犬の鼻免疫微小環境のサンプリングのための生理食塩水洗浄液

要約

生理食塩水鼻洗浄水を使用して、犬の鼻免疫微小環境をサンプリングできます。このアプローチは比較的非侵襲的であり、鼻組織を破壊しないため、連続して実行できます。鼻洗浄技術から収集された細胞とタンパク質は、さまざまな実験室分析のために処理できます。

要約

犬の鼻腔の局所免疫微小環境を評価することは、正常組織の健康状態と疾患状態、特に局所炎症に関連するものを調査するために重要です。私たちは、連続的な鼻洗浄を通じて犬の局所鼻免疫微小環境を評価する技術を最適化しました。簡単に言うと、麻酔下で犬を胸骨の横臥位に配置した状態で、温めた滅菌生理食塩水を柔軟な軟質ゴムカテーテルを使用して患部の鼻孔に洗い流します。流体の逆流は円錐形のチューブに集められ、このプロセスが繰り返されます。脱落した細胞やタンパク質を含む液体をプールし、プールした鼻洗浄サンプルを細胞ストレーナーでろ過して、大きな破片や粘液を取り除きます。サンプルを遠心分離し、細胞ペレットを分離して分析します。サンプルが処理された後、経鼻洗浄後の分析には、フローサイトメトリー、バルクまたはシングルセルRNA配列による細胞のトランスクリプトーム解析、および/または洗浄液中に存在するサイトカインの定量化が含まれます。

概要

犬は生涯を通じて炎症性の鼻の状態を日常的に発症します。犬の急性または慢性鼻炎の根本的な原因は、感染性(ウイルス性:インフルエンザ、パラインフルエンザ、ヘルペスウイルスなど、細菌性[ボルデテラ、マイコプラズマなど]、真菌性[アスペルギルス症、クリプトコッカス症など]、寄生虫性[鼻ダニなど])、腫瘍性(副鼻腔悪性腫瘍、最も一般的には癌腫または肉腫の組織型)、異物(異物、変位した歯の鼻腔内移動など)から歯周病までさまざまです。 犬の特発性炎症性鼻炎1,2,3,4,5,6,7と同様に。

身体検査に加えて、鼻の炎症のある犬の副鼻腔の状態を評価するために、さまざまなアプローチが使用されます。画像診断法には、X線写真(歯科、頭蓋骨)、コンピューター断層撮影(CT)、または磁気共鳴画像法(MRI)が含まれる場合があります。鼻腔を画像化する別のアプローチは、鼻鏡検査です。組織サンプリングには、鼻腔スワブ、ブラシサンプル、または組織生検の採取が含まれ、そこから細胞学的および/または組織病理学的評価を行うことができるほか、真菌または細菌培養のためのサンプル提出も行うことができます。これらのサンプルは、「ブラインド」サンプリングから、鼻鏡検査や高度なイメージングによる画像誘導まで、さまざまなアプローチで取得でき、鼻孔から、鼻咽頭から、または穿孔術、鼻切開術、または副鼻腔切開術の外科的アプローチで取得できます。

鼻腔内に滅菌生理食塩水を投与する鼻洗浄は、診断および治療目的で犬の鼻腔をサンプリングするためにも使用されています。鼻腫瘍に使用されている鼻洗浄技術の代替バージョンは、鼻水脈術と呼ばれ、強制的な鼻フラッシングと呼ばれ、診断評価のために大きな腫瘍サンプルを取り除くことができるだけでなく、^{鼻がんに関連する}臨床徴候の改善のための治療的救済を提供することができます8。

ここでは、鼻免疫微小環境の細胞とタンパク質を収集および分析することを目的とした目的で、鼻洗浄技術の別のバージョンを紹介します。穏やかで比較的非侵襲的なアプローチにより、この鼻洗浄技術を連続的な鼻免疫微小環境サンプリングに最適化しました。炎症のない鼻腔、活動性ヘルペスウイルス感染、および副鼻腔腫瘍のある犬を対象とした試験では、下^{流アプリケーション9,10}のサンプルの収集と処理に対する鼻洗浄の有用性を実証しました。

この原稿では、イヌの鼻免疫微小環境の連続サンプリングのための生理食塩水鼻洗浄の技術について説明します。組織への混乱を最小限に抑えて鼻洗浄サンプルを効果的に取得し、さまざまな分析のためにサンプルを処理するためのプロトコルの詳細を提供します。

プロトコル

この鼻洗浄手順は、コロラド州立大学の施設内動物管理および使用委員会および臨床審査委員会(IACUC #2425)によって承認されています。鼻洗浄法の概略図を 図1に示します。

1.鼻洗浄の準備

1. 鼻洗浄手順の前日に、5つの20 mLシリンジに滅菌生理食塩水(0.9%塩化ナトリウム溶液)を満たし、キャップで閉じます。.シリンジを37 ^°Cに設定されたインキュベーターに入れて、一晩温めます。

2.鼻洗浄のために犬を配置する

1. 処置のために犬に麻酔をかけます (例: IV カテーテルを介してデクスメデトミジン (1-4 μg/kg) とブトルファノール (0.2-0.5 mg/kg) を静脈内 (IV) 注射します)、続いて挿管の効果が得られるように滴定されたプロポフォール IV (2-5 mg/kg) を投与します。効果を得るために1〜2%の吸入イソフルランで麻酔を維持します。眼瞼の反応と顎の緊張を確認して、麻酔の適切な深さを確認します。
2. 処置中の乾燥を防ぐために、目を滑らかにします。
3. 手順全体を通して、心臓テレメトリー、血圧、カプノグラフィー、およびパルスオキシメトリの値を監視します。
4. 麻酔をかけた犬を胸骨の横臥位に置きます。犬の頭を治療台の端から下向きの角度で自然かつ快適に角度をつけるように配置して、最適な鼻洗浄サンプル収集を行います。
5. 気管内チューブのカフを膨らませて、気道をしっかりと密閉します。

3.鼻洗浄を行う

1. 8 FR滅菌の赤いゴム製カテーテルを基部で切断し、温かい生理食塩水が入ったプレフィルド20mLシリンジの1つにぴったりと収まるようにします。滅菌済みの赤いゴム製カテーテルを測定して、カテーテルの遠位端が鼻孔から導入されたときに鼻腔のほぼ中央まで伸びるようにします。鼻腫瘍をサンプリングする場合は、画像診断または鼻鏡ガイダンスを使用して、鼻腫瘍の吻側の位置を推定し、赤いゴム製のカテーテルの長さを測定して、先端が腫瘍の吻側側面まで伸びるようにします。
2. 次に、鼻腔に挿入したときに先端が適切な位置に着地するように、定義された鼻腔内カテーテルの長さだけカテーテルを先端で切断します。ただし、鼻孔の外側に伸びるカテーテルの基部には、追加の長さを許容してください(シリンジ固定点から鼻孔入口までのカテーテルの長さ、約3〜5 cm)。カテーテルの基部に油性マーカー付きのマークを貼って、鼻孔の入り口に対応する開始点を示します。所定のカテーテルの長さは鼻腔内に広がり、カテーテルの先端は鼻腔内の目的の場所に配置されます。
3. 鼻洗浄手順を実行するには、2人の個人の参加が必要です。1人(Aさん)がカテーテルを鼻腔に供給し、洗浄液を投与する責任があり、もう1人(Bさん)が鼻から出るサンプルを収集するようにします。
4. Aさんに犬の頭の前後の位置に座ってもらいます。手袋をはめた手で、Aさんに赤いゴム製のカテーテルの先端を鼻腔の内側にそっと導き、カテーテルのマークが鼻孔の外側と揃うまで進めます。このプロセス中に、カテーテルが温められた滅菌生理食塩水を含むシリンジに接続されていることを確認してください。患者 B に、カテーテルを所定の位置に固定した状態で、鼻孔の下に 50 mL の円錐形チューブを保持してもらいます。
5. 人物Aは、反対側の鼻孔を優しく閉塞し、ゆっくりと安定した圧力またはパルス注入で生理食塩水を鼻腔に注入し始めます。犬の頭が下向きの角度に配置されているため、人Bは重力によって鼻腔から排出される液体を50mLの円錐形チューブに集めます。
6. この鼻洗浄法を合計 5 回まで 20 mL 生理食塩水洗浄で繰り返し、必要に応じて円錐形チューブを交換して、プールされたサンプルを収集します。手順の完了後に注入された生理食塩水の量に対して収集された鼻洗浄液の総量を記録します。
7. 完了したら、デクスメデトミジンで麻酔した場合は、デクスメデトミジンに使用したのと同じ量のアチパメゾールを筋肉内に投与し、犬が麻酔から回復するのを待ちます。注意するには、犬を胸骨に横たわらせ、頭を下にして、鼻洗浄からの残留生理食塩水の追加排出を促進します。

4.鼻洗浄サンプルの処理

1. 円錐形のチューブ内に含まれる鼻洗浄液を静かにボルテックスおよび/またはピペットで渦巻くかピペットで動かし、破片や細胞の塊を分解します。プールした鼻洗浄サンプルを70 μmの細胞ストレインフィルターに通し、大きな破片や粘液を取り除きます。サンプルを300 × g で5〜10分間遠心分離し、細胞ペレットを形成します。
2. ピペットで吸引して上清を採取し、目的のタンパク質を分析するためにきれいなチューブに沈殿させます。
3. 細胞ペレットをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)または目的の細胞アッセイに適した溶液に再懸濁します。
4. サンプルから赤血球を除去するために、アンモニウム-塩化-カリウム(ACK)溶解を行い、鼻洗浄^11,12から有核細胞を採取する。

結果

この鼻洗浄法では、採取したサンプルはわずかに濁って見え、チューブが渦巻くと細胞の破片や粘液の破片が見える可能性があります。洗浄手順が誤って出血を誘発し、サンプルが赤みを帯びている場合、サンプルは末梢血で汚染されていると見なされます。注入された生理食塩水の一部は手術中に失われますが、注入された生理食塩水が鼻孔からチューブに逆流し...

ディスカッション

鼻洗浄プロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。鼻洗浄処置を受けている犬に関しては、犬はカテーテル留置や洗浄投与に反応しないように、十分に深い麻酔面内にいなければなりません。麻酔下で反応性がある場合、洗浄サンプル収集の質と量が損なわれるだけでなく、鼻腔内カテーテルによる局所的な外傷による急性鼻組織の損傷や、洗浄液を吸引...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL  Tubes	Eppendorf	05-402
1000 µL Pipette	VWR	89079-974
1x PBS	Corning	21-040-CV
20 mL Syringes	VWR	BD302830
50 mL Conical Tubes	VWR	89039-656
70 µm Cell Strainer	Fisherbrand	22-363-548
8FR Sterile Red Rubber Catheter	Med Vet International	50-252-2428
ACK Lysis Buffer	Gibco	A1049201
Centrifuge	Beckman Coulter	366816
Physiological Saline (0.9%)	Vetivex	17033-492-01
Vortex	VWR	10153-838