Lavaggio salino per il campionamento del microambiente immunitario nasale canino

Riepilogo

Il lavaggio nasale salino può essere utilizzato per campionare il microambiente immunitario nasale canino. Poiché l'approccio è relativamente non invasivo e non interrompe i tessuti nasali, può essere eseguito in serie. Le cellule e le proteine raccolte con la tecnica di lavaggio nasale possono essere processate per varie analisi di laboratorio.

Abstract

La valutazione del microambiente immunitario locale della cavità nasale canina può essere importante per studiare la normale salute dei tessuti e le condizioni di malattia, in particolare quelle associate all'infiammazione locale. Abbiamo ottimizzato una tecnica per valutare il microambiente immunitario nasale locale dei cani tramite lavaggio nasale seriale. In breve, con i cani sotto anestesia e posizionati in decubito sternale, la soluzione salina sterile preriscaldata viene lavata nella narice interessata utilizzando un catetere flessibile in gomma morbida. Il riflusso del fluido viene raccolto in tubi conici e questo processo viene ripetuto. I fluidi contenenti cellule e proteine rimosse vengono raggruppati e i campioni di lavaggio nasale raggruppati vengono filtrati attraverso un filtro cellulare per rimuovere detriti e muco di grandi dimensioni. I campioni vengono centrifugati e i pellet cellulari vengono isolati per l'analisi. Una volta che i campioni sono stati elaborati, le analisi che possono seguire il lavaggio nasale includono la citometria a flusso, l'analisi trascrittomica delle cellule tramite sequenziamento di RNA di massa o a singola cellula e/o la quantificazione delle citochine presenti nel liquido di lavaggio.

Introduzione

I cani sviluppano abitualmente condizioni nasali infiammatorie per tutta la vita. La causa alla base della rinite acuta o cronica nei cani può variare da infettiva (virale: ad esempio, influenza, parainfluenza, herpesvirus; batterica [ad esempio, Bordetella, micoplasmi], fungina [ad esempio, aspergillosi, criptococcosi]; parassitaria [ad esempio, acari nasali]) a neoplastica (ad esempio, neoplasie sinonasali, più comunemente istotipi di carcinoma o sarcoma) a materiale estraneo (ad esempio, corpo estraneo, migrazione intranasale di denti spostati) alla malattia parodontale, così come la rinite infiammatoria idiopatica canina 1,2,3,4,5,6,7.

Oltre all'esame fisico, vengono utilizzati vari approcci per valutare le condizioni della cavità sinonasale nei cani con infiammazione nasale. Le procedure di imaging possono includere radiografie (dentali, cranio), tomografia computerizzata (TC) o risonanza magnetica per immagini (MRI). Un altro approccio all'imaging della cavità nasale è la rinoscopia. Il campionamento dei tessuti può comportare l'acquisizione di tamponi nasali, campioni di spazzolino o biopsie tissutali, da cui è possibile eseguire la valutazione citologica e/o istopatologica, nonché l'invio del campione per la coltura fungina o batterica. Questi campioni possono essere ottenuti in una varietà di approcci, che vanno dal campionamento "alla cieca", alla rinoscopia guidata da immagini o all'imaging avanzato, e acquisiti attraverso le narici, dal rinofaringe o con un approccio chirurgico di trapanazione, rinotomia o sinusotomia.

La lavanda nasale, che prevede la somministrazione di soluzione fisiologica sterile nella cavità nasale, è stata utilizzata anche per il campionamento della cavità nasale canina a scopo diagnostico e terapeutico. Una versione alternativa della tecnica di lavaggio nasale che è stata utilizzata per i tumori nasali è chiamata idropulsione nasale, descritta come lavaggio nasale forzato, che può rimuovere grandi campioni tumorali per la valutazione diagnostica e fornire sollievo terapeutico per il miglioramento dei segni clinici associati al cancro nasale⁸.

