Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لتحرير الجينوم من خلال الحقن المجهري الجنيني في البعوض A. aegypti باستخدام تقنية CRISPR-Cas9.

Abstract

أحدث ظهور تقنية التكرارات المتجانسة العنقودية ، المتناثرة بانتظام ، (CRISPR) -Cas9 ثورة في مجال الهندسة الوراثية وفتح الأبواب أمام التحرير الدقيق للجينوم في أنواع متعددة ، بما في ذلك الكائنات الحية غير النموذجية. في البعوضة الزاعجة المصرية ، تم تحقيق طفرات فقدان الوظيفة وإدخال الحمض النووي باستخدام هذه التقنية. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لتحرير الجينوم من خلال الحقن المجهري الجنيني في البعوض A. aegypti باستخدام تقنية CRISPR-Cas9 ، مع التركيز على كل من توليد الضربة القاضية الجينية وخطوط الضربة القاضية. في هذا البروتوكول ، تمتلئ إبر الكوارتز بمزيج من دليل الحمض النووي الريبي ، والمؤتلف Cas9 ، وبلازميد يحتوي على كاسيت DNA يشفر جينا لعلامة الفلورسنت ، إذا كان الجين مطلوبا تصطف الأجنة في مرحلة ما قبل الأرومة على شريط من الشريط اللاصق على الوجهين يوضع على غطاء ، والذي يتم تثبيته لاحقا على شريحة زجاجية. بمساعدة حاقن دقيق ، يتم إدخال الإبر برفق في الطرف الخلفي للأجنة ويتم الاستغناء عن حجم صغير من خليط كريسبر. عندما تفقس الأجنة ، يتم فحص اليرقات تحت نطاق الفلورسنت ، ويتم فرز الشرانق حسب الجنس وفصلها في أقفاص مختلفة. بمجرد ظهور البالغين ، يتم تهجينها بشكل متبادل مع أفراد من النوع البري ، وتتغذى على الدم ، وتوضع لوضع البيض. بمجرد أن تفقس هذه البيض ، تمثل اليرقات الفلورية التي تم جمعها أفرادا لديهم إدخال مستقر لكاسيت الحمض النووي في جينومهم. ثم تزرع هذه اليرقات إلى مرحلة البلوغ ، وتتداخل مع الأفراد من النوع البري ، ثم يتم تقييمها بشكل أكبر من خلال التقنيات الجزيئية للتأكد من أن التسلسل الدقيق لشريط الحمض النووي موجود في الموقع المطلوب لجينوم البعوض. يمكن أيضا الحصول على الخطوط متماثلة اللواقح باتباع خط الأنابيب المقدم لمخطط العبور والفحص الجزيئي للطفرات.

Introduction

يمكن القول إن التحرير الدقيق للجينوم أصبح أسهل ، ولكنه ممكن ، مع إنشاء تقنيات CRISPR-Cas للمقص الجزيئي1. تستفيد هذه التقنيات من آلية يستخدمها الجهاز المناعي بدائية النواة لمحاربة عدوى العاثيات2. من بين هذه الأنظمة ، تعتمد التكرارات المتجانسة العنقودية ، المتناثرة بانتظام ، القصيرة (CRISPR) جنبا إلى جنب مع نوكلياز Cas9 عادة على 20 زوجا أساسيا من الحمض النووي الريبي الأساسي ، دليل الحمض النووي الريبي (gRNAs) ، مع تسلسلات متماثلة مع الحمض النووي المستهدف ، والتي يتبعها الشكل المجاور NGG protospacer (PAM) تسلسل3. تقوم gRNAs المحملة على Cas9 بتوجيه هذه النوكليازات بدقة إلى مواقع مستهدفة محددة في الجينوم ، مما يؤدي إلى فواصل الحمض النووي مزدوجالخيط 3.

تحفز فواصل الحمض النووي المزدوجة آليات الإصلاح لتصحيح اللولبالمزدوج 4. في حين أنه من المتوقع أن يكون أي إصلاح للحمض النووي دقيقا ، إلا أن هناك آليات أقل دقة لإصلاح الحمض النووي يمكن أن تترك وراءها ندوبا في التسلسل ، وبالتالي ، طفرات فقدانالوظيفة 4. من بين آليات إصلاح الحمض النووي المعرضة للخطأ ، يمكن أن يتسبب الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) في حدوث طفرات في إزاحة الإطار ، بما في ذلك عمليات الحذف الصغيرة ، والإدخالات ، وتغييرات النيوكليوتيدات (SNPs) ، والتي يمكن أن تؤدي إلى طفرة فقدان الوظيفة. من ناحية أخرى ، تعتمد آلية الإصلاح الموجه للتماثل (HDR) على الكروموسوم المتماثل كقالب لنسخ التسلسل الدقيق للأليل غير التالف وإجراء إصلاح مثالي لتسلسل الحمض النووي المستهدف4.

بناء على هذه المعرفة ، تم تطوير تقنية CRISPR-Cas9 لتحرير الجينومات بدقة ، ويمكن القول إنه في أي تسلسل يحتوي على موقع PAM3. في البعوض ، تم استخدام تقنية CRISPR-Cas9 للقضاء على مجموعة متنوعة من الجينات ، من خلال الحقن المجهري الجنيني لمزيج من Cas9 و gRNAs ، مع الاستفادة من آلية إصلاح NHEJ5،6. يتم الحصول على طفرات جرثومية مماثلة عن طريق حقن gRNA + Cas9 مزيج في هيموليمف إناث البعوضالبالغة 7. تمت صياغة هذه التقنية ReMOT control وتعتمد على نسخة معدلة من Cas9 الموسومة بببتيد يمتصه المبيضان من خلال الالتقام الخلوي أثناء عملية نمو البويضات (تكوين الزجاج)7. لا يمكن إدخال أشرطة جينية معينة في الجينوم إلا من خلال الحقن المجهري الجنيني لمزيج من gRNA و Cas9 (أو البلازميد الذي يعبر عن تلك الجزيئات) جنبا إلى جنب مع البلازميد الذي يشفر كاسيت الحمض النووي المطلوب8. بالاستفادة من آلية HDR ، يتم استخدام البلازميد الذي يحتوي على كاسيت الحمض النووي ذي الأهمية المحاط بتسلسلات متجانسة (500-1,000 نقطة أساس) 9,10 في المنبع وأسفل الموقع المستهدف كقالب لإعادة كتابة كسر الخيط المزدوج ، ونسخ أيضا كاسيت الحمض النووي إلى التسلسل المستهدف9.

تم استخدام تقنية CRISPR-Cas9 للقضاء على جينات متعددة تشارك بشكل أساسي في الأنظمة الحسية في البعوضة الزاعجة المصرية11 ، ولكن أيضا الجينات المرتبطة بخصوبة الذكور وبقاء الإناث (PgSIT) للتحكم في السكان12. تم أيضا القضاء على الجينات المستهدفة عن طريق طرق الجينات التي تشفر علامات الفلورسنت في تسلسلات الترميز لجينات معينة13،14. تتميز هذه الإستراتيجية ليس فقط بإحداث طفرات في تغيير الإطار ولكن أيضا السماح باستخدام ضوء الفلورسنت لفرز الأفراد في خط خروج المغلوبالجديد 13،14. كما تم تحرير الجينوم A. aegypti باستخدام تسلسلات أنظمة التعبير الثنائي ، مثل نظام Q (QF-QUAS) 11. يضمن ضرب الجين الذي يشفر منشط QF في اتجاه مجرى النهر إلى محفز لجين معين التعبير الزماني المكاني المحدد للمنشط15،16. بمجرد عبور خط البعوض الذي يعبر عن QF إلى خط بعوض آخر يحتوي على مواقع الارتباط (QUAS) لمؤسسة قطر ، يرتبط الأخير به ويطلق التعبير عن الجينات في اتجاه مجرى النهر إلى تسلسل QUAS15،16. يسمح هذا النظام ، بشكل عام ، بالتعبير عن هذه الجينات المستجيبة الخاصة بالأنسجة والوقت ، والتي يمكن أن تكون علامات فلورية تستخدم لتوطين الخلايا أو الكشف عن النشاط العصبي ، وحتى نوكليازات Cas9 لتعطيل الجينات في أنسجة معينة (أي الضربة القاضية الجسدية) 11.

بالنظر إلى جميع المعلومات المتاحة للتحول الجيني A . aegypti ، نقدم هنا بروتوكولا مفصلا مع توجيهات خطوة بخطوة لإجراء تحرير الجينوم باستخدام نظام CRISPR-Cas9 من خلال الحقن المجهري الجنيني. تتم مناقشة استراتيجيات توليد كل من الضربة القاضية ، من خلال طفرات إزاحة الإطار والحذف بوساطة NHEJ ، وخطوط الضربة القاضية ، عن طريق إدراج كاسيت الجينات بوساطة HDR.

Protocol

التفاصيل المتعلقة بالمعدات والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول مدرجة في جدول المواد. تم التعامل مع جميع وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر ، على النحو الموصى به من قبل المعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على الإجراءات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه في جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو (IACUC ، بروتوكول استخدام #S17187) وتصريح الاستخدام البيولوجي في جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو (BUA #R2401).

1. gRNAs وتصميم البلازميد المتبرع

  1. لصنع طفرات خروج المغلوب ، صمم اثنين من gRNAs متباعدة بمقدار ~ 20-100 نقطة أساس (الشكل 1 أ).
    1. صمم 20 نقطة أساس gRNAs ل CRISPR-Cas9 ، باستثناء تسلسل PAM (NGG) باستخدام أداة عبر الإنترنت (الشكل 1 أ) ، مثل CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/) 17أو Benchling (benchling.com) أو CRISPOR (http://crispor.gi.ucsc.edu/) 18. حدد gRNAs الأكثر تحديدا والخالية من الهدف للتجارب ، كما هو مقترح من قبل الأداة عبر الإنترنت.
    2. تأكد من تضمين موقع قطع إنزيم تقييد فعال في التسلسل بين مواقع قطع gRNA (الشكل 1 أ). قم بتضمين موقع إنزيم تقييد بين مواقع قطع الحمض النووي الريبي للسماح بالتأكيد البصري السريع للتعديلات الناجحة.
      ملاحظة: عند حدوث الحذف ، تتم إزالة موقع التقييد ، لذلك لن يقطع الإنزيم التسلسل ، مما ينتج عنه شريط واحد غير مقطوع على هلام لتأكيد الحذف.
  2. بالنسبة لإدراج كاسيت الجينات بوساطة HDR ، صمم العديد من gRNAs باستخدام الأدوات المذكورة لصنع طفرات خروج المغلوب وحدد أكثرها فاعلية بعد التقييم اللاحق.
  3. تصميم بلازميدات مانحة للإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) التي تحتوي على أذرع تماثل الموقع المستهدف ، وتسلسل الحمض النووي للشحن ، وعلامة الفلورسنت ، وأصل النسخ المتماثل ، وجين مقاومة المضادات الحيوية (الشكل 1 ب).
    1. اختر أذرع التماثل من مناطق المنبع والمصب للموقع المستهدف ، كل منها يمتد من 500 إلى 1,000 نقطةأساس 10 (الشكل 1 ب).
    2. حدد تسلسل الشحنة ، والذي قد يتضمن علامة فلورية أو جين محل اهتمام أو عنصر تنظيمي (على سبيل المثال ، QF2).
    3. حدد علامة الفلورسنت. علامات الفلورسنت الشائعة المستخدمة ل A. aegypti يتم تضمينها في كاسيت الحمض النووي الذي يحتوي على محفز وجين ترميز علامة الفلورسنت وتسلسل UTR 3 '. انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل.

2. تحضير خليط الحقن

  1. قم بتخفيف بروتين Cas9 باستخدام المخزن المؤقت للتخفيف Cas9 إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر.
    ملاحظة: لا تقم بإذابة وتجميد Cas9 أكثر من 2x. ينصح بعمل حصص من بروتين Cas9.
  2. قم بشراء gRNAs أو إنتاجها داخليا.
    ملاحظة: للإنتاج الداخلي ، استخدم ممارسات إزالة تلوث الحمض النووي الريبي القياسية والمواد الخالية من الحمض النووي الريبي.
    1. صمم 4-6 gRNAs واختر أفضل اثنين من gRNAs للحقن (انظر مقايسة الانقسام في المختبر أدناه).
    2. صمم برايمر أمامي يتضمن تسلسل محفز T7 في المنبع من تسلسل gRNA. استخدم التمهيدي العكسي العالمي gRNA لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل غير القالبية، كما هو موضح أدناه. تتداخل أزواج قواعد التسلسل المتداخلة مع التسلسل المقابل في التمهيدي العكسي العالمي (غامق ومسطر) ، مما يخلق نموذجا لبوليميراز الحمض النووي لتضخيم تسلسلاتها.
      ملاحظة: بالنسبة لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل هذه ، يجب أن يحتوي التمهيدي الأمامي على محفز T7 (غامق) ، متبوعا باثنين من الجوانين (مهم لبدء النسخ عبر T7 RNA polymera) ، وتسلسل 20 نيوكليوتيد ل gRNA (N20 ؛ بدون تسلسل PAM) ، وتسلسل التمهيدي المتداخل (تحته).
      التمهيدي إلى الأمام: 5 '- GAAATTAATACGACTCACTATAGGN20 GTTTTAGAGCTAGAAATAGC- 3'
      عكس التمهيدي: 5 '' -AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTTT CAAGTTGATAACGGACTAGC
      CTTATT TTAACTT GCTATTTCTAGCTCTAAAAC - 3 '
    3. قم بتجميع قالب الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل غير النموذجي. قم بإعداد تفاعلات متعددة (يحتوي كل منها على 12.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي 2x ، و 1.25 ميكرولتر من محلول 10 ميكرومتر من التمهيدي الأمامي ، و 1.25 ميكرولتر من محلول 10 ميكرومتر من التمهيدي العكسي ، و 10 ميكرولتر من الماء عالي النقاء) بحيث يتوفر ما يكفي من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (300 نانوغرام) لتفاعل النسخ في المختبر . استخدم شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية: التمسخ الأولي لمدة 30 ثانية عند 98 درجة مئوية ؛ 35 دورة تضخيم لمدة 10 ثوان عند 98 درجة مئوية ، و 10 ثوان عند 62 درجة مئوية ، و 10 ثوان عند 72 درجة مئوية ؛ التمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين ؛ والتخزين عند 4 درجات مئوية.
    4. تأكيد تضخيم جزء واحد من الحمض النووي (122 زوجا أساسيا) على هلام الاغاروز (2٪).
    5. قم بتنظيف قالب PCR باستخدام مجموعة تنقية PCR ، باتباع توصيات الشركة المصنعة.
    6. قم بإجراء تفاعل نسخ في المختبر باستخدام مجموعة نسخ T7. امزج 2 ميكرولتر من محلول تفاعل 10x ، و 2 ميكرولتر لكل من النيوكليوتيدات (ATP و CTP و UTP و GTP) ، و 2 ميكرولتر من بوليميراز T7 RNA RNA ، و 3 ميكرولتر من قالب الحمض النووي (100 نانوغرام / ميكرولتر) ، و 5 ميكرولتر من الماء عالي النقاء. احتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل (لا تزيد عن 16 ساعة) إلى الليل (12 ساعة).
      ملاحظة: في هذا التفاعل ، يرتبط بوليميراز T7 RNA بمحفز T7 المضمن في التسلسل الأمامي التمهيدي ، مما يؤدي إلى نسخ gRNA.
    7. عالج تفاعل النسخ باستخدام DNase عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من DNase (تخلط جيدا) واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    8. قم بتنقية sgRNAs المركبة باستخدام مجموعة تنظيف النسخ باتباع توصيات الشركة المصنعة.
    9. قم بإجراء فحص الانقسام في المختبر لتقييم كفاءة القطع لل gRNAs المحددة (الشكل 1C).
      1. صمم بادئات لتضخيم جزء من الحمض النووي (500-1,000 نقطة أساس) يحيط بموقع قطع الحمض النووي الريبي.
      2. قم بإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل على النحو التالي: 12.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي 2x ، و 1.25 ميكرولتر من محلول 10 ميكرومتر من التمهيدي الأمامي ، و 1.25 ميكرولتر من محلول 10 ميكرومتر من التمهيدي العكسي ، و 9 ميكرولتر من الماء فائق النقاء ، و 1 ميكرولتر من الحمض النووي للقالب 5 نانوغرام / ميكرولتر.
      3. استخدم شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية: الشروط: التمسخ الأولي لمدة 30 ثانية عند 98 درجة مئوية ؛ 35 دورة تضخيم لمدة 10 ثوان عند 98 درجة مئوية ، و 15-30 ثانية عند X درجة مئوية (درجة حرارة التلدين المثالية للبادئات) ، و 35 ثانية عند 72 درجة مئوية ؛ التمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين ؛ والتخزين النهائي طويل الأجل عند 4 درجات مئوية.
      4. راجع إرشادات الشركة المصنعة للحصول على أفضل درجات حرارة التضخيم والفترة الزمنية. قم بتجميع ما لا يقل عن خمسة تفاعلات أو قم بتوسيع نطاق أحجام الكواشف بحيث يتم الحصول على ما يكفي من منتج PCR (1.5-2 ميكروجرام) بعد تنظيف تفاعل البوليميراز المتسلسل (نطاق واحد) أو تنقية نطاق تفاعل البوليميراز المتسلسل (ثنائي التردد الفردي) أو هلام الاغاروز
      5. قم بإعداد تفاعلات الانقسام Cas9 مع Cas9 المؤتلف عن طريق احتضان الخليط التالي عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة: 1 ميكرولتر من 10x Cas9 المخزن المؤقت للتفاعل ، 0.35 ميكرولتر من Cas9 المؤتلف (1 ميكروغرام / ميكرولتر) ، 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي (100 نانوغرام / ميكرولتر) ، 6.65 ميكرولتر من الماء فائق النقاء ، و 1 ميكرولتر من 300 نانوغرام / ميكرولتر من الحمض النووي للقالب.
      6. قم بإعداد تفاعل تحكم سلبي بدون أي gRNA.
      7. تحقق من كفاءة الانقسام عن طريق تشغيل التفاعلات على هلام الاغاروز (1.5-2.0٪ ؛ الشكل 1 ج).

3. تجميع البلازميد المتبرع

  1. تفاعل البوليميراز المتسلسل تضخيم أذرع التماثل من الحمض النووي الجيني ل A. aegypti.
    1. لتصميم التمهيدي، يرجى الرجوع إلى إرشادات الشركة المصنعة لمجموعة الاستنساخ. استخدم أداة عبر الإنترنت (على سبيل المثال ، Benchling) ، والتي توفر الدعم لتصميم البلازميد وتجميعه باستخدام استراتيجيات استنساخ مختلفة (على سبيل المثال ، Gibson و Golden Gate والاستنساخ القائم على إنزيم التقييد).
    2. تضخيم تسلسل البضائع من A. aegypti الحمض النووي الجيني أو اطلب جزءا جينيا مركبا تجاريا.
    3. تضخيم علامات الفلورسنت من البلازميدات داخل الشركة.
  2. ربط شظايا الحمض النووي من الخطوات 3.1.1 إلى 3.1.3 في العمود الفقري للبلازميد الموجود بواسطة تجميع جيبسون. احتضان خليط من 10 ميكرولتر من 2x مزيج رئيسي ، X ميكرولتر من جميع شظايا الحمض النووي ، 10-X ميكرولتر من الماء عالي النقاء عند 50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
    ملاحظة: راجع إرشادات الشركة المصنعة لحساب النسبة المثالية للإدخالات إلى العمود الفقري للبلازميد.
    1. احسب تركيزات كل جزء من أجزاء الاستنساخ في مولات بيكو: pmols = (الوزن بالنانوغرام) × 1,000 / (أزواج القواعد × 650 دالتون).
    2. استخدم 50-100 نانوغرام من العمود الفقري البلازميد و 2-3 أضعاف الضرس الزائد من كل إدراج.
    3. في حالة تجميع 2-3 شظايا ، أضف 0.02-0.5 بمول من كل جزء إلى تفاعل جيبسون. في حالة تجميع 4-6 أجزاء ، أضف 0.2-1.0 pmols من كل واحدة.
  3. استخدم 3-5 ميكرولتر من تفاعل تجميع جيبسون لتحويل بكتريا قولونية الخلايا المختصة JM109.
    ملاحظة: تم اختيار JM109 لتجميع جيبسون نظرا للنمط الجيني recA ، مما يقلل من أحداث إعادة التركيب غير المرغوب فيها ويمنع ترحيل النوكلياز أثناء حصاد الخلايا ، مما يضمن سلامة شظايا الحمض النووي المجمعة
    بالنسبة للبلازميدات التي يزيد حجمها عن 10 كيلو بايت ، نوصي بتحويل الخلايا المختصة DH5α باستخدام البروتوكول الموسع ، باتباع توصيات الشركة المصنعة.
  4. قم بتوسيع البكتيريا المحولة وتنقية البلازميد باستخدام مجموعة miniprep.
  5. لتأكيد التجميع الصحيح للبلازميد ، قم بتشغيل هضم إنزيم تقييد تشخيصي باستخدام الحمض النووي البلازميد المنقى وتخيله عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز (الشكل 1D ، E).
    ملاحظة: نقترح استخدام أداة عبر الإنترنت لاختيار اثنين من إنزيمات التقييد التي يمكن أن تقطع البلازميد في موقع واحد. يحتوي برنامج مثل Benchling على أداة مدمجة تقوم بإجراء عملية الهضم الافتراضي لتسلسلات البلازميد باستخدام إنزيمات التقييد المحددة ، وتعرض نمط نطاق الحمض النووي المتوقع على هلام الرحلان الكهربائي الافتراضي (الشكل 1 د).
    1. قم بإجراء هضم إنزيم تقييد البلازميد. احتضان خليط من 1 ميكرولتر من 10x المخزن المؤقت للهضم التقييدي ، و 0.5 ميكرولتر من إنزيم التقييد 1 ، و 0.5 ميكرولتر من إنزيم التقييد 2 ، و 1 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد (300 نانوغرام / مل) ، و 7 ميكرولتر من الماء عالي النقاء عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
    2. قم بتشغيل تفاعلات هضم التقييد على هلام الاغاروز (1.5٪).
      ملاحظة: يجب أن يشبه نمط نطاق الحمض النووي (الشكل 1E) نمط نطاق الملخص الافتراضي (الشكل 1 د). يمكن أيضا إرسال البلازميدات لتسلسل البلازميد الكامل إذا كانت الخدمة متاحة.
  6. استزراع استنساخ البلازميد في 150 مل من وسائط LB.
  7. قم بإجراء البلازميد maxiprep ، باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  8. البلازميد في ماء فائق النقاء.

4. خلط بنية الحقن

ملاحظة: يتم توفير نطاقات التركيز النهائية المقترحة لكل بناء في الجدول 1. ابدأ بنسبة 2: 1: 2 (ng Cas9: ng sgRNA: ng بلازميد المتبرع) واضبطه حسب الضرورة لتحسين كفاءة HDR. ستساعد مراقبة النتائج في تحديد المجموعة الأكثر فعالية.

  1. لصنع المسوخ بالضربة القاضية ،
    1. قم بتخفيف حصة بروتين Cas9 إلى التركيز المطلوب باستخدام المخزن المؤقت للتخفيف Cas9 وتخفيف حصة gRNA بالماء فائق النقاء.
    2. امزج بروتين Cas9 مع كل gRNA لتشكيل مركب البروتين النووي الريبي (RNP). امزج المحاليل المخلوطة مسبقا.
  2. لإدخال كاسيت الجينات بوساطة HDR ،
    1. قم بتخفيف وخلط بروتين Cas9 و gRNAs على النحو المقترح لصنع المسوخ بالضربة القاضية.
    2. خفف البلازميد المتبرع بالماء عالي النقاء.
    3. اجمع بين جميع البنيات.

5. سحب وتحميل إبر الحقن المجهري

  1. استخدم خيوط الكوارتز لسحب إبر الحقن (الشكل 2). تأكد من أن طول الفتيل 10 سم ، وقطره الخارجي 1 مم وقطره الداخلي 0.7 مم.
  2. اسحب الإبر باستخدام مجتذب الماصات الدقيقة بالليزر باستخدام أحد البرنامجين التاليين:
    البرنامج 1: الحرارة 805 ، الشعيرة 4 ، السرعة 50 ، التأخير 145 ، السحب 145
    البرنامج 2: الحرارة 650 ، الشعيرة 4 ، السرعة 40 ، التأخير 150 ، السحب 156
    ملاحظة: ينتج عن البرنامج 1 طرف إبرة أرق ولكن أطول ، مما يجعله مناسبا للحقن ذات التركيبات ذات التركيز المنخفض ، حيث يكون الطرف الدقيق مفيدا للدقة. ينتج عن البرنامج 2 طرف إبرة أقصر ولكن أكثر سمكا ، وهو مثالي للحقن عالي التركيز ، حيث يكون البناء أكثر سمكا ويتطلب إبرة أكثر ثباتا.

6. حصاد الأجنة

  1. قم بإعداد شفاط كهربائي أو يدوي لجمع البعوض واستخدام قوارير بلاستيكية لجمع الأجنة وحصادها.
  2. بلل أوراق الترشيح ذات الدائرة البيضاء وضعها على الجدار الداخلي أو فوق القطن الرطب في المجمع.
  3. ضع 5-10 إناث بعوض تم تغذيتها بالدم منذ 5-10 أيام في المجمع. ضع المجمع في الظلام لمدة 45 دقيقة.
  4. أخرج أوراق الترشيح لحصاد الأجنة.

7. تشكيلة الجنين

  1. استخدم سلالة من النوع البري (ليفربول) من A. aegypti لحقن الأجنة.
  2. حدد أجنة مرحلة ما قبل الأرومة ، خاصة تلك ذات اللون الرمادي الفاتح ، من ورق الحصاد (الشكل 3).
  3. انقل بعض الأجنة بفرشاة مبللة إلى الشريط اللاصق على الوجهين الموضوع فوق الغطاء. قم بمحاذاة الأجنة بالتوازي بينما لا تزال محيطها مبللة مع التأكد من أنها جنبا إلى جنب ، مع مواجهة جميع الأطراف الخلفية للجبهة.
  4. بمجرد وضعها بشكل صحيح ، اترك البيئة تجف قليلا لتثبيت الأجنة في مكانها.
  5. أضف زيت الهالوكربون 700 على الأجنة أثناء المحاذاة لمنع الجفاف.
    ملاحظة: تأكد من أن الأجنة ليست محاطة بالماء عند إضافة الزيت ، لأن ذلك قد يتسبب في طفو الأجنة في الزيت.

8. الحقن المجهري للأجنة

ملاحظة: يتم الحقن في درجة حرارة الغرفة أو عند 18 درجة مئوية. يوصى بدرجة حرارة 18 درجة مئوية لأسباب عملية ، لأنها تؤخر نمو الجنين.

  1. قم بإعداد حاقن دقيق بالمعلمات التالية: ضغط التعويض (Pc) 300 hPa ، ضغط الحقن (Pi) 500 hPa. اضبط هذه الشروط عند الضرورة.
  2. قم بتحميل 3 ميكرولتر من البنية المختلطة في إبرة باستخدام محمل صغير.
  3. ضع زجاج الغطاء مع الأجنة المحاذاة فوق شريحة المجهر (الشكل 3). ضع زجاج الغطاء وانزلق تحت المجهر للحقن. تأكد من وضع الطرف الخلفي للجنين باتجاه الإبرة.
  4. ضع إبرة واحدة في حامل إبرة مع معالج دقيق وضع الإبرة بزاوية 10 درجات باتجاه الطرف الخلفي للأجنة المحاذاة ، مع إبقائها ثابتة (الشكل 4 أ). افتح الإبرة برفق تحت المجهر ولمسها برفق بحافة الغطاء.
    ملاحظة: خيار آخر هو إنشاء فتحة صغيرة في الإبرة عن طريق النقر عليها بجنين. ومع ذلك ، يوصى بفتح إبرة أوسع قليلا ، حيث يمكن أن يؤدي التصاق بروتين Cas9 إلى انسداد الإبرة.
  5. حرك الزجاج المنزلق باتجاه الإبرة للحقن (الشكل 5).

9. الرعاية اللاحقة للجنين المحقون

  1. استخدم مناديل مبللة خالية من النسالة يمكن التخلص منها لإزالة الزيت المحيط بالأجنة.
  2. أضف الماء منزوع الأيونات لشطف الأجنة ، وانقل الأجنة إلى ورق ترشيح مبلل. ضع ورق الترشيح المبلل على منديل مبلل داخل أكواب 9 أونصات قيراط (الشكل 4 ب والشكل 6 أ ، ب).
  3. ضع القطن المبلل في قاع الكوب للحفاظ على الرطوبة (الشكل 6 ب).
  4. احفظ الأجنة المحقونة على ورق ترشيح مبلل.

10. تفقيس الأجنة وفحص يرقة G0

  1. بعد 4 أيام على الأقل من الحقن ، انقل ورق الترشيح مع الأجنة إلى ما يقرب من 3 لترات من الماء منزوع الأيونات في أحواض معقمة سعة 6 لتر للتفقيس.
    ملاحظة: يفقس البيض عادة بشكل أكثر كفاءة في غضون أسبوعين بعد الحقن. تأكد من بقاء البيض رطبا خلال هذه الفترة. يجب ألا يكون ورق الترشيح رطبا جدا ، لأن الرطوبة الزائدة قد تؤدي إلى فقس الأجنة مبكرا. في حين أن الحفظ لفترة أطول قد يحسن معدلات الفقس ، فلا تتجاوز شهرا للحصول على أفضل النتائج. قد يساعد استخدام الماء غير المؤكسج أيضا في الفقس.
  2. بمجرد أن تفقس يرقات G0 ، أضف طعام السمك الممزوج بالماء إلى المقلاة كغذاء.
  3. قم بفحص يرقات G0 بحثا عن علامة الفلورسنت في مرحلة اليرقات من 3 إلى 4 (الشكل 7).
  4. حافظ على اليرقات بشكل منفصل بناء على حالتها الفلورية ، مع حفظ اليرقات الموجبة للفلورسنت واليرقات السالبة الفلورية في أحواض منفصلة.

11. شرانق فرز الجنس والتهجين إلى النوع البري

  1. افصل البعوض المحقون حسب الجنس عند خادرته ، باستخدام الحجم والهياكل الخاصة بالجنس في الفص التناسلي لتحديد الهوية:
    1. الذكور: حجم أصغر ، فص تناسلي أكثر بروزا ومدببا ، ومجاذيف أوسع (هياكل في نهاية ذيل الشرانق ؛ الشكل 8 أ1 ، أ 2).
    2. الإناث: حجم أكبر ، فص تناسلي أصغر وأقل وضوحا ، ومجاذيف أضيق (الشكل 8 ب1 ، ب 2).
  2. تجمع البعوض الموجب للفلورسنت أو سالب الفلورسنت من كل جنس.
  3. تفوق على البعوض المتجمع مع البعوض من الجنس الآخر من سلالة ليفربول. استخدم نسبة 3: 1 إلى 5: 1 من النوع البري إلى بعوضة G0.
  4. اعبر البعوض لمدة 4 أيام.
  5. تزويد الإناث بوجبة دم بعد العبور.

12. فحص G1

  1. بعد ثلاثة أيام من الرضاعة بالدم ، قم بتوفير أكواب البيض عن طريق وضع منشفة ورقية داخل جدار أكواب قيراط 9 أونصات وإضافة حوالي 3 أونصات من الماء منزوع الأيونات.
  2. بعد 3-4 أيام ، قم بحصاد وأفقس أجنة G1. قم بفحص يرقات G1 بحثا عن علامة الفلورسنت في مراحل الطور الثالث إلى الرابع (الشكل 7).
  3. اجمع اليرقات الفلورية ، مما يشير إلى إدخال HDR. عندما يصل أفراد G1 الفلوري إلى مرحلة العذراء ، افصلهم حسب الجنس وضع كل جنس في أقفاص منفصلة.
  4. تجاوز بعوض G1 الفلوري للأفراد من الجنس الآخر لسلالة ليفربول.

13. موقع الإدراج G1 يؤكد

  1. بعد توفير وجبة الدم ، قم بإعداد إناث G1 لوضع بيض أنثى واحدة عن طريق وضع قطعة صغيرة من المناديل الورقية في قوارير ذبابة الفاكهة الفردية وإضافة 3 مل من الماء منزوع الأيونات.
  2. للطفرات بالضربة القاضية:
    1. بعد وضع البيض ، يتبخر الماء ، وتجف المنشفة الورقية ، ويفقس البيض من الإناث التي تظهر بوضوح طفرات بالضربة القاضية وتحصل على جيل G2.
    2. جمع جثث الأمهات G1 قد نجحت في تفقس نسل G2 واستخراج الحمض النووي.
    3. استخدم الحمض النووي كقالب ل تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم التسلسل الذي يغطي الموقع المستهدف. تأكد من أن البادئات تضخم جزء من الحمض النووي ~ 200 نقطة أساس. قم بإعداد التفاعلات (يحتوي كل منها على 12.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي 2x ، و 1.25 ميكرولتر من محلول 10 ميكرومتر من التمهيدي الأمامي ، و 1.25 ميكرولتر من محلول 10 ميكرومتر من التمهيدي العكسي ، و 9 ميكرولتر من الماء عالي النقاء ، و 1 ميكرولتر من قالب الحمض النووي [5 نانوغرام / ميكرولتر]). استخدم شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية: التمسخ الأولي لمدة 30 ثانية عند 98 درجة مئوية ؛ 35 دورة تضخيم لمدة 10 ثوان عند 98 درجة مئوية ، و 15-30 ثانية عند X درجة مئوية (درجة حرارة التلدين المثالية للبادئات) ، و 10 ثوان عند 72 درجة مئوية ؛ التمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين ؛ والتخزين النهائي طويل الأجل عند 4 درجات مئوية.
    4. قم بتنقية شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل وإجراء هضم إنزيم التقييد لشظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق احتضان خليط من 1 ميكرولتر من 10x المخزن المؤقت للهضم التقييدي ، و 0.5 ميكرولتر من إنزيم التقييد 1 ، و 0.5 ميكرولتر من إنزيم التقييد 2 ، و 1 ميكرولتر من جزء PCR (200 نانوغرام / مل) ، و 7 ميكرولتر من الماء عالي النقاء عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن استخدام بعض إنزيمات التقييد في مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل دون تنقية مسبقة.
    5. تصور هضم شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام لتأكيد ما إذا كان الانقسام قد حدث.
    6. تسلسل جزء PCR غير المهضوم لتحديد طفرات الضربة القاضية.
    7. لعمليات الإدخال بوساطة HDR، بعد وضع البيض:
      1. اجمع جثث الأمهات G1 واستخرج الحمض النووي.
      2. استخدم الحمض النووي كقالب ل تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم التسلسل الذي يغطي الموقع المستهدف.
      3. قم بإجراء تسلسل لجزء الحمض النووي المضخم لتأكيد سلامة كاسيت الحمض النووي المدخل.
      4. فقس البيضة واحصل على جيل G2.

14. توسيع خطوط كريسبر الجديدة

  1. بالنسبة للخطوط المتحولة بالضربة القاضية:
    1. قم بإعداد إناث G2 لوضع البيض ، مع 20 أنثى لكل G1. يمثل كل G1 سطرا واحدا.
    2. بعد وضع البيض ، تأكد من طفرات الضربة القاضية بنفس الطريقة المستخدمة في G1.
    3. تابع خمسة خطوط G1 تظهر طفرات محددة بوضوح في كل من G1 و G2. تفقس البيض الذي تم جمعه من G2 من كل سطر ، مما يؤدي إلى ظهور جيل G3.
    4. من بين الخطوط الخمسة المتقاطعة ، حدد خطين بلطفرات محددة بوضوح ولياقة عالية أو النمط الظاهري المطلوب.
    5. تفوق على إناث G3 من كل خط محدد مع ذكور من سلالة ليفربول.
    6. قم بإعداد 50 أنثى عازبة لوضع البيض من كل سطر. تأكد من طفرات الضربة القاضية كما حدث سابقا ل G1.
      ملاحظة: زيادة عدد الإناث في الإعداد للحفاظ على التنوع.
    7. كرر الإجراءات لجيلين إضافيين باستخدام الخطين (الشكل 4J).
  2. بالنسبة لخطوط الإدراج الجديدة بوساطة HDR:
    1. تحقق من وجود أفراد الفلورسنت في جيل G2.
    2. تفوق على بعوض G2 ، من كل فرد من G1 ، مع سلالة ليفربول. يمثل كل فرد G1 خطا واحدا.
    3. تابع ثلاثة أجيال أخرى من التهجين. تحقق باستمرار من علامة الفلورسنت وراقب اللياقةالبدنية 19 لكل سطر (الشكل 4x).
    4. حدد سطرا واحدا مع الإدخالات الصحيحة واللياقة العالية والنمط الظاهري المطلوب.

15. جعل خطوط متماثلة اللواقح

  1. بالنسبة للخطوط المتحولة بالضربة القاضية:
    1. الجيل G6:
      1. فقس البيض الذي تنتجه G5 واحصل على جيل G6.
      2. تقاطع G6 البالغين ضمن خطوطهم الخاصة (الشكل 4K والشكل 9 أ).
      3. قم بإعداد 50 أنثى G6 مفردة لوضع البيض في كل سطر ، وتفقيس البيض كما هو موضح سابقا (الشكل 9 ب).
      4. اجمع إناث G6 اللواتي نجحن في تفقس ذرية G7 ، واستخلاص الحمض النووي ، وإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل وهضم إنزيم التقييد كما هو الحال مع G1 (الشكل 9 ج).
        ملاحظة: يمكن استخدام مخزن مؤقت للسحق (SB) بسيط وغير مكلف في هذه الخطوة لاستخراج الحمض النووي.
        1. باستخدام مطحنة محمولة باليد ، نقع بعوضة واحدة في 100 ميكرولتر من 1x SB (10 ملي مولار Tris-HCl درجة الحموضة 8 ، 1 ملي مولار EDTA ، و 25 ملي كلوريد الصوديوم). أضف البروتيناز K (200 ميكروغرام / مل) واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، متبوعا ب 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين. قم بالدوران عند 10,000 × جم لمدة 5 دقائق واجمع المادة الطافية20.
      5. تأكد من الطفرة عن طريق تصور النتائج على مادة هلامية.
      6. تخلص من البويضات التي تنتجها الإناث بدون طفرات (الشكل 9 د).
      7. الحفاظ على يرقات الإناث ذات الطفرات المؤكدة لإنشاء العديد من سلالات G7 ، والتخلص من الحضنات بدون طفرات (الشكل 9 د).
    2. الجيل G7:
      1. تتقاطع الإناث والذكور داخل كل سلالة G7 (الشكل 9 ه).
      2. قم بإعداد 10 إناث G7 مفردة لوضع البيض في كل سطر ، وتفقيس البيض كما هو موضح سابقا (الشكل 9F).
      3. اجمع إناث G7 اللواتي نجحن في تفقس نسل G7 ، واستخلاص الحمض النووي ، وإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل وهضم إنزيم التقييد (الشكل 9 ز).
      4. اكتشف طفرات خروج المغلوب على كل من الأليلات أو أليل واحد من خلال تصور النتائج على مادة هلامية.
      5. حافظ على اليرقات من إناث G7 التي تم تأكيد وجود ضربة قاضية في كلا الأليلين ، مما ينتج عنه جيل G8 (الشكل 9H). تخلص من الحضنة بدون طفرات (الشكل 9H).
        ملاحظة: تضمن هذه الخطوة أن تكون الإناث متماثلة اللواقح. في G8 ، يؤكد اختبار تماثل الزيجوت للذرية ما إذا كان الآباء متماثلين الزيجوت أيضا.
    3. الجيل G8:
      1. عبر G8 البالغين لكل سلالة أنثوية G7 (الشكل 9I).
      2. اختر بشكل عشوائي خمسة ذكور G8 ، واستخرج الحمض النووي ، وقم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل وهضم إنزيم التقييد (الشكل 9J).
      3. قدم وجبة دم وأفقس البيض من إناث G8 التي تم تهجينها مع ذكور G8 المؤكدة أن لديهم ضربة قاضية في كلا الأليلين.
      4. استمر في سلالات G7 حيث يكون لدى جميع الذكور المكتشفين ضربات قاضية في كلا الأليلين ، مما يشير إلى أن هذه السلالات متماثلة اللواقح.
  2. بالنسبة لخطوط الإدراج بوساطة HDR:
    1. فقس البيض الذي تنتجه G5 واحصل على جيل G6. فحص اليرقات في مرحلة G6 لعلامات الفلورسنت.
    2. تخلص من اليرقات بدون علامات الفلورسنت (الشكل 4xi).
    3. البعوض المتداخل الذي يظهر علامات الفلورسنت.
    4. استمر في هذا الإجراء لكل جيل لاحق حتى لا يتم ملاحظة يرقة غير فلورية. في هذه المرحلة ، سيكون خط البعوض متماثل اللواقح.

النتائج

تصميم والتحقق من صحة استهداف الجينات بوساطة gRNA لإعادة تركيب تماثل HDR
لضمان استهداف الجين المطلوب بدقة ، نوصي باختيار زوجين من gRNAs ووضع أذرع التماثل 5 و 3 بالقرب من موقع القطع لإعادة التركيب المتماثل بوساطة HDR (الشكل 1 أ). على سبيل...

Discussion

غيرت تقنية CRISPR-Cas مشهد تحرير الجينوم من خلال تعزيز التغييرات الخاصة بالهدف في الكروموسومات1. على الرغم من أن العناصر القابلة للنقل كانت ضرورية لتوليد البعوض المعدل وراثيا الأول ، إلا أن مواقع إدخالها عشوائية إلى حد ما ، وقد لا يتوافق التعبير عن بنية الحمولة (...

Disclosures

O.S.A. هو مؤسس Agragene، Inc. و Synvect، Inc. مع حصة في الأسهم. تمت مراجعة شروط هذا الترتيب والموافقة عليها من قبل جامعة كاليفورنيا ، سان دييغو وفقا لسياسات تضارب المصالح الخاصة بها. يعلن المؤلفون الباقون عن عدم وجود مصالح متضاربة.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون جودي إيشيكاوا وآفا ستيفنسون على المساعدة في تربية البعوض. تم دعم هذا العمل بتمويل من جوائز المعاهد الوطنية للصحة (R01AI151004 ، RO1AI148300 ، RO1AI175152) الممنوحة ل OSA و K22AI166268 إلى NHR تم إنشاء شخصيات باستخدام BioRender.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10x Cas9 reaction bufferPNA Bio CB01
Benchling softwareBenchlingN/Awww.benchling.com
Cas9 dilution bufferPNA Bio CB03
Cas9 proteinPNA Bio CP01-50
DH5α E. coli Competent CellsNew England BiolabsC2987
Double-sided sticky tapeScotch Permanent3136
Drosophila vialsGenesee Scientific 32-109
Filter papers GE Healthcare Life Science 1450-042
Fish food TetraB00025Z6YIgoldfish flakes 
FlugsGenesee Scientific AS273
Fluorescent microscopeLeica Microsystems  M165 FC
Gene fragmentIntegrated DNA TechnologiesN/A
gRNASynthegoN/A
Halocarbon oil 700 Sigma-AldrichH8898
Injection microscopeLeica Microsystems DM2000
JM109  E. coli Competent Cells Zymo ResearchT3005
MicroinjectorEppendorfFemtoJet 4x 
Microloader Tips for Filling Femtotips EppendorfE5242956003
Micromanipulator EppendorfTransferMan 4r 
Micropipette Pullers Sutter Instrument P-2000
Microscope Cover Glass Fisherbrand 12-542-B
Microscope slide Eisco12-550-A3
Mouse blood (live mice used for feeding)University of CaliforniaIACUC, Animal Use Protocol #S17187Used for mosquito blood feeding; details comply with animal ethics protocols
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase New England BiolabsM0491S
PCR Purification KitQiagen28004
Plasmid Miniprep Kit Zymo ResearchD4036
Quartz filament Sutter InstrumentsQF100-70-10
Transcription Clean-Up KitFisher ScientificAM1908
Ultra-pure water Life Technologies10977-023

References

  1. Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nat Biotechnol. 38 (7), 824-844 (2020).
  2. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  3. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  4. Shen, H., Li, Z. DNA double-strand break repairs and their application in plant DNA integration. Genes (Basel). 13 (2), 322 (2022).
  5. Vinauger, C., et al. Modulation of host learning in Aedes aegypti mosquitoes. Curr Biol. 28 (3), 333-344.e8 (2018).
  6. Li, M., Bui, M., Yang, T., Bowman, C. S., White, B. J., Akbari, O. S. Germline Cas9 expression yields highly efficient genome engineering in a major worldwide disease vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (49), E10540-E10549 (2017).
  7. Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nat Commun. 9 (1), 3008 (2018).
  8. Rouyar, A., et al. Transgenic line for characterizing GABA-receptor expression to study the neural basis of olfaction in the yellow-fever mosquito. Front Physiol. 15, 1381164 (2024).
  9. Ang, J. X. D., et al. Considerations for homology-based DNA repair in mosquitoes: Impact of sequence heterology and donor template source. PLoS Genet. 18 (2), e1010060 (2022).
  10. Zhang, J. -. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18 (1), 35 (2017).
  11. Coutinho-Abreu, I. V., Akbari, O. S. Technological advances in mosquito olfaction neurogenetics. Trends Genet. 39 (2), 154-166 (2023).
  12. Li, M., et al. Targeting sex determination to suppress mosquito populations. eLife. 12, RP90199 (2024).
  13. Zhan, Y., Alonso San Alberto, D., Rusch, C., Riffell, J. A., Montell, C. Elimination of vision-guided target attraction in Aedes aegypti using CRISPR. Current Biol. 31 (18), 4180-4187.e6 (2021).
  14. Greppi, C., et al. Mosquito heat seeking is driven by an ancestral cooling receptor. Science. 367 (6478), 681-684 (2020).
  15. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  16. Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).
  17. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  18. Concordet, J. -. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 46 (W1), W242-W245 (2018).
  19. Williams, A. E., et al. Quantifying fitness costs in transgenic Aedes aegypti mosquitoes. J Vis Exp. , e65136 (2023).
  20. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
  21. Coutinho-Abreu, I. V., Zhu, K. Y., Ramalho-Ortigao, M. Transgenesis and paratransgenesis to control insect-borne diseases: current status and future challenges. Parasitol Int. 59 (1), 1-8 (2010).
  22. Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).
  23. Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
  24. DeGennaro, M., et al. orco mutant mosquitoes lose strong preference for humans and are not repelled by volatile DEET. Nature. 498 (7455), 487-491 (2013).
  25. McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A., Vosshall, L. B. Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans. Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).
  26. Lobo, N. F., Clayton, J. R., Fraser, M. J., Kafatos, F. C., Collins, F. H. High efficiency germ-line transformation of mosquitoes. Nat Protoc. 1 (3), 1312-1317 (2006).
  27. Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Rep. 11 (1), 51-60 (2015).
  28. Handler, A. M., Harrell, R. A. 2nd Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrephasuspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31 (2), 199-205 (2001).
  29. Harrell, R. A. . 2nd Mosquito embryo microinjection under halocarbon oil or in aqueous solution. 2024 (7), (2024).
  30. Sun, R., Raban, R., Akbari, O. S. Generating mutant strains with transgenic Cas9. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (9), 671-678 (2023).
  31. Giraldo, D., et al. An expanded neurogenetic toolkit to decode olfaction in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Cell Rep Methods. 4 (2), 100714 (2024).
  32. Liu, G., Lin, Q., Jin, S., Gao, C. The CRISPR-Cas toolbox and gene editing technologies. Mol Cell. 82 (2), 333-347 (2022).
  33. Chu, V. T., et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).
  34. Laursen, W. J., et al. Humidity sensors that alert mosquitoes to nearby hosts and egg-laying sites. Neuron. 111 (6), 874-887.e8 (2023).
  35. Weng, S. -. C., Antoshechkin, I., Marois, E., Akbari, O. S. Efficient sex separation by exploiting differential alternative splicing of a dominant marker in Aedes aegypti. PLoS Genet. 19 (11), e1011065 (2023).
  36. Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector. eLife. 9, e51701 (2020).
  37. Dalla Benetta, E., et al. Engineered Antiviral Sensor Targets Infected Mosquitoes. The CRISPR journal. 6 (6), 543-556 (2023).
  38. Li, H. -. H., et al. C-Type lectins link immunological and reproductive processes in Aedes aegypti. iScience. 23 (9), 101486 (2020).
  39. van Oers, M. M., Vlak, J. M., Voorma, H. O., Thomas, A. A. M. Role of the 3' untranslated region of baculovirus p10 mRNA in high-level expression of foreign genes. J Gen Virol. 80 (Pt 8), 2253-2262 (1999).
  40. Salem, T. Z., et al. The influence of SV40 polyA on gene expression of baculovirus expression vector systems. PloS One. 10 (12), e0145019 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

9 Cas9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved