Kochsalzspülung zur Probenahme der nasalen Immunmikroumgebung des Hundes

Zusammenfassung

Die salzhaltige Nasenspülung kann verwendet werden, um die Mikroumgebung des nasalen Immunsystems des Hundes zu beproben. Da der Ansatz relativ nicht-invasiv ist und das Nasengewebe nicht stört, kann er seriell durchgeführt werden. Zellen und Proteine, die aus der Nasenspültechnik gewonnen werden, können für verschiedene Laboranalysen aufbereitet werden.

Zusammenfassung

Die Bewertung der lokalen Immunmikroumgebung der Nasenhöhle des Hundes kann wichtig sein, um die Gesundheit und den Krankheitszustand des normalen Gewebes zu untersuchen, insbesondere solche, die mit lokalen Entzündungen verbunden sind. Wir haben eine Technik optimiert, um die lokale bakterielle Immunmikroumgebung von Hunden mittels serieller Nasenspülung zu bewerten. Kurz gesagt, bei Hunden unter Narkose und in sternalliegender Lage wird vorgewärmte sterile Kochsalzlösung mit einem flexiblen Weichgummikatheter in das betroffene Nasenloch gespült. Der Rückfluss der Flüssigkeit wird in konischen Rohren gesammelt, und dieser Vorgang wird wiederholt. Die Flüssigkeiten, die gelöste Zellen und Proteine enthalten, werden gepoolt, und die gepoolten Nasenspülproben werden durch ein Zellsieb gefiltert, um große Ablagerungen und Schleim zu entfernen. Die Proben werden zentrifugiert und die Zellpellets für die Analyse isoliert. Nach der Verarbeitung der Proben umfassen Analysen, die auf eine Nasenspülung folgen können, die Durchflusszytometrie, die transkriptomische Analyse von Zellen über Bulk- oder Einzelzell-RNA-Seq und/oder die Quantifizierung der in der Spülflüssigkeit vorhandenen Zytokine.

Einleitung

Hunde entwickeln im Laufe ihres Lebens routinemäßig entzündliche Nasenerkrankungen. Die zugrunde liegende Ursache für akute oder chronische Rhinitis bei Hunden kann von infektiös (viral: z. B. Influenza, Parainfluenza, Herpesviren; bakteriell [z. B. Bordetella, Mykoplasmen], pilzlich [z. B. Aspergillose, Kryptokokkose]; parasitär [z. B. Nasenmilben]) bis neoplastisch (z. B. sinonasale Malignome, am häufigsten Karzinome oder Sarkom-Histotypen) über Fremdmaterial (z. B. Fremdkörper, intranasale Wanderung von verschobenen Zähnen) bis hin zu Parodontitis reichen. sowie bei der idiopathischen entzündlichen Rhinitis^bei Hunden 1,2,3,4,5,6,7.

Neben einer körperlichen Untersuchung werden verschiedene Ansätze verwendet, um den Zustand der Nasenhöhle bei Hunden mit Nasenentzündung zu beurteilen. Bildgebende Verfahren können Röntgenaufnahmen (Zahn, Schädel), Computertomographie (CT) oder Magnetresonanztomographie (MRT) umfassen. Ein weiterer Ansatz zur Bildgebung der Nasenhöhle ist die Rhinoskopie. Die Gewebeprobenahme kann die Entnahme von Nasenabstrichen, Bürstenproben oder Gewebebiopsien umfassen, von denen aus eine zytologische und/oder histopathologische Bewertung durchgeführt werden kann, sowie die Einreichung von Proben für Pilz- oder Bakterienkulturen. Diese Proben können auf verschiedene Weise gewonnen werden, von der "blinden" Probenahme bis hin zur bildgesteuerten Probenahme mit Rhinoskopie oder fortschrittlicher Bildgebung und durch die Nasenlöcher, aus dem Nasopharynx oder mit einem chirurgischen Ansatz der Trepanation, Rhinotomie oder Sinusotomie.

Die Nasenspülung, bei der sterile Kochsalzlösung in die Nasenhöhle verabreicht wird, wurde auch zur Probenahme der Nasenhöhle des Hundes zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken eingesetzt. Eine alternative Version der Nasenspültechnik, die bei Nasentumoren eingesetzt wurde, wird als nasale Hydropulsion bezeichnet, die als kräftige Nasenspülung beschrieben wird und große Tumorproben für die diagnostische Bewertung entfernen und eine therapeutische Linderung zur Verbesserung der klinischen Symptome im Zusammenhang mit Nasenkrebs bieten kann⁸.

Wir stellen hier eine andere Version der Nasenspültechnik vor, die für den beabsichtigten Zweck der Sammlung und Analyse von Zellen und Proteinen der nasalen Immunmikroumgebung verwendet wird. Durch einen schonenden, relativ nicht-invasiven Ansatz haben wir diese Nasenspültechnik für die serielle Probenahme von nasalen Immunmikroumgebungen optimiert. In Studien mit Hunden mit unentzündeten Nasenhöhlen, aktiver Herpesvirusinfektion und sinonasalen Tumoren haben wir den Nutzen der Nasenspülung für die Entnahme und Verarbeitung von Proben für nachgelagerte Anwendungen nachgewiesen ^9,10.

In diesem Manuskript beschreiben wir eine Technik der salzhaltigen Nasenspülung für die serielle Probenahme der nasalen Immunmikroumgebung des Hundes. Wir stellen Protokolldetails zur Verfügung, um die Nasenspülprobe effektiv und mit minimaler Störung des Gewebes zu entnehmen und die Proben dann für eine Vielzahl von Analysen zu verarbeiten.

Protokoll

Dieses Nasenspülverfahren wurde vom Colorado State University Institutional Animal Care and Use Committee und Clinical Review Board (IACUC #2425) zugelassen. Ein Schema der Nasenspülungsmethode ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Vorbereitung auf die Nasenspülung

1. Füllen Sie am Tag vor der Nasenspülung fünf 20-ml-Spritzen mit steriler physiologischer Kochsalzlösung (0,9%ige Natriumchloridlösung) und verschließen Sie sie mit einer Kappe. Legen Sie die Spritzen in einen auf 37 ^°C eingestellten Inkubator, damit sie über Nacht erwärmen können.

2. Positionierung des Hundes für die Nasenspülung

1. Betäuben Sie den Hund für den Eingriff (z. B. mit intravenöser (IV) Injektion von Dexmedetomidin (1-4 μg/kg) und Butorphanol (0,2-0,5 mg/kg) über einen IV-Katheter), gefolgt von der Verabreichung von Propofol IV (2-5 mg/kg), titriert für die Intubation; Halten Sie die Anästhesie mit 1-2% Inhalationsmittel Isofluran aufrecht, um zu wirken.) Bestätigen Sie die geeignete Anästhesietiefe, indem Sie das Ansprechen des Lids und den Kiefertonus überprüfen.
2. Schmieren Sie die Augen, um ein Austrocknen während des Eingriffs zu verhindern.
3. Überwachen Sie die kardiologischen Telemetrie-, Blutdruck-, Kapnographie- und Pulsoximetriewerte während des gesamten Eingriffs.
4. Positionieren Sie den narkotisierten Hund in sternaler Liege. Platzieren Sie den Kopf des Hundes so, dass er natürlich und bequem in einem Abwärtswinkel von der Kante des Behandlungstisches abgewinkelt ist, um eine optimale Probenentnahme für die Nasenspülung zu gewährleisten.
5. Blasen Sie die Manschette des Endotrachealtubus auf, um eine dichte Abdichtung der Atemwege zu gewährleisten.

