução salina quente. Meça um cateter de borracha vermelha estéril de modo que a ponta distal do cateter se estenda aproximadamente até a metade da cavidade nasal quando introduzida pela narina. Se estiver coletando amostras de um tumor nasal, use orientação por imagem ou rinoscópica para estimar a localização do aspecto rostral do tumor nasal para medir o comprimento do cateter de borracha vermelha para que a ponta se estenda até o aspecto rostral do tumor.
2. Em seguida, corte o cateter na ponta para o comprimento do cateter intranasal definido para que a ponta caia no local apropriado quando inserida na cavidade nasal. No entanto, deixe um comprimento adicional para a base do cateter que se estenda para fora da narina (comprimento do cateter do ponto de fixação da seringa até a entrada da narina, aproximadamente 3-5 cm). Aplicar uma marca com um marcador permanente na extremidade da base do cateter para indicar o ponto de partida, correspondente à entrada da narina; O comprimento predeterminado do cateter será intranasal, com a ponta do cateter posicionada no local desejado dentro da cavidade nasal.
3. A realização do procedimento de lavagem nasal exigirá a participação de dois indivíduos. Faça uma pessoa (Pessoa A) responsável por alimentar o cateter na cavidade nasal e administrar a lavagem e a outra pessoa (Pessoa B) por coletar a amostra quando ela sai do nariz.
4. Faça com que a Pessoa A se posicione na frente e abaixo da cabeça do cão. Com as mãos enluvadas, faça com que a Pessoa A guie suavemente a ponta do cateter de borracha vermelha para o aspecto medial da cavidade nasal e avance-o até que a marca no cateter se alinhe com o aspecto externo da narina. Durante este processo, certifique-se de que o cateter esteja conectado à seringa contendo a solução salina estéril aquecida. Faça com que a Pessoa B segure um tubo cônico de 50 mL abaixo da narina com o cateter no lugar.
5. A pessoa A oclui suavemente a narina contralateral e começa a infundir a solução salina na cavidade nasal com pressão lenta e constante ou com uma infusão pulsada. À medida que a cabeça do cão é posicionada em um ângulo descendente, a Pessoa B coleta o fluido que drena da cavidade nasal por gravidade para o tubo cônico de 50 mL.
6. Repita esta técnica de lavagem nasal para um total de cinco lavagens salinas de 20 mL, trocando os tubos cônicos, conforme necessário, para coletar as amostras agrupadas. Registre o volume total de líquido de lavagem nasal coletado em relação à quantidade de solução salina infundida após a conclusão do procedimento.
7. Uma vez concluído, se anestesiado com dexmedetomidina, administre por via intramuscular o mesmo volume de atipamezol usado para dexmedetomidina e permita que o cão se recupere da anestesia. Para ser cauteloso, mantenha o cão em decúbito esternal com a cabeça posicionada para baixo para facilitar a drenagem adicional de qualquer solução salina residual da lavagem nasal.

4. Processamento da amostra de lavagem nasal

1. Agite suavemente e/ou pipete as amostras de lavagem nasal contidas nos tubos cônicos para quebrar aglomerados de detritos e células. Passe as amostras de lavagem nasal agrupadas através de um filtro de coação celular de 70 μm para remover grandes detritos e muco. Centrifugue as amostras a 300 × g por 5-10 min para formar um pellet de célula.
2. Colete o sobrenadante por aspiração com uma pipeta e deposite-o em um tubo limpo para análise das proteínas de interesse.
3. Ressuspenda os grânulos celulares em solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou solução preferida para ensaios celulares de interesse.
4. Para eliminar os glóbulos vermelhos das amostras, faça a lise de cloreto de amônio-potássio (ACK) para coletar células nucleadas da lavagem nasal^11,12.

Resultados

Com este método de lavagem nasal, a amostra coletada parecerá ligeiramente turva, possivelmente com pedaços visíveis de detritos celulares e muco quando o tubo for girado. Uma amostra seria considerada contaminada com sangue periférico se o procedimento de lavagem induzir inadvertidamente sangramento e a amostra for tingida de vermelho. Embora parte da solução salina infundida seja perdida durante o procedimento, uma lavagem negativa seria considerada se a solução salina infundi...

Discussão

Existem várias etapas críticas no protocolo de lavagem nasal. Com relação ao cão submetido ao procedimento de lavagem nasal, o cão deve estar dentro de um plano de anestesia profundo o suficiente para que não reaja à colocação do cateter ou à administração da lavagem. Se forem reagentes sob anestesia, isso pode comprometer a qualidade e a quantidade da coleta da amostra de lavagem, além de aumentar potencialmente os riscos de lesão aguda do tecido nasal devido a trauma loc...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL  Tubes	Eppendorf	05-402
1000 µL Pipette	VWR	89079-974
1x PBS	Corning	21-040-CV
20 mL Syringes	VWR	BD302830
50 mL Conical Tubes	VWR	89039-656
70 µm Cell Strainer	Fisherbrand	22-363-548
8FR Sterile Red Rubber Catheter	Med Vet International	50-252-2428
ACK Lysis Buffer	Gibco	A1049201
Centrifuge	Beckman Coulter	366816
Physiological Saline (0.9%)	Vetivex	17033-492-01
Vortex	VWR	10153-838