Presentiamo qui un'altra versione della tecnica di lavaggio nasale allo scopo di raccogliere e analizzare cellule e proteine del microambiente immunitario nasale. Attraverso un approccio delicato e relativamente non invasivo, abbiamo ottimizzato questa tecnica di lavaggio nasale per il campionamento seriale del microambiente immunitario nasale. In studi che hanno coinvolto cani con cavità nasali non infiammate, infezione attiva da herpesvirus e tumori sinonasali, abbiamo dimostrato l'utilità del lavaggio nasale per la raccolta e l'elaborazione di campioni per applicazioni a valle ^9,10.

In questo manoscritto, descriviamo una tecnica di lavaggio nasale salino per il campionamento seriale del microambiente immunitario nasale canino. Forniamo i dettagli del protocollo per acquisire il campione di lavaggio nasale in modo efficace con un'interruzione minima dei tessuti e quindi elaborare i campioni per una varietà di analisi.

Protocollo

Questa procedura di lavaggio nasale è stata approvata dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Colorado State University e dal Comitato di revisione clinica (IACUC #2425). Uno schema del metodo di lavaggio nasale è presentato nella Figura 1.

1. Preparazione per la lavanda nasale

1. Il giorno prima della procedura di lavaggio nasale, riempire cinque siringhe da 20 ml con soluzione fisiologica sterile (soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%) e chiudere con un tappo. Metti le siringhe in un'incubatrice impostata a 37 ^oC in modo che possano riscaldarsi durante la notte.

2. Posizionamento del cane per il lavaggio nasale

1. Anestetizzare il cane per la procedura (ad es. con iniezione endovenosa (IV) di dexmedetomidina (1-4 μg/kg) e butorfanolo (0,2-0,5 mg/kg) attraverso un catetere IV), seguita dalla somministrazione di propofol IV (2-5 mg/kg) titolato per effetto per l'intubazione; Mantenere l'anestesia con l'1-2% di isoflurano inalante per effetto.) Confermare la profondità appropriata dell'anestesia controllando la risposta palpebrale e il tono della mascella.
2. Lubrificare gli occhi per evitare che si secchino durante la procedura.
3. Monitorare i valori di telemetria cardiaca, pressione sanguigna, capnografia e pulsossimetria durante tutta la procedura.
4. Posizionare il cane anestetizzato in decubito sternale. Posizionare la testa del cane in modo che sia inclinata in modo naturale e confortevole verso il basso rispetto al bordo del lettino per una raccolta ottimale dei campioni di lavaggio nasale.
5. Gonfiare la cuffia del tubo endotracheale per garantire una tenuta ermetica delle vie aeree.

3. Esecuzione della lavanda nasale

1. Tagliare un catetere sterile in gomma rossa da 8 FR alla base in modo che si adatti perfettamente a una delle siringhe preriempite da 20 ml contenenti la soluzione fisiologica calda. Misurare un catetere sterile in gomma rossa in modo che la punta distale del catetere si estenda fino a circa metà della cavità nasale quando viene introdotta attraverso la narice. Se si campiona un tumore nasale, utilizzare l'imaging o la guida rinoscopica per stimare la posizione dell'aspetto rostrale del tumore nasale per misurare la lunghezza del catetere di gomma rossa in modo che la punta si estenda fino all'aspetto rostrale del tumore.
2. Quindi, tagliare il catetere sulla punta per la lunghezza definita del catetere intranasale in modo che la punta atterri nella posizione appropriata quando viene inserita nella cavità nasale. Tuttavia, lasciare una lunghezza aggiuntiva per la base del catetere che si estende all'esterno della narice (lunghezza del catetere dal punto di fissaggio della siringa all'ingresso della narice, circa 3-5 cm). Applicare un segno con un pennarello indelebile all'estremità di base del catetere per indicare il punto di partenza, corrispondente all'ingresso della narice; La lunghezza predeterminata del catetere si estenderà per via intranasale, con la punta del catetere posizionata nella posizione desiderata all'interno della cavità nasale.
3. L'esecuzione della procedura di lavaggio nasale richiederà la partecipazione di due persone. Affidare a una persona (Persona A) la responsabilità di inserire il catetere nella cavità nasale e di somministrare il lavaggio e all'altra persona (Persona B) di raccogliere il campione quando esce dal naso.
4. Fai posizionare la persona A davanti e sotto la testa del cane. Con le mani guantate, chiedi alla persona A di guidare delicatamente la punta del catetere di gomma rossa nella parte mediale della cavità nasale e di farlo avanzare fino a quando il segno sul catetere non si allinea con la faccia esterna della narice. Durante questo processo, assicurarsi che il catetere sia collegato alla siringa contenente la soluzione fisiologica sterile riscaldata. Chiedere alla persona B di tenere un tubo conico da 50 ml sotto la narice con il catetere in posizione.
5. La persona A occlude delicatamente la narice controlaterale e inizia a infondere la soluzione salina nella cavità nasale con una pressione lenta e costante o con un'infusione pulsata. Poiché la testa del cane è posizionata con un angolo verso il basso, la persona B raccoglie il fluido che fuoriesce dalla cavità nasale per gravità nel tubo conico da 50 ml.
6. Ripetere questa tecnica di lavaggio nasale per un massimo di cinque lavaggi salini da 20 ml, sostituendo le provette coniche, se necessario, per raccogliere i campioni raggruppati. Registrare il volume totale di liquido di lavaggio nasale raccolto rispetto alla quantità di soluzione salina infusa dopo il completamento della procedura.
7. Una volta completato, se anestetizzato con dexmedetomidina, somministrare per via intramuscolare lo stesso volume di atipamezolo utilizzato per la dexmedetomidina e consentire al cane di riprendersi dall'anestesia. Per essere prudenti, tenere il cane in decubito sternale con la testa posizionata verso il basso per facilitare il drenaggio aggiuntivo di eventuali residui di soluzione salina dalla lavanda nasale.

4. Elaborazione del campione di lavaggio nasale

1. Agitare delicatamente e/o pipettare i campioni di lavaggio nasale contenuti all'interno dei tubi conici per rompere i grumi di detriti e cellule. Far passare i campioni di lavaggio nasale raggruppati attraverso un filtro filtrante cellulare da 70 μm per rimuovere detriti e muco di grandi dimensioni. Centrifugare i campioni a 300 × g per 5-10 minuti per formare un pellet cellulare.
2. Raccogliere il surnatante tramite aspirazione con una pipetta e depositarlo in una provetta pulita per l'analisi delle proteine di interesse.
3. Risospendere i pellet cellulari in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o in soluzione preferita per saggi cellulari di interesse.
4. Per eliminare i globuli rossi dai campioni, eseguire la lisi di ammonio-cloruro-potassio (ACK) per raccogliere le cellule nucleate dal lavaggio nasale ^11,12.

Risultati

Con questo metodo di lavaggio nasale, il campione raccolto apparirà leggermente torbido, possibilmente con pezzi visibili di detriti cellulari e muco quando il tubo viene fatto roteare. Un campione sarebbe considerato contaminato da sangue periferico se la procedura di lavaggio induce inavvertitamente sanguinamento e il campione si tinge di rosso. Mentre una parte della soluzione salina infusa andrà persa durante la procedura, si prenderebbe in considerazione un lavaggio negativo se la...

Discussione

Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo di lavaggio nasale. Per quanto riguarda il cane sottoposto alla procedura di lavaggio nasale, il cane deve trovarsi all'interno di un piano di anestesia sufficientemente profondo in modo da non reagire al posizionamento del catetere o alla somministrazione del lavaggio. Se sono reattivi in anestesia, ciò può compromettere la qualità e la quantità di raccolta del campione di lavaggio, oltre ad aumentare potenzialmente i rischi di lesione...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL  Tubes	Eppendorf	05-402
1000 µL Pipette	VWR	89079-974
1x PBS	Corning	21-040-CV
20 mL Syringes	VWR	BD302830
50 mL Conical Tubes	VWR	89039-656
70 µm Cell Strainer	Fisherbrand	22-363-548
8FR Sterile Red Rubber Catheter	Med Vet International	50-252-2428
ACK Lysis Buffer	Gibco	A1049201
Centrifuge	Beckman Coulter	366816
Physiological Saline (0.9%)	Vetivex	17033-492-01
Vortex	VWR	10153-838