АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы опишем подробный протокол редактирования генома с помощью эмбриональной микроинъекции комара A. aegypti с использованием технологии CRISPR-Cas9.

Аннотация

Появление технологии кластерных, регулярно перемежающихся, коротких палиндромных повторов (CRISPR)-Cas9 произвело революцию в области генной инженерии и открыло двери для точного редактирования генома у многих видов, включая немодельные организмы. У комара Aedes aegypti с помощью этой технологии были достигнуты мутации с потерей функции и вставки ДНК. В этой статье мы опишем подробный протокол редактирования генома с помощью эмбриональной микроинъекции комара A. aegypti с использованием технологии CRISPR-Cas9, уделяя особое внимание как генерации нокаутных и нокинативных линий генов. В этом протоколе кварцевые иглы заполнены смесью направляющей РНК, рекомбинантного Cas9 и плазмиды, содержащей кассету ДНК, кодирующую ген флуоресцентного маркера, если требуется выбить ген. Эмбрионы на стадии пребластодермы выстраиваются на полосе двусторонней липкой ленты, помещаемой на покровное стекло, которое затем крепится на предметное стекло. С помощью микроинъектора иглы аккуратно вводятся в задний конец эмбрионов и дозируется небольшой объем смеси CRISPR. Когда эмбрионы вылупляются, личинки проверяются под флуоресцентным эндоскопом, а куколки сортируются по полу и разделяются по разным клеткам. Как только взрослые особи появляются, их взаимно скрещивают с особями дикого типа, кормят кровью и помещают для откладывания яиц. После того, как эти яйца вылупляются, собранные флуоресцентные личинки представляют собой особей со стабильной вставкой кассеты ДНК в их геном. Затем эти личинки выращиваются до взрослой стадии, скрещиваются с особями дикого типа, а затем дополнительно оцениваются с помощью молекулярных методов, чтобы подтвердить, что точная последовательность ДНК-кассеты присутствует в желаемом месте генома комара. Гомозиготные линии также могут быть получены путем следования предусмотренному конвейеру схемы скрещивания и молекулярного скрининга мутаций.

Введение

Точное редактирование генома стало, возможно, проще, но возможно с появлением технологии молекулярных ножниц CRISPR-Cas1. Эти технологии используют механизм, который прокариотическая иммунная система использует для борьбы с фаговымиинфекциями. Среди этих систем кластеризованные, регулярно перемежающиеся, короткие палиндромные повторы (CRISPR) вместе с нуклеазой Cas9 обычно опираются на 20 РНК пар оснований, направляющих РНК (гРНК), с последовательностями, гомологичными целевой ДНК, за которыми следует последовательность протоспейсерного смежного мотива (PAM) NGG3. ГРНК, загруженные в Cas9, направляют эти нуклеазы точно к конкретным участкам-мишеням в геноме, вызывая двухцепочечные разрывы ДНК.

Двухцепочечные разрывы ДНК индуцируют механизмы репарации для заделки двойной спирали4. В то время как любая репарация ДНК должна быть точной, существуют менее точные механизмы репарации ДНК, которые могут оставлять после себя шрамы последовательности и, в свою очередь, мутации с потерейфункции. Среди подверженных ошибкам механизмов репарации ДНК негомологичное соединение концов (NHEJ) может вызывать мутации со сдвигом рамки считывания, включая небольшие делеции, вставки и нуклеотидные изменения (SNP), которые могут привести к мутации с потерей функции. С другой стороны, механизм направленной репарации гомологии (HDR) использует гомологичную хромосому в качестве матрицы для копирования точной последовательности неповрежденного аллеля и идеальной репарации целевой последовательности ДНК4.

Основываясь на этих знаниях, была разработана технология CRISPR-Cas9 для точного редактирования геномов, возможно, в любой последовательности, содержащей сайт PAM3. У комаров технология CRISPR-Cas9 была использована для нокаутирования различных генов путем микроинъекции эмбриональной смеси Cas9 и гРНК, используя механизм репарации NHEJ 5,6. Аналогичный мутагенез зародышевой линии получают при введении смеси гРНК + Cas9 в гемолимфу взрослых самок комаров7. Эта технология получила название ReMOT control и основана на модифицированной версии Cas9, меченной пептидом, который поглощается яичниками посредством эндоцитоза в процессе развития яйцеклеток (вителлогенеза)7. Встраивание специфических генных кассет в геном возможно только путем эмбриональной микроинъекции смеси гРНК и Cas9 (или плазмиды, экспрессирующей эти молекулы) вместе с плазмидой, кодирующей желаемую ДНК-кассету8. Используя преимущества механизма HDR, плазмида, содержащая представляющую интерес ДНК-кассету, окруженную гомологичными последовательностями (500-1000.н)9,10 до и ниже по потоку от целевого сайта, используют в качестве шаблона для переписывания двухцепочечного разрыва, копируя также ДНК-кассету в целевуюпоследовательность9.

Технология CRISPR-Cas9 была использована для нокаутирования нескольких генов, в первую очередь связанных с сенсорными системами у комара Aedes aegypti11, а также генов, связанных с мужской фертильностью и жизнеспособностью самок (PgSIT) для контроля популяции12. Нокаут генов-мишеней также был достигнут путем вбивания генов, кодирующих флуоресцентные маркеры, в кодирующие последовательности конкретных генов13,14. Преимущество этой стратегии заключается не только в том, что она индуцирует мутации со сдвигом рамки считывания, но и в том, что позволяет использовать флуоресцентный свет для сортировки особей новой нокаут-линии13,14. Геном A. aegypti также был отредактирован с помощью последовательностей бинарных экспрессирующих систем, таких как Q-система (QF-QUAS)11. Вбивание гена, кодирующего трансактиватор QF, вниз по потоку к промотору конкретного гена обеспечивает определенную пространственно-временную экспрессию трансактиватора15,16. Как только линия комара, экспрессирующая QF, пересекается с другой линией комара, содержащей сайты связывания (QUAS) для QF, последняя связывается с ней и запускает экспрессию генов, расположенных ниже по потоку к последовательности QUAS 15,16. Эта система, в целом, обеспечивает тканеспецифичную и специфичную во времени экспрессию таких эффекторных генов, которые могут быть флуоресцентными маркерами, используемыми для локализации клеток или обнаружения нейронной активности, и даже нуклеазами Cas9 для разрушения генов в конкретных тканях (т.е. соматического нокаута)11.

Учитывая всю доступную информацию о генетической трансформации A. aegypti , мы приводим здесь подробный протокол с пошаговыми инструкциями по выполнению редактирования генома с помощью системы CRISPR-Cas9 с помощью эмбриональной микроинъекции. Обсуждаются стратегии генерации как нокаутных с помощью мутаций и делеций со сдвигом рамки считывания, опосредованных NHEJ, так и нокиновых линий с помощью HDR-опосредованных вставок генных кассет.

протокол

Подробная информация об оборудовании и реагентах, используемых в этом протоколе, приведена в Таблице материалов. Все животные обрабатывались в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию, рекомендованным Национальными институтами здравоохранения. Процедуры были одобрены Комитетом UCSD по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC, Протокол использования животных #S17187) и Разрешением на биологическое использование UCSD (BUA #R2401).

1. ГРНК и дизайн донорской плазмиды

  1. Для создания нокаутных мутантов сконструируйте две гРНК с интервалом ~20-100.о. (рис. 1A).
    1. Спроектируйте 20.о. гРНК для CRISPR-Cas9, исключая последовательность PAM (NGG), с помощью онлайн-инструмента (рис. 1A), такого как CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/)17или Benchling (benchling.com) или CRISPOR (http://crispor.gi.ucsc.edu/)18. Выберите для экспериментов наиболее специфичные и нецелевые гРНК, как предлагает онлайн-инструмент.
    2. Убедитесь, что эффективный сайт разрезания фермента рестрикции включен в последовательность между сайтами разреза гРНК (рис. 1A). Включите сайт фермента рестрикции между сайтами разреза гРНК, чтобы обеспечить быстрое визуальное подтверждение успешных изменений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда происходит делеция, сайт рестрикции удаляется, поэтому фермент не будет резать последовательность, создавая одну неразрезанную полосу на геле для подтверждения делеции.
  2. Для HDR-опосредованных вставок генных кассет спроектируйте несколько гРНК с использованием упомянутых инструментов для создания нокаутных мутантов и выберите наиболее эффективную из них после последующей оценки.
  3. Проектируемые донорские плазмиды для гомологически направленной репарации (HDR), содержащие гомологические плечи целевого сайта, последовательность ДНК груза, флуоресцентный маркер, происхождение репликации и ген устойчивости к антибиотикам (рис. 1B).
    1. Выберите плечи гомологии из восходящей и нисходящей областей целевого сайта, каждая из которых охватывает 500-1000.о. 10 (рис. 1B).
    2. Выберите последовательность груза, которая может включать флуоресцентный маркер, представляющий интерес ген или регуляторный элемент (например, QF2).
    3. Выберите флуоресцентный маркер. Общие флуоресцентные маркеры, используемые для A. aegypti , включены в кассету ДНК, содержащую промотор, ген, кодирующий флуоресцентные маркеры, и 3'-последовательность UTR. Для получения более подробной информации см. обсуждение.

2. Приготовление инъекционной смеси

  1. Разбавьте белок Cas9 буфером для разбавления Cas9 до 1 мкг/мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не размораживайте и не замораживайте Cas9 более чем в 2 раза. Желательно делать аликвоты из белка Cas9.
  2. Приобретите гРНК или произведите их самостоятельно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для собственного производства используйте стандартные методы обеззараживания РНК и материалы, не содержащие РНК.
    1. Разработайте 4-6 гРНК и выберите лучшие две гРНК для инъекций (см. ниже анализ расщепления in vitro ).
    2. Разработайте прямой праймер, который включает последовательность промотора T7 выше последовательности гРНК. Используйте универсальный обратный праймер гРНК для нематричных ПЦР-реакций, как описано ниже. Перекрывающиеся последовательности образуют пары с соответствующей последовательностью в универсальном обратном праймере (выделены жирным шрифтом и подчеркнуты), создавая матрицу для ДНК-полимеразы для амплификации своих последовательностей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих реакций ПЦР прямой праймер должен содержать промотор Т7 (жирным шрифтом), за которым следуют два гуанина (важно для инициации транскрипции с помощью РНК-полимеразы Т7), 20-нуклеотидная последовательность гРНК (N20; без последовательности PAM) и перекрывающаяся последовательность праймера (подчеркнуто).
      Грунтовка форварда: 5'- GAAATTAATACGACTCACTATAGGN20 GTTTTAGAGCTAGAAATAGC- 3'
      Реверс капсюля: 5''-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTT CAAGTTGATAACGGACTAGC
      CTTATT TTAACTT GCTATTTCTAGCTCTAAAAC - 3'
    3. Синтезируйте матрицу ДНК методом ПЦР без матрицы. Настройте несколько реакций (каждая из которых содержит 12,5 мкл 2x мастер-смеси, 1,25 мкл 10 мкМ раствора прямого праймера, 1,25 мкл 10 мкМ раствора обратного праймера и 10 мкл сверхчистой воды) таким образом, чтобы было доступно достаточное количество продукта ПЦР (300 нг) для реакции транскрипции in vitro . Используйте следующие условия ПЦР: начальная денатурация в течение 30 с при 98 °С; 35 циклов усиления в течение 10 с при 98 °C, 10 с при 62 °C и 10 с при 72 °C; окончательное выдержание при 72 °C в течение 2 мин; и хранение при 4 °C.
    4. Подтвердите амплификацию одного фрагмента ДНК (122 пары оснований) на агарозном геле (2%).
    5. Очистите шаблон ПЦР с помощью набора для очистки ПЦР, следуя рекомендациям производителя.
    6. Проведите реакцию транскрипции in vitro с помощью набора для транскрипции T7. Смешайте 2 мкл 10x реакционного буфера, по 2 мкл нуклеотидов (АТФ, CTP, UTP и GTP), 2 мкл РНК-полимеразы T7, 3 мкл матричной ДНК (100 нг/мкл) и 5 мкл сверхчистой воды. Смесь выдерживают при температуре 37 °C в течение не менее 2 ч (не более 16 ч) до ночи (12 ч).
      Примечание: В этой реакции РНК-полимераза Т7 связывается с промотором Т7, включенным в прямую последовательность праймера, что приводит к транскрипции гРНК.
    7. Обрабатывайте реакцию транскрипции ДНКазой, добавляя 1 мкл ДНКазы (хорошо перемешайте) и инкубируя при 37 °C в течение 15 минут.
    8. Очистите синтезированные sgРНК с помощью набора для очистки транскрипции, следуя рекомендациям производителя.
    9. Проведите анализ расщепления in vitro , чтобы оценить эффективность разрезания выбранных гРНК (рис. 1C).
      1. Разработать праймеры для амплификации фрагмента ДНК (500-1000.н.), фланкирующего сайт разреза гРНК.
      2. Настройте ПЦР-реакции следующим образом: 12,5 мкл 2x мастер-смеси, 1,25 мкл 10 мкМ раствора прямого праймера, 1,25 мкл 10 мкМ раствора обратного праймера, 9 мкл сверхчистой воды и 1 мкл 5 нг/мкл матричной ДНК.
      3. Используйте следующие условия ПЦР: условия: начальная денатурация в течение 30 с при 98 °С; 35 циклов амплификации в течение 10 с при 98 °C, 15-30 с при X °C (идеальная температура отжига для грунтовок) и 35 с при 72 °C; окончательное выдержание при 72 °C в течение 2 мин; и окончательное долгосрочное хранение при 4 °C.
      4. Обратитесь к рекомендациям производителя для получения наилучших температур усиления и временного интервала. Объедините не менее пяти реакций или увеличьте объемы реагентов таким образом, чтобы после очистки ПЦР (однополосной) или очистки ПЦР-ленты агарозным гелем было получено достаточное количество продукта ПЦР (1,5-2 мкг).
      5. Проводили реакции расщепления Cas9 с рекомбинантным Cas9 путем инкубации следующей смеси при 37 °C в течение 1 ч: 1 мкл 10x реакционного буфера Cas9, 0,35 мкл рекомбинантного Cas9 (1 г/мкл), 1 мкл гРНК (100 нг/мкл), 6,65 мкл сверхчистой воды и 1 мкл 300 нг/л матричной ДНК.
      6. Настройте отрицательную реакцию контроля без какой-либо гРНК.
      7. Проверьте эффективность расщепления, запустив реакции на агарозном геле (1,5-2,0%; Рисунок 1С).

3. Сборка донорской плазмиды

  1. ПЦР-амплификация групп гомологии из геномной ДНК A. aegypti.
    1. Для получения информации о дизайне грунтовки обратитесь к рекомендациям производителя комплекта для клонирования. Используйте онлайн-инструмент (например, Benchling), который обеспечивает поддержку проектирования и сборки плазмид с использованием различных стратегий клонирования (например, Gibson, Golden Gate и клонирование на основе рестрикционных ферментов).
    2. Амплифицируйте каргообразную последовательность из геномной ДНК A. aegypti или закажите коммерчески синтезированный фрагмент гена.
    3. Амплифицируйте флуоресцентные маркеры из плазмид собственными силами.
  2. Лигирование фрагментов ДНК с этапов 3.1.1 по 3.1.3 в основу существующей плазмиды с помощью сборки Гибсона. Инкубировать смесь из 10 мкл 2x мастер-смеси, X мкл всех фрагментов ДНК, 10-х мкл сверхчистой воды при 50 °C в течение 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к рекомендациям производителя по расчету идеального соотношения вставок к плазмидному каркасу.
    1. Рассчитайте концентрации каждого клонируемого фрагмента в пикомолях: пмоль = (масса в нг) × 1 000/(пары оснований × 650 дальтон).
    2. Используйте 50-100 нг плазмидного скелета и 2-3-кратный избыток моляров каждого вставки.
    3. Если вы собираете 2-3 фрагмента, добавьте в реакцию Гибсона по 0,02-0,5 пмоль каждого фрагмента. Если вы собираете 4-6 фрагментов, добавьте по 0,2-1,0 пмоль каждого.
  3. Используйте 3-5 мкл сборочной реакции Гибсона для трансформации компетентных клеток E. coli JM109.
    Примечание: JM109 был выбран для сборки Gibson из-за его генотипа recA- , который снижает нежелательные события рекомбинации и предотвращает перенос нуклеаз во время сбора клеток, обеспечивая целостность собранных фрагментов ДНК
    Для плазмид размером более 10.н. мы рекомендуем трансформацию DH5α-компетентных клеток по расширенному протоколу, следуя рекомендациям производителя.
  4. Раскройте трансформированные бактерии и очистите плазмиду с помощью набора miniprep.
  5. Для подтверждения правильности сборки плазмиды запустите диагностическое расщепление фермента рестрикции с очищенной плазмидной ДНК и визуализируйте с помощью электрофореза в агарозном геле (рис. 1D, E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем использовать онлайн-инструмент для выбора нескольких ферментов рестрикции, которые могут разрезать плазмиду на одном участке. Программное обеспечение, подобное Benchling, имеет встроенный инструмент, который выполняет виртуальное расщепление последовательностей плазмид с выбранными ферментами рестрикции, отображая ожидаемый рисунок полосы ДНК на виртуальном геле для электрофореза (рис. 1D).
    1. Проведите расщепление фермента рестрикции плазмид. Инкубируют смесь из 1 мкл 10-кратного буфера для рестрикционного переваривания, 0,5 мкл фермента рестрикции 1, 0,5 мкл фермента рестрикции 2, 1 мкл плазмидной ДНК (300 нг/мл) и 7 мкл сверхчистой воды при 37 °C в течение 2 ч.
    2. Запустите реакцию реакции реакции рестрикции на агарозном геле (1,5%).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Структура полосы ДНК (Рисунок 1E) должна напоминать схему полосы виртуального дайджеста (Рисунок 1D). Плазмиды также могут быть отправлены на секвенирование всей плазмиды, если услуга доступна.
  6. Культивируйте клон плазмиды в 150 мл LB-среды.
  7. Проводить плазмиду максипреп, следуя рекомендациям производителя.
  8. Суспензируйте плазмиду в сверхчистой воде.

4. Смешивание инжекционной конструкции

ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагаемые окончательные диапазоны концентраций для каждой конструкции приведены в таблице 1. Начните с соотношения 2:1:2 (ng Cas9: ng sgRNA: ng донорская плазмида) и при необходимости корректируйте для оптимизации эффективности HDR. Мониторинг результатов поможет выявить наиболее эффективную комбинацию.

  1. Для создания нокаут-мутантов,
    1. Разбавьте аликвоту белка Cas9 до желаемой концентрации с помощью буфера для разведения Cas9 и разбавьте аликвоту гРНК сверхчистой водой.
    2. Предварительно смешайте белок Cas9 с каждой гРНК с образованием комплекса рибонуклеопротеинов (RNP). Соедините предварительно смешанные растворы.
  2. Для вставки HDR-опосредованных генных кассет
    1. Разбавляйте и смешивайте белок Cas9 и гРНК, как рекомендуется для создания нокаутных мутантов.
    2. Разведите донорскую плазмиду сверхчистой водой.
    3. Объедините все конструкции.

5. Вытягивание и загрузка игл для микроинъекций

  1. Используйте кварцевую нить для вытягивания инъекционных игл (Рисунок 2). Убедитесь, что длина нити составляет 10 см, внешний диаметр — 1 мм, а внутренний — 0,7 мм.
  2. Вытяните иглы с помощью лазерного съемника микропипеток по одной из следующих двух программ:
    Программа 1: Нагрев 805, Нить накала 4, Скорость 50, Задержка 145, Тяга 145
    Программа 2: Нагрев 650, Нить накала 4, Скорость 40, Задержка 150, Тяга 156
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программа 1 приводит к более тонкому, но длинному кончику иглы, что делает ее подходящей для инъекций с конструкциями с более низкой концентрацией, где более тонкий наконечник выгоден для точности. Программа 2 дает более короткий, но более толстый кончик иглы, идеально подходящий для инъекций с более высокой концентрацией, так как конструкция толще и требует более прочной иглы.

6. Забор эмбрионов

  1. Подготовьте электрический или ручной аспиратор для сбора комаров и используйте пластиковые флаконы для сбора и забора эмбрионов.
  2. Смочите белую круглую фильтровальную бумагу и положите ее на внутреннюю стену или поверх влажной ваты в коллекторе.
  3. Поместите в коллектор 5-10 самок комаров, которых кормили кровью 5-10 дней назад. Поместите коллектор в темноту на 45 минут.
  4. Выньте фильтровальную бумагу для забора эмбрионов.

7. Выстраивание эмбрионов

  1. Для инъекции эмбриона используйте дикий штамм (ливерпульский) A. aegypti .
  2. Выберите эмбрионы на стадии пребластодермы, особенно светло-серого цвета, из бумаги для сбора (Рисунок 3).
  3. Перенесите несколько эмбрионов с помощью увлажненной кисти на двустороннюю липкую ленту, размещенную поверх покровного скотча. Выровняйте эмбрионы параллельно, пока их окружение еще влажное, убедившись, что они расположены рядом, а все задние концы обращены вперед.
  4. После правильного расположения дайте окружающей среде немного подсохнуть, чтобы закрепить эмбрионы на месте.
  5. Добавьте галокарбоновое масло 700 на эмбрионы во время выравнивания, чтобы предотвратить высыхание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что эмбрионы не окружены водой при добавлении масла, так как это приведет к тому, что эмбрионы будут плавать в масле.

8. Микроинъекция эмбриона

ПРИМЕЧАНИЕ: Впрыскивание проводится при комнатной температуре или при 18 °C. Температура 18°C рекомендуется по практическим соображениям, так как она задерживает развитие эмбриона.

  1. Настройте микроинъектор со следующими параметрами: компенсационное давление (Pc) 300 гПа, давление впрыска (Pi) 500 гПа. При необходимости корректируйте эти условия.
  2. Загрузите 3 мкл смешанной конструкции в иглу с помощью микрозагрузчика.
  3. Поместите покровное стекло с выровненными эмбрионами на предметное стекло микроскопа (рисунок 3). Установите покровное стекло и поднимите его под микроскоп для инъекции. Убедитесь, что задний конец эмбриона расположен по направлению к игле.
  4. Поместите одну иглу в иглодержатель вместе с микроманипулятором и расположите иглу под углом 10° к заднему концу выровненных эмбрионов, удерживая ее неподвижно (Рисунок 4A). Аккуратно откройте иглу под микроскопом и слегка коснитесь ее краем покровного стекла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Еще один вариант – создать небольшое отверстие в игле, постучав по ней эмбрионом. Тем не менее, рекомендуется использовать немного более широкое отверстие иглы, так как липкость белка Cas9 может засорить иглу.
  5. Переместите предметное стекло в сторону иглы для инъекции (рисунок 5).

9. Последующий уход за инъецированными эмбрионами

  1. Используйте безворсовые одноразовые салфетки, чтобы удалить жир вокруг эмбрионов.
  2. Добавьте деионизированную воду, чтобы промыть эмбрионы, и переместите эмбрионы на влажную фильтровальную бумагу. Положите влажную фильтровальную бумагу на влажную салфетку в чашки Karat на 9 унций (Рисунок 4B и Рисунок 6A, B).
  3. Положите на дно чашки влажную вату, чтобы сохранить влажность (Рисунок 6Б).
  4. Храните введенные эмбрионы на влажной фильтровальной бумаге.

10. Хетчинг эмбрионов и скрининг личинок G0

  1. Не менее чем через 4 дня после инъекции перенесите фильтровальную бумагу с эмбрионами примерно в 3 л деионизированной воды в 6-литровые чашки Sterilite для вылупления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца обычно вылупляются более эффективно в течение 2 недель после инъекции. Следите за тем, чтобы яйца оставались влажными в течение этого периода. Фильтровальная бумага не должна быть слишком влажной, так как излишняя влажность может привести к раннему вылуплению эмбрионов. Хотя более длительное хранение может улучшить скорость вылупления, не превышайте месяц для достижения оптимальных результатов. Использование дезоксигенированной воды также может помочь с вылуплением.
  2. Как только личинки G0 вылупятся, добавьте в кастрюлю в качестве корма корм для рыб, смешанный с водой.
  3. Проведите скрининг личинок G0 на наличие флуоресцентного маркера на стадии личинки 3-4-го возраста (рис. 7).
  4. Ухаживайте за личинками отдельно в зависимости от их флуоресцентного статуса, при этом флуоресцентно-положительные и флуоресцентно-отрицательные личинки должны содержаться в отдельных чашах.

11. Сортировка куколок по полу и скрещивание до дикого типа

  1. Разделяйте инъекционных комаров по половому признаку, когда они окукливаются, используя для идентификации размер и специфичные для пола структуры в генитальной доле:
    1. Самцы: меньший размер, более заметная и заостренная генитальная доля и более широкие лопатки (структуры на хвостовом конце куколок; Рисунок 8А 1,А2).
    2. Самки: Больший размер, меньшая и менее выраженная генитальная доля и более узкие лопатки (Рисунок 8B 1,B2).
  2. Объедините флуоресцентно-положительных или флуоресцентно-отрицательных комаров каждого пола.
  3. Перекрещиваем сгустившихся комаров с комарами противоположного пола из ливерпульского штамма. Используйте соотношение от 3:1 до 5:1 дикого типа комара к комару G0.
  4. Скрещиваем комаров в течение 4 дней.
  5. Обеспечьте самок кровяной пищей после скрещивания.

12. Скрининг G1

  1. Через три дня после кормления кровью обеспечьте чашки для яиц, поместив бумажное полотенце внутрь стенки чашки Karat на 9 унций и добавив около 3 унций деионизированной воды.
  2. Через 3-4 дня соберите и вылупите эмбрионы G1. Проведите скрининг личинок G1 на наличие флуоресцентного маркера на 3-4-й стадиях развития (рис. 7).
  3. Соберите флуоресцентные личинки, предложив вставку HDR. Когда флуоресцентные особи G1 достигнут стадии куколки, разделите их по полу и поместите каждый пол в отдельные клетки.
  4. Перекрещивают флуоресцентные комары G1 с особями противоположного пола ливерпульского штамма.

13. Подтверждение места установки G1

  1. После получения кровяной пищи настройте самок G1 для откладки яиц одной самкой, поместив небольшой кусочек бумажного полотенца в отдельные флаконы дрозофилы и добавив 3 мл деионизированной воды.
  2. Для нокаут-мутантов:
    1. После откладки яиц вода испаряется, а бумажное полотенце высыхает, вылупляются яйца самок, которые явно проявляют нокаутирующие мутации и получают поколение G2.
    2. Соберите тела G1 матерей, которые успешно вылупились из G2 потомства и извлеките ДНК.
    3. Используйте ДНК в качестве шаблона для ПЦР для амплификации последовательности, охватывающей целевой сайт. Убедитесь, что праймеры амплифицируют фрагмент ДНК в ~200.о. Настройте реакции (каждая из которых содержит 12,5 мкл 2x мастер-смеси, 1,25 мкл 10 мкМ раствора прямого праймера, 1,25 мкл 10 мкМ раствора обратного праймера, 9 мкл сверхчистой воды и 1 мкл матричной ДНК [5 нг/μл]). Используйте следующие условия ПЦР: начальная денатурация в течение 30 с при 98 °С; 35 циклов амплификации в течение 10 с при 98 °C, 15-30 с при X °C (идеальная температура отжига грунтов) и 10 с при 72 °C; окончательное выдержание при 72 °C в течение 2 мин; и окончательное долгосрочное хранение при 4 °C.
    4. Очистите фрагменты ПЦР и проведите расщепление фрагментов ПЦР ферментом рестрикции путем инкубации смеси 1 мкл 10-кратного буфера для рестрикционного расщепления, 0,5 мкл фермента рестрикции 1, 0,5 мкл фермента рестрикции 2, 1 мкл фрагмента ПЦР (200 нг/мл) и 7 мкл сверхчистой воды при 37 °C в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые ферменты рестрикции могут быть использованы в смеси для ПЦР без предварительной очистки.
    5. Визуализируйте расщепление фрагмента ПЦР с помощью гель-электрофореза, чтобы подтвердить, произошло ли расщепление.
    6. Секвенирование непереваренного фрагмента ПЦР для выявления нокаутных мутаций.
    7. Для HDR-опосредованных вставок после откладки яиц:
      1. Соберите тело матерей G1 и извлеките ДНК.
      2. Используйте ДНК в качестве шаблона для ПЦР для амплификации последовательности, охватывающей целевой сайт.
      3. Выполните секвенирование амплифицированного фрагмента ДНК для подтверждения целостности вставленной кассеты ДНК.
      4. Вылупите яйцо и получите поколение G2.

14. Расширение новых линеек CRISPR

  1. Для нокаутирующих мутантных линий:
    1. Посадите самок G2 для откладки яиц, по 20 самок на G1. Каждая G1 представляет одну линию.
    2. После откладки яиц подтвердите нокаутные мутации таким же образом, как и для G1.
    3. Рассмотрим пять линий G1, которые демонстрируют четко идентифицированные мутации как в G1, так и в G2. Вылупляются яйца, собранные из G2 каждой линии, что дает начало поколению G3.
    4. Из пяти перечеркнутых линий выберите две линии с четко идентифицированными мутациями и высокой приспособленностью или желаемым фенотипом.
    5. Аутскрещивайте самок G3 из каждой выбранной линии с самцами из ливерпульской линии.
    6. Подготовьте по 50 одиночных самок для яйцекладки от каждой линии. Подтвердите нокаутирующие мутации, как это было сделано ранее для G1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличьте количество женщин в организации, чтобы поддерживать разнообразие.
    7. Повторите эти процедуры для двух дополнительных поколений с двумя линиями (рис. 4J).
  2. Для новых линий вставки, опосредованных HDR:
    1. Проверьте наличие флуоресцентных особей в поколении G2.
    2. Ауткроссинг комаров G2, от каждой особи G1, с ливерпульским штаммом. Каждый индивидуум G1 представляет одну линию.
    3. Продолжайте еще три поколения ауткроссинга. Постоянно проверяйте флуоресцентный маркер и следите за пригодностью19 каждой линии (Рисунок 4x).
    4. Выберите одну линию с правильными вставками и высокой физической подготовкой и желаемым фенотипом.

15. Сделайте гомозиготные линии

  1. Для нокаутирующих мутантных линий:
    1. Поколение G6:
      1. Вылупите яйца, произведенные G5, и получите поколение G6.
      2. Скрещивайте взрослых особей G6 в пределах их соответствующих линий (Рисунок 4K и Рисунок 9A).
      3. Посадите 50 одиночных самок G6 для кладки яиц в каждой линии и высиживайте яйца, как описано ранее (Рисунок 9B).
      4. Соберите самок G6, которые успешно вылупились из потомства G7, извлеките ДНК и выполните ПЦР и переваривание ферментов рестрикции, как это было сделано для G1 (рис. 9C).
        ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе для экстракции ДНК можно использовать простой и недорогой мягкий буфер (SB).
        1. С помощью ручной кофемолки размочите одного комара в 100 мкл 1x SB (10 мМ Tris-HCl pH 8, 1 мМ ЭДТА и 25 мМ NaCl). Добавьте протеиназу К (200 мкг/мл) и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут, а затем при 95 °C в течение 2 минут. Вращаем вниз при 10 000 × g в течение 5 минут и собираем надосадочную жидкость20.
      5. Подтвердите мутацию, визуализировав результаты на геле.
      6. Выбросьте яйца, произведенные самками без мутаций (рисунок 9D).
      7. Поддерживайте личинки самок с подтвержденными мутациями для создания нескольких линий G7 и отбраковывайте выводки без мутаций (Рисунок 9D).
    2. Поколение G7:
      1. Скрещивание самок и самцов в каждой линии G7 (Рисунок 9E).
      2. Посадите 10 одиночных самок G7 для кладки яиц в каждой линии и высиживайте яйца, как описано ранее (Рисунок 9F).
      3. Соберите самок G7, которые успешно вылупились из потомства G7, извлеките ДНК и выполните ПЦР и переваривание ферментов рестрикции (рис. 9G).
      4. Обнаруживайте нокаутные мутации на обоих аллелях или на одном аллеле, визуализируя результаты на геле.
      5. Поддерживайте личинок самок G7, у которых подтверждены нокауты в обоих аллелях, производя поколение G8 (Рисунок 9H). Отбраковывайте выводки без мутаций (Рисунок 9H).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг гарантирует, что самки гомозиготны. В G8 тестирование гомозиготности потомства подтверждает, являются ли отцы также гомозиготными».
    3. Поколение G8:
      1. Скрещивайте взрослых особей G8 по каждой женской линии G7 (рис. 9I).
      2. Случайным образом выберите пять самцов G8, извлеките ДНК и выполните ПЦР и расщепление ферментов рестрикции (рис. 9J).
      3. Обеспечьте кровяную пищу и вылупите яйца от самок G8, которые были скрещены с самцами G8, у которых были подтверждены нокауты в обоих аллелях.
      4. Продолжайте с линиями G7, где все обнаруженные самцы имеют нокауты в обоих аллелях, что указывает на то, что эти линии гомозиготны.
  2. Для линий вставок, опосредованных HDR:
    1. Вылупите яйца, произведенные G5, и получите поколение G6. Экранируйте личинки на стадии G6 на флуоресцентные маркеры.
    2. Отбраковывайте личинок без флуоресцентных маркеров (рис. 4xi).
    3. Скрещивайте комаров, которые демонстрируют флуоресцентные маркеры.
    4. Продолжайте эту процедуру для каждого последующего поколения до тех пор, пока не исчезнет нефлуоресцентная личинка. К этому моменту линия комара будет гомозиготной.

Результаты

Разработка и валидация гРНК-опосредованного нацеливания генов для рекомбинации HDR-гомологии
Чтобы обеспечить точное нацеливание на нужный ген, мы рекомендуем выбрать пару гРНК и расположить 5' и 3' гомологические плечи близко к месту разре...

Обсуждение

Технология CRISPR-Cas изменила ландшафт редактирования генома, способствуя специфическим для мишени изменениям в хромосомах1. Несмотря на то, что переносимые элементы были важны для создания первых трансгенных комаров, места их вставки несколько случайны, и ...

Раскрытие информации

O.S.A. является учредителем компаний Agragene, Inc. и Synvect, Inc. с долей в акционерном капитале. Условия этого соглашения были рассмотрены и одобрены Калифорнийским университетом в Сан-Диего в соответствии с его политикой в отношении конфликта интересов. Остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Авторы благодарят Джуди Исикаву и Аву Стивенсон за помощь в разведении комаров. Эта работа была поддержана финансированием от премий NIH (R01AI151004, RO1AI148300, RO1AI175152), присужденных O.S.A. и K22AI166268 N.H.R. Фигурки были созданы с помощью BioRender.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10x Cas9 reaction bufferPNA Bio CB01
Benchling softwareBenchlingN/Awww.benchling.com
Cas9 dilution bufferPNA Bio CB03
Cas9 proteinPNA Bio CP01-50
DH5α E. coli Competent CellsNew England BiolabsC2987
Double-sided sticky tapeScotch Permanent3136
Drosophila vialsGenesee Scientific 32-109
Filter papers GE Healthcare Life Science 1450-042
Fish food TetraB00025Z6YIgoldfish flakes 
FlugsGenesee Scientific AS273
Fluorescent microscopeLeica Microsystems  M165 FC
Gene fragmentIntegrated DNA TechnologiesN/A
gRNASynthegoN/A
Halocarbon oil 700 Sigma-AldrichH8898
Injection microscopeLeica Microsystems DM2000
JM109  E. coli Competent Cells Zymo ResearchT3005
MicroinjectorEppendorfFemtoJet 4x 
Microloader Tips for Filling Femtotips EppendorfE5242956003
Micromanipulator EppendorfTransferMan 4r 
Micropipette Pullers Sutter Instrument P-2000
Microscope Cover Glass Fisherbrand 12-542-B
Microscope slide Eisco12-550-A3
Mouse blood (live mice used for feeding)University of CaliforniaIACUC, Animal Use Protocol #S17187Used for mosquito blood feeding; details comply with animal ethics protocols
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase New England BiolabsM0491S
PCR Purification KitQiagen28004
Plasmid Miniprep Kit Zymo ResearchD4036
Quartz filament Sutter InstrumentsQF100-70-10
Transcription Clean-Up KitFisher ScientificAM1908
Ultra-pure water Life Technologies10977-023

Ссылки

  1. Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nat Biotechnol. 38 (7), 824-844 (2020).
  2. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  3. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  4. Shen, H., Li, Z. DNA double-strand break repairs and their application in plant DNA integration. Genes (Basel). 13 (2), 322 (2022).
  5. Vinauger, C., et al. Modulation of host learning in Aedes aegypti mosquitoes. Curr Biol. 28 (3), 333-344.e8 (2018).
  6. Li, M., Bui, M., Yang, T., Bowman, C. S., White, B. J., Akbari, O. S. Germline Cas9 expression yields highly efficient genome engineering in a major worldwide disease vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (49), E10540-E10549 (2017).
  7. Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nat Commun. 9 (1), 3008 (2018).
  8. Rouyar, A., et al. Transgenic line for characterizing GABA-receptor expression to study the neural basis of olfaction in the yellow-fever mosquito. Front Physiol. 15, 1381164 (2024).
  9. Ang, J. X. D., et al. Considerations for homology-based DNA repair in mosquitoes: Impact of sequence heterology and donor template source. PLoS Genet. 18 (2), e1010060 (2022).
  10. Zhang, J. -. P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18 (1), 35 (2017).
  11. Coutinho-Abreu, I. V., Akbari, O. S. Technological advances in mosquito olfaction neurogenetics. Trends Genet. 39 (2), 154-166 (2023).
  12. Li, M., et al. Targeting sex determination to suppress mosquito populations. eLife. 12, RP90199 (2024).
  13. Zhan, Y., Alonso San Alberto, D., Rusch, C., Riffell, J. A., Montell, C. Elimination of vision-guided target attraction in Aedes aegypti using CRISPR. Current Biol. 31 (18), 4180-4187.e6 (2021).
  14. Greppi, C., et al. Mosquito heat seeking is driven by an ancestral cooling receptor. Science. 367 (6478), 681-684 (2020).
  15. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  16. Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).
  17. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  18. Concordet, J. -. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 46 (W1), W242-W245 (2018).
  19. Williams, A. E., et al. Quantifying fitness costs in transgenic Aedes aegypti mosquitoes. J Vis Exp. , e65136 (2023).
  20. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
  21. Coutinho-Abreu, I. V., Zhu, K. Y., Ramalho-Ortigao, M. Transgenesis and paratransgenesis to control insect-borne diseases: current status and future challenges. Parasitol Int. 59 (1), 1-8 (2010).
  22. Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).
  23. Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
  24. DeGennaro, M., et al. orco mutant mosquitoes lose strong preference for humans and are not repelled by volatile DEET. Nature. 498 (7455), 487-491 (2013).
  25. McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A., Vosshall, L. B. Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans. Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).
  26. Lobo, N. F., Clayton, J. R., Fraser, M. J., Kafatos, F. C., Collins, F. H. High efficiency germ-line transformation of mosquitoes. Nat Protoc. 1 (3), 1312-1317 (2006).
  27. Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Rep. 11 (1), 51-60 (2015).
  28. Handler, A. M., Harrell, R. A. 2nd Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrephasuspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31 (2), 199-205 (2001).
  29. Harrell, R. A. . 2nd Mosquito embryo microinjection under halocarbon oil or in aqueous solution. 2024 (7), (2024).
  30. Sun, R., Raban, R., Akbari, O. S. Generating mutant strains with transgenic Cas9. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (9), 671-678 (2023).
  31. Giraldo, D., et al. An expanded neurogenetic toolkit to decode olfaction in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Cell Rep Methods. 4 (2), 100714 (2024).
  32. Liu, G., Lin, Q., Jin, S., Gao, C. The CRISPR-Cas toolbox and gene editing technologies. Mol Cell. 82 (2), 333-347 (2022).
  33. Chu, V. T., et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).
  34. Laursen, W. J., et al. Humidity sensors that alert mosquitoes to nearby hosts and egg-laying sites. Neuron. 111 (6), 874-887.e8 (2023).
  35. Weng, S. -. C., Antoshechkin, I., Marois, E., Akbari, O. S. Efficient sex separation by exploiting differential alternative splicing of a dominant marker in Aedes aegypti. PLoS Genet. 19 (11), e1011065 (2023).
  36. Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector. eLife. 9, e51701 (2020).
  37. Dalla Benetta, E., et al. Engineered Antiviral Sensor Targets Infected Mosquitoes. The CRISPR journal. 6 (6), 543-556 (2023).
  38. Li, H. -. H., et al. C-Type lectins link immunological and reproductive processes in Aedes aegypti. iScience. 23 (9), 101486 (2020).
  39. van Oers, M. M., Vlak, J. M., Voorma, H. O., Thomas, A. A. M. Role of the 3' untranslated region of baculovirus p10 mRNA in high-level expression of foreign genes. J Gen Virol. 80 (Pt 8), 2253-2262 (1999).
  40. Salem, T. Z., et al. The influence of SV40 polyA on gene expression of baculovirus expression vector systems. PloS One. 10 (12), e0145019 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

CRISPR Cas9Aedes aegyptiCas9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены