Солевой промыв для забора образцов иммунного микроокружения носа у собак

Резюме

Солевой раствор для промывания носа можно использовать для отбора проб иммунного микроокружения носа у собак. Поскольку этот подход является относительно неинвазивным и не разрушает ткани носа, его можно проводить серийно. Клетки и белки, собранные с помощью метода промывания носа, могут быть обработаны для различных лабораторных анализов.

Аннотация

Оценка местного иммунного микроокружения носовой полости собак может быть важна для изучения нормального состояния тканей и заболеваний, особенно тех, которые связаны с местным воспалением. Мы оптимизировали методику оценки локального иммунного микроокружения носа собак с помощью серийного промывания носа. Вкратце, когда собаки находятся под анестезией и находятся в положении лежа на грудине, предварительно подогретый стерильный физиологический раствор промывается в пораженную ноздрю с помощью гибкого мягкого резинового катетера. Обратный поток жидкости собирается в конические трубки, и этот процесс повторяется. Жидкости, содержащие вытесненные клетки и белки, объединяются, а объединенные образцы носового лаважа фильтруются через клеточное сетчатое фильтр для удаления крупного мусора и слизи. Образцы центрифугируются и клеточные гранулы выделяются для анализа. После обработки образцов анализы, которые могут последовать за промыванием носа, включают проточную цитометрию, транскриптомный анализ клеток с помощью объемного или одноклеточного секвенирования РНК и/или количественное определение цитокинов, присутствующих в жидкости для промывания.

Введение

У собак регулярно развиваются воспалительные заболевания носа на протяжении всей жизни. Основная причина острого или хронического ринита у собак может варьироваться от инфекционной (вирусной: например, грипп, парагрипп, герпесвирусы; бактериальные [например, Bordetella, микоплазмы], грибковые [например, аспергиллез, криптококкоз]; паразитарные [например, носовые клещи]) до опухолевых (например, синоназальные злокачественные новообразования, чаще всего карцинома или гистотипы саркомы) до инородных материалов (например, инородное тело, интраназальная миграция смещенных зубов) и пародонтоз. а также идиопатический воспалительный ринит у собак 1,2,3,4,5,6,7.

Помимо физикального осмотра, для оценки состояния синоназальной полости у собак с воспалением носа используются различные подходы. Процедуры визуализации могут включать рентгенограммы (стоматологической, черепной), компьютерную томографию (КТ) или магнитно-резонансную томографию (МРТ). Еще одним подходом к визуализации носовой полости является риноскопия. Забор образцов тканей может включать в себя взятие мазков из носа, образцов кисти или биопсии тканей, на основе которых может быть выполнена цитологическая и/или гистопатологическая оценка, а также сдачу образцов для грибковой или бактериальной культуры. Эти образцы могут быть получены различными способами, начиная от «слепой» выборки до риноскопии или расширенной визуализации под визуальным контролем, и приобретаться через ноздри, из носоглотки или с помощью хирургического подхода трепанации, ринотомии или синусотомии.

Промывание носа, которое включает в себя введение стерильного физиологического раствора в носовую полость, также используется для взятия проб из носовой полости собак в диагностических и терапевтических целях. Альтернативный вариант метода промывания носа, который использовался при опухолях носа, называется гидропульсацией носа, описываемой как принудительное промывание носа, которое может вытеснить большие образцы опухоли для диагностической оценки, а также обеспечить терапевтическое облегчение для улучшения клинических признаков, связанных^{с раком} носа.

Мы представляем здесь еще один вариант методики промывания носа с целью сбора и анализа клеток и белков иммунного микроокружения носа. Благодаря щадящему, относительно неинвазивному подходу мы оптимизировали эту технику промывания носа для серийного отбора образцов иммунного микроокружения носа. В испытаниях с участием собак с невоспаленными носовыми полостями, активной герпесвирусной инфекцией и синоназальными опухолями мы продемонстрировали полезность промывания носа для сбора и обработки образцов для последующего применения ^9,10.

В данной рукописи мы описываем технику промывания носа солевым раствором для серийного отбора проб иммунного микроокружения носа у собак. Мы предоставляем детали протокола для эффективного получения образца для промывания носа с минимальным повреждением тканей, а затем обрабатываем образцы для различных анализов.

протокол

Эта процедура промывания носа была одобрена Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета штата Колорадо и Советом по клиническому обзору (IACUC #2425). Схема метода промывания носа представлена на рисунке 1.

1. Подготовка к промыванию носа

1. За день до процедуры промывания носа наполните пять шприцев объемом 20 мл стерильным физиологическим раствором (0,9% раствор хлорида натрия) и закройте колпачком. Поместите шприцы в инкубатор, установленный при температуре 37 ^°C, чтобы они могли нагреться в течение ночи.

2. Расположение собаки для промывания носа

1. Обезболить собаку перед процедурой (например, с помощью внутривенного (IV) введения дексмедетомидина (1-4 мкг/кг) и буторфанола (0,2-0,5 мг/кг) через внутривенный катетер) с последующим введением пропофола в/в (2-5 мг/кг), титруемого до эффекта, для интубации; поддерживать анестезию с помощью 1-2% ингаляционного изофлурана для эффекта.) Подтвердите подходящую глубину анестезии, проверив пальпебральный ответ и тонус челюсти.
2. Смажьте глаза, чтобы предотвратить пересыхание во время процедуры.
3. Контролируйте сердечную телеметрию, артериальное давление, капнографию и показатели пульсоксиметрии на протяжении всей процедуры.
4. Расположите собаку, находящуюся под наркозом, в положении лежачего за грудиной. Расположите голову собаки так, чтобы она была естественно и удобно наклонена вниз от края лечебного стола для оптимального сбора образцов для промывания носа.
5. Надуйте манжету эндотрахеальной трубки, чтобы обеспечить плотное прилегание дыхательных путей.

3. Проведение промывания носа

1. Разрежьте стерильный катетер из красной резины 8 FR у основания так, чтобы он плотно прилегал к одному из предварительно заполненных шприцев объемом 20 мл, содержащих теплый физиологический раствор. Измерьте стерильный катетер красного цвета таким образом, чтобы дистальный конец катетера при введении через ноздрю простирался примерно до середины носовой полости. При взятии образца опухоли носа используйте визуализацию или риноскопическое руководство, чтобы оценить расположение рострального аспекта носовой опухоли для измерения длины красного резинового катетера так, чтобы кончик простирался до рострального аспекта опухоли.
2. Затем разрежьте катетер на кончике на определенную длину интраназального катетера так, чтобы кончик приземлился в соответствующем месте при введении в носовую полость. Тем не менее, предусмотрите дополнительную длину основания катетера, выходящего за пределы ноздри (длина катетера от точки фиксации шприца до входа в ноздрю, примерно 3-5 см). Нанести метку постоянным маркером на цокольный конец катетера для указания начальной точки, соответствующей входу в ноздрю; Заданная длина катетера будет охватывать интраназально, при этом кончик катетера будет расположен в нужном месте в носовой полости.
3. Проведение процедуры промывания носа потребует участия двух человек. Назначьте одного человека (лицо А) ответственным за подачу катетера в носовую полость и введение лаважа, а другого человека (лицо Б) — за забор образца при его выходе из носа.
4. Пусть человек А расположится перед головой собаки и под ней. С помощью рук в перчатках попросите человека А осторожно ввести кончик красного резинового катетера в медиальную сторону носовой полости и продвигать его до тех пор, пока метка на катетере не совпадет с наружной поверхностью ноздри. Во время этого процесса убедитесь, что катетер подключен к шприцу, содержащему подогретый стерильный физиологический раствор. Попросите человека Б провести коническую трубку объемом 50 мл ниже ноздри с установленным катетером.
5. Человек А мягко закупоривает контралатеральную ноздрю и начинает вводить физиологический раствор в носовую полость медленным, устойчивым давлением или с помощью импульсной инфузии. Поскольку голова собаки расположена под углом вниз, человек Б собирает жидкость, которая вытекает из носовой полости под действием силы тяжести в коническую трубку объемом 50 мл.
6. Повторите эту технику промывания носа в общей сложности до пяти 20 мл солевого смыва, меняя конические трубки, по мере необходимости, для сбора объединенных образцов. Запишите общий объем собранной жидкости для промывания носа по отношению к количеству физиологического раствора, введенного после завершения процедуры.
7. После завершения, если собака находится под наркозом под наркозом, введите внутримышечно тот же объем атипамезола, который используется для дексмедетомидина, и дайте собаке восстановиться после анестезии. Чтобы быть осторожным, держите собаку в лежачем положении на грудине так, чтобы голова была опущена вниз, чтобы облегчить дополнительный дренаж остатков физиологического раствора из носового промыва.

4. Обработка образца для промывания носа

1. Осторожно проведите вихревую и/или пипетку с образцами носового промывания, содержащимися в конических пробирках, чтобы разбить скопления мусора и клеток. Пропустите объединенные образцы промывания носа через фильтр для клеточного фильтра толщиной 70 мкм, чтобы удалить крупный мусор и слизь. Центрифугируйте образцы при давлении 300 × г в течение 5-10 минут до образования клеточной гранулы.
2. Соберите надосадочную жидкость с помощью аспирации с помощью пипетки и поместите ее в чистую пробирку для анализа интересующих белков.
3. Ресуспендируйте клеточные гранулы в фосфатно-солевом буфере (PBS) или предпочтительном растворе для анализа интересующих клеток.
4. Чтобы очистить образцы от эритроцитов, проводят лизис хлорида аммония и калия (ACK) для сбора ядросодержащих клеток из носового лаважа^11,12.

Результаты

При использовании этого метода промывания носа собранный образец будет выглядеть слегка мутным, возможно, с видимыми кусочками клеточного мусора и слизи при закручивании трубки. Образец будет считаться загрязненным периферической кровью, если процедура промывания ...

Обсуждение

Протокол промывания носа включает в себя несколько важнейших этапов. Что касается собаки, проходящей процедуру промывания носа, собака должна находиться в достаточно глубокой плоскости анестезии, чтобы она не реагировала на установку катетера или введение лаважа. Е?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL  Tubes	Eppendorf	05-402
1000 µL Pipette	VWR	89079-974
1x PBS	Corning	21-040-CV
20 mL Syringes	VWR	BD302830
50 mL Conical Tubes	VWR	89039-656
70 µm Cell Strainer	Fisherbrand	22-363-548
8FR Sterile Red Rubber Catheter	Med Vet International	50-252-2428
ACK Lysis Buffer	Gibco	A1049201
Centrifuge	Beckman Coulter	366816
Physiological Saline (0.9%)	Vetivex	17033-492-01
Vortex	VWR	10153-838