Lavado salino para la toma de muestras del microambiente inmunitario nasal canino

Resumen

El lavado nasal con solución salina se puede utilizar para tomar muestras del microambiente inmunitario nasal canino. Debido a que el abordaje es relativamente no invasivo y no altera los tejidos nasales, se puede realizar en serie. Las células y proteínas recogidas de la técnica de lavado nasal pueden ser procesadas para diversos análisis de laboratorio.

Resumen

La evaluación del microambiente inmunitario local de la cavidad nasal canina puede ser importante para investigar la salud normal de los tejidos y las enfermedades, en particular las asociadas con la inflamación local. Hemos optimizado una técnica para evaluar el microambiente inmune nasal local de perros a través de lavados nasales en serie. Brevemente, con los perros bajo anestesia y colocados en decúbito esternal, se inyecta solución salina estéril precalentada en la fosa nasal afectada mediante un catéter de goma blanda flexible. El reflujo de fluido se recoge en tubos cónicos y este proceso se repite. Los fluidos que contienen células y proteínas desalojadas se agrupan, y las muestras de lavado nasal agrupadas se filtran a través de un filtro de células para eliminar los desechos grandes y la mucosidad. Las muestras se centrifugan y los gránulos de la célula se aíslan para su análisis. Una vez que se han procesado las muestras, los análisis que pueden seguir al lavado nasal incluyen citometría de flujo, análisis transcriptómico de células a través de secuencias de ARN a granel o de una sola célula, y/o cuantificación de citocinas presentes en el líquido de lavado.

Introducción

Los perros desarrollan habitualmente afecciones nasales inflamatorias a lo largo de su vida. La causa subyacente de la rinitis aguda o crónica en los perros puede variar desde infecciosa (viral: p. ej., influenza, parainfluenza, herpesvirus; bacteriana [p. ej., Bordetella, micoplasmas], fúngica [p. ej., aspergilosis, criptococosis]; parasitaria [p. ej., ácaros nasales]) hasta neoplásica (p. ej., neoplasias malignas sinonasales, más comúnmente carcinoma o histotipos de sarcoma) a material extraño (p. ej., cuerpo extraño, migración intranasal de dientes desplazados) a enfermedad periodontal, así como la rinitis inflamatoria idiopática canina 1,2,3,4,5,6,7.

Además de un examen físico, se utilizan varios enfoques para evaluar el estado de la cavidad nasal en perros con inflamación nasal. Los procedimientos de diagnóstico por imágenes pueden incluir radiografías (dentales, de cráneo), tomografía computarizada (TC) o resonancia magnética nuclear (RMN). Otro enfoque para obtener imágenes de la cavidad nasal es la rinoscopia. El muestreo de tejido puede implicar la adquisición de hisopos nasales, muestras de cepillo o biopsias de tejido, a partir de las cuales se puede realizar una evaluación citológica y/o histopatológica, así como el envío de muestras para cultivo de hongos o bacterias. Estas muestras se pueden obtener en una variedad de enfoques, que van desde el muestreo "ciego" hasta la guía por imágenes con rinoscopia o imágenes avanzadas, y se adquieren a través de las narinas, de la nasofaringe o con un enfoque quirúrgico de trepanación, rinotomía o sinusotomía.

El lavado nasal, que consiste en la administración de solución salina estéril en la cavidad nasal, también se ha utilizado para tomar muestras de la cavidad nasal canina con fines diagnósticos y terapéuticos. Una versión alternativa de la técnica de lavado nasal que se ha utilizado para los tumores nasales se denomina hidropulsión nasal, descrita como un enrojecimiento nasal forzado, que puede desplazar grandes muestras de tumores para su evaluación diagnóstica, así como proporcionar un alivio terapéutico para la mejora de los signos clínicos asociados con el cáncer nasal⁸.

Presentamos aquí otra versión de la técnica de lavado nasal con el propósito previsto de recolectar y analizar células y proteínas del microambiente inmunológico nasal. A través de un enfoque suave y relativamente no invasivo, hemos optimizado esta técnica de lavado nasal para el muestreo en serie del microambiente inmunitario nasal. En ensayos con perros con cavidades nasales no inflamadas, infección activa por herpesvirus y tumores nasales, hemos demostrado la utilidad del lavado nasal para la recolección y procesamiento de muestras para aplicaciones posteriores ^9,10.

En este manuscrito describimos una técnica de lavado nasal salino para la toma de muestras seriadas del microambiente inmune nasal canino. Proporcionamos detalles del protocolo para adquirir la muestra de lavado nasal de manera efectiva con una interrupción mínima de los tejidos y luego, procesar las muestras para una variedad de análisis.

Protocolo

Este procedimiento de lavado nasal ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Colorado y la Junta de Revisión Clínica (IACUC # 2425). En la Figura 1 se presenta un esquema del método de lavado nasal.

1. Preparación para el lavado nasal

1. El día antes del procedimiento de lavado nasal, llene cinco jeringas de 20 ml con solución salina fisiológica estéril (solución de cloruro de sodio al 0,9%) y cierre con una tapa. Coloque las jeringas en una incubadora a 37 ^oC para que puedan calentarse durante la noche.

2. Posicionamiento del perro para el lavado nasal

1. Anestesiar al perro para el procedimiento (p. ej., con inyección intravenosa (IV) de dexmedetomidina (1-4 μg/kg) y butorfanol (0,2-0,5 mg/kg) a través de un catéter intravenoso), seguido de la administración de propofol IV (2-5 mg/kg) titulado para la intubación; Mantenga la anestesia con isoflurano inhalante al 1-2% para hacer efecto). Confirme la profundidad adecuada de la anestesia verificando la respuesta palpebral y el tono de la mandíbula.
2. Lubrique los ojos para evitar que se sequen durante el procedimiento.
3. Controle los valores de telemetría cardíaca, presión arterial, capnografía y oximetría de pulso durante todo el procedimiento.
4. Coloque al perro anestesiado en decúbito esternal. Coloque la cabeza del perro de modo que quede inclinada de forma natural y cómoda en un ángulo hacia abajo desde el borde de la mesa de tratamiento para una recolección óptima de la muestra de lavado nasal.
5. Infle el manguito del tubo endotraqueal para asegurar un sellado hermético de las vías respiratorias.

3. Realización del lavado nasal

1. Corte un catéter de goma roja estéril de 8 FR en la base para que quede perfectamente ajustado en una de las jeringas precargadas de 20 ml que contienen la solución salina tibia. Mida un catéter de goma roja estéril de modo que la punta distal del catéter se extienda hasta aproximadamente la mitad de la cavidad nasal cuando se introduzca a través de la fosa nasal. Si se toma una muestra de un tumor nasal, use imágenes o guía rinoscópica para estimar la ubicación de la cara rostral del tumor nasal a fin de medir la longitud del catéter de goma roja de modo que la punta se extienda hasta la cara rostral del tumor.
2. Luego, corte el catéter en la punta para la longitud definida del catéter intranasal de modo que la punta caiga en el lugar apropiado cuando se inserte en la cavidad nasal. Sin embargo, permita una longitud adicional para la base del catéter que se extienda fuera de la fosa nasal (longitud del catéter desde el punto de fijación de la jeringa hasta la entrada de la fosa nasal, aproximadamente 3-5 cm). Aplique una marca con un marcador permanente en el extremo de la base del catéter para indicar el punto de inicio, correspondiente a la entrada de la fosa nasal; La longitud predeterminada del catéter se extenderá intranasalmente, con la punta del catéter colocada en la ubicación deseada dentro de la cavidad nasal.
3. La realización del procedimiento de lavado nasal requerirá la participación de dos personas. Haga que una persona (Persona A) sea responsable de introducir el catéter en la cavidad nasal y administrar el lavado, y que la otra persona (Persona B) recoja la muestra a medida que sale de la nariz.
4. Haga que la Persona A se coloque delante y debajo de la cabeza del perro. Con las manos enguantadas, pídale a la persona A que guíe suavemente la punta del catéter de goma roja hacia la cara medial de la cavidad nasal y la haga avanzar hasta que la marca del catéter se alinee con la cara exterior de la fosa nasal. Durante este proceso, asegúrese de que el catéter esté conectado a la jeringa que contiene la solución salina estéril calentada. Pídale a la persona B que sostenga un tubo cónico de 50 ml debajo de la fosa nasal con el catéter colocado.
5. La persona A ocluye suavemente la fosa nasal contralateral y comienza a infundir la solución salina en la cavidad nasal con una presión lenta y constante o con una infusión pulsada. Como la cabeza del perro se coloca en un ángulo hacia abajo, la persona B recoge el líquido que drena de la cavidad nasal a través de la gravedad en el tubo cónico de 50 ml.
6. Repita esta técnica de lavado nasal hasta un total de cinco lavados con solución salina de 20 ml, cambiando los tubos cónicos, según sea necesario, para recolectar las muestras agrupadas. Registre el volumen total de líquido de lavado nasal recolectado en relación con la cantidad de solución salina infundida después de la finalización del procedimiento.
7. Una vez finalizado, si se anestesia con dexmedetomidina, administre por vía intramuscular el mismo volumen de atipamezol que se utiliza para la dexmedetomidina, y permita que el perro se recupere de la anestesia. Para ser precavido, mantenga al perro en decúbito esternal con la cabeza colocada hacia abajo para facilitar el drenaje adicional de cualquier solución salina residual del lavado nasal.

4. Procesamiento de la muestra de lavado nasal

1. Agitar suavemente y/o pipetear las muestras de lavado nasal contenidas dentro de los tubos cónicos para romper los grupos de residuos y células. Pase las muestras de lavado nasal agrupadas a través de un filtro de filtrado de células de 70 μm para eliminar los residuos grandes y la mucosidad. Centrifugar las muestras a 300 × g durante 5-10 minutos para formar un pellet de celda.
2. Recoger el sobrenadante por aspiración con una pipeta y depositarlo en un tubo limpio para el análisis de las proteínas de interés.
3. Vuelva a suspender los gránulos celulares en solución salina tamponada con fosfato (PBS) o en la solución preferida para los ensayos celulares de interés.
4. Para eliminar los glóbulos rojos de las muestras, realice la lisis de cloruro de amonio-potasio (ACK) para recolectar las células nucleadas del lavado nasal^11,12.

Resultados

Con este método de lavado nasal, la muestra recolectada aparecerá ligeramente turbia, posiblemente con pedazos visibles de desechos celulares y moco cuando se gira el tubo. Se consideraría que una muestra está contaminada con sangre periférica si el procedimiento de lavado induce inadvertidamente una hemorragia y la muestra está teñida de rojo. Si bien parte de la solución salina infundida se perderá durante el procedimiento, se consideraría un lavado negativo si la solución s...

Discusión

Hay varios pasos críticos en el protocolo de lavado nasal. Con respecto al perro que se somete al procedimiento de lavado nasal, el perro debe estar dentro de un plano de anestesia lo suficientemente profundo para que no reaccione a la colocación del catéter o a la administración del lavado. Si son reactivos bajo anestesia, esto puede comprometer la calidad y la cantidad de la recolección de muestras de lavado, así como aumentar potencialmente los riesgos de lesión aguda del tejid...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL  Tubes	Eppendorf	05-402
1000 µL Pipette	VWR	89079-974
1x PBS	Corning	21-040-CV
20 mL Syringes	VWR	BD302830
50 mL Conical Tubes	VWR	89039-656
70 µm Cell Strainer	Fisherbrand	22-363-548
8FR Sterile Red Rubber Catheter	Med Vet International	50-252-2428
ACK Lysis Buffer	Gibco	A1049201
Centrifuge	Beckman Coulter	366816
Physiological Saline (0.9%)	Vetivex	17033-492-01
Vortex	VWR	10153-838