3. Durchführung der Nasenspülung

1. Schneiden Sie einen sterilen, roten Gummikatheter mit 8 FR an der Basis so ab, dass er genau auf eine der vorgefüllten 20-ml-Spritzen mit der warmen Kochsalzlösung passt. Messen Sie einen sterilen roten Gummikatheter so, dass die distale Spitze des Katheters beim Einführen durch das Nasenloch etwa bis zur Mitte der Nasenhöhle reicht. Wenn Sie einen Nasentumor entnehmen, verwenden Sie eine bildgebende oder nasenmikroskopische Anleitung, um die Lage des rostralen Aspekts des Nasentumors zu schätzen, um die Länge des roten Gummikatheters so zu messen, dass sich die Spitze bis zum rostralen Aspekt des Tumors erstreckt.
2. Schneiden Sie dann den Katheter an der Spitze für die definierte intranasale Katheterlänge ab, so dass die Spitze beim Einführen in die Nasenhöhle an der richtigen Stelle landet. Lassen Sie jedoch eine zusätzliche Länge für die Basis des Katheters zu, die über das Nasenloch hinausragt (Katheterlänge vom Befestigungspunkt der Spritze bis zum Nasenlocheingang, ca. 3-5 cm). Bringen Sie eine Markierung mit einem Permanentmarker am unteren Ende des Katheters an, um den Startpunkt anzuzeigen, der dem Nasenlocheingang entspricht. Die vorgegebene Katheterlänge erstreckt sich intranasal, wobei die Katheterspitze an der gewünschten Stelle in der Nasenhöhle positioniert wird.
3. Die Durchführung der Nasenspülung erfordert die Teilnahme von zwei Personen. Eine Person (Person A) ist für die Einführung des Katheters in die Nasenhöhle und die Verabreichung der Spülung verantwortlich, und die andere Person (Person B) für die Entnahme der Probe, wenn sie die Nase verlässt.
4. Lassen Sie Person A sich vor und unter dem Kopf des Hundes positionieren. Lassen Sie Person A mit behandschuhten Händen die Spitze des roten Gummikatheters sanft in den medialen Aspekt der Nasenhöhle führen und schieben Sie ihn vor, bis die Markierung auf dem Katheter mit dem äußeren Aspekt des Nasenlochs übereinstimmt. Stellen Sie während dieses Vorgangs sicher, dass der Katheter mit der Spritze verbunden ist, die die erwärmte sterile Kochsalzlösung enthält. Lassen Sie Person B einen konischen 50-ml-Schlauch unter dem Nasenloch halten, wobei der Katheter an Ort und Stelle ist.
5. Person A verschließt sanft das kontralaterale Nasenloch und beginnt, die Kochsalzlösung mit langsamem, gleichmäßigem Druck oder mit einer gepulsten Infusion in die Nasenhöhle zu infundieren. Da der Kopf des Hundes in einem Winkel nach unten positioniert ist, sammelt Person B die Flüssigkeit, die durch die Schwerkraft aus der Nasenhöhle in den konischen 50-ml-Schlauch abfließt.
6. Wiederholen Sie diese Nasenspültechnik für bis zu insgesamt fünf 20-ml-Kochsalzspülungen und wechseln Sie bei Bedarf die konischen Röhrchen aus, um die gepoolten Proben zu sammeln. Notieren Sie das Gesamtvolumen der gesammelten Nasenspülflüssigkeit im Verhältnis zur Menge der nach Abschluss des Eingriffs infundierten Kochsalzlösung.
7. Verabreichen Sie nach Abschluss der Behandlung, wenn Sie mit Dexmedetomidin betäubt werden, intramuskulär die gleiche Menge Atipamezol wie bei Dexmedetomidin und lassen Sie den Hund sich von der Narkose erholen. Um vorsichtig zu sein, halten Sie den Hund in sternaler Liege mit dem Kopf nach unten, um eine zusätzliche Drainage von Kochsalzresten aus der Nasenspülung zu erleichtern.

4. Aufbereitung der Nasenspülprobe

1. Behandeln und/oder pipettieren Sie die Nasenspülproben in den konischen Röhrchen vorsichtig, um Klumpen von Ablagerungen und Zellen aufzubrechen. Führen Sie die gepoolten Nasenspülproben durch einen 70-μm-Zellsiebfilter, um große Ablagerungen und Schleim zu entfernen. Zentrifugieren Sie die Proben bei 300 × g für 5-10 min, um ein Zellpellet zu bilden.
2. Der Überstand wird durch Aspiration mit einer Pipette entnommen und in ein sauberes Röhrchen zur Analyse der gewünschten Proteine gegeben.
3. Resuspendieren Sie Zellpellets in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder bevorzugter Lösung für Zellassays von Interesse.
4. Um rote Blutkörperchen aus den Proben zu entfernen, wird eine Ammoniumchlorid-Kalium (ACK)-Lyse durchgeführt, um kernhaltige Zellen aus der Nasenspülung zu entnehmen^11,12.

Ergebnisse

Bei dieser Nasenspülmethode erscheint die entnommene Probe leicht trüb, möglicherweise mit sichtbaren Stücken von Zelltrümmern und Schleim, wenn der Schlauch verwirbelt wird. Eine Probe gilt als mit peripherem Blut kontaminiert, wenn das Spülverfahren versehentlich Blutungen hervorruft und die Probe rot gefärbt ist. Während ein Teil der infundierten Kochsalzlösung während des Eingriffs verloren geht, wird eine negative Spülung in Betracht gezogen, wenn die infundierte Kochsalz...

Diskussion

Es gibt mehrere kritische Schritte im Protokoll der Nasenspülung. In Bezug auf den Hund, der sich der Nasenspülung unterzieht, muss sich der Hund in einer ausreichend tiefen Anästhesieebene befinden, damit er nicht auf die Katheterplatzierung oder die Spülung reagiert. Wenn sie unter Narkose reaktiv sind, kann dies die Qualität und Quantität der Spülprobenentnahme beeinträchtigen und möglicherweise das Risiko einer akuten Verletzung des Nasengewebes aufgrund eines lokalen Trauma...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL  Tubes	Eppendorf	05-402
1000 µL Pipette	VWR	89079-974
1x PBS	Corning	21-040-CV
20 mL Syringes	VWR	BD302830
50 mL Conical Tubes	VWR	89039-656
70 µm Cell Strainer	Fisherbrand	22-363-548
8FR Sterile Red Rubber Catheter	Med Vet International	50-252-2428
ACK Lysis Buffer	Gibco	A1049201
Centrifuge	Beckman Coulter	366816
Physiological Saline (0.9%)	Vetivex	17033-492-01
Vortex	VWR	10153-838