使用 CRISPR-Cas9 对埃及黄热病蚊子进行基因组编辑

摘要

在这里，我们 描述了使用 CRISPR-Cas9 技术通过对埃及蚊子进行胚胎显微注射进行基因组编辑的详细方案。

摘要

成簇、规则穿插、短回文重复序列 （CRISPR）-Cas9 技术的出现彻底改变了基因工程领域，并为多个物种（包括非模式生物）的精确基因组编辑打开了大门。在埃及 伊蚊中，功能丧失突变和 DNA 插入已经通过这项技术完成。在这里，我们描述了使用 CRISPR-Cas9 技术通过对埃及 蚊 子进行胚胎显微注射进行基因组编辑的详细方案，重点是基因敲除和敲除系的产生。在该方案中，如果需要基因敲入，则石英针填充有向导 RNA、重组 Cas9 和含有编码荧光标记基因的 DNA 盒的质粒的混合物。将胚层前阶段的胚胎排成一条双面胶带，该胶带放置在盖玻片上，随后将其安装在载玻片上。在显微注射器的帮助下，将针头轻轻插入胚胎的后端，并分配少量 CRISPR 混合物。当胚胎孵化时，在荧光镜下检查幼虫，将蛹分性别并分离在不同的笼子中。一旦成虫出现，它们就会与野生型个体相互杂交，采血，并放置产卵。一旦这些卵孵化出来，收集的荧光幼虫代表将 DNA 盒稳定插入其基因组的个体。然后将这些幼虫生长到成虫阶段，与野生型个体杂交，然后通过分子技术进一步评估，以确认 DNA 盒的确切序列存在于蚊子基因组的所需位置。纯合系也可以通过遵循提供的杂交图式和突变分子筛选管道来获得。

引言

随着分子剪刀 1 的 CRISPR-Cas 技术的建立，精确的基因组编辑可以说变得更加容易，但也是^可能的。这些技术利用了原核免疫系统用来对抗噬菌体感染的机制²。在这些系统中，成簇的、规则穿插的短回文重复序列 （CRISPR） 以及 Cas9 核酸酶通常依赖于 20 个碱基对 RNA，即向导 RNA （gRNA），其序列与目标 DNA 同源，后跟 NGG 前间隔区相邻基序 （PAM） 序列³。加载到 Cas9 上的 gRNA 将这些核酸酶精确地引导到基因组中的特定靶位点，从而触发双链 DNA 断裂³。

DNA 双链断裂诱导修复机制修补双螺旋⁴。虽然任何 DNA 修复都被认为是精确的，但存在不太准确的 DNA 修复机制，这些机制可能会留下序列疤痕，进而留下功能丧失突变⁴。在容易出错的 DNA 修复机制中，非同源末端连接 （NHEJ） 可导致移码突变，包括小缺失、插入和核苷酸变化 （SNP），从而导致功能丧失突变。另一方面，同源定向修复 （HDR） 机制依靠同源染色体作为模板来复制未受损等位基因的确切序列，并对目标 DNA 序列进行完美修复⁴。

基于这些知识，CRISPR-Cas9 技术已被开发出来，可以精确编辑基因组，可以说是任何包含 PAM 位点的序列³。在蚊子中，CRISPR-Cas9 技术已被用于敲除各种基因，通过胚胎显微注射 Cas9 和 gRNA 的混合物，利用 NHEJ 修复机制 ^5,6。通过将 gRNA + Cas9 混合物注射到成年雌性蚊子的血淋巴中可获得类似的种系诱变⁷。这项技术被称为 ReMOT 控制，它依赖于 Cas9 的改良版本，该肽被标记在卵子发育过程中通过内吞作用被卵巢吸收（卵黄形成）⁷。只有通过胚胎显微注射 gRNA 和 Cas9 的混合物（或表达这些分子的质粒）以及编码所需 DNA 盒的质粒⁸，才能将特定基因盒敲入基因组。利用 HDR 机制，使用包含目标 DNA 盒的质粒，该质粒两侧是目标位点的上游和下游同源序列 （500-1,000bp）^9,10 作为模板来重写双链断裂，也将 DNA 盒复制到目标序列^{中 9}。

CRISPR-Cas9 技术已被用于敲除主要与埃及伊蚊¹¹ 的感觉系统相关的多个基因，但也用于敲除与雄性生育力和雌性活力 （PgSIT） 相关的基因，用于种群控制¹²。敲除靶基因也是通过将编码荧光标记的基因敲入特定基因的编码序列来完成的^13,14。这种策略的优点是不仅诱导移码突变，而且还允许使用荧光对新敲除系的个体进行分类^13,14。埃及曲霉基因组也已使用二元表达系统序列进行编辑，例如 Q 系统 （QF-QUAS）¹¹。将编码 QF 反式激活因子的基因敲入特定基因的启动子下游可确保反式激活因子的明确时空表达^15,16。一旦表达 QF 的蚊子品系与另一条 QF 结合位点 （QUAS） 的蚊子品系交叉，后者就会与其结合并触发 QUAS 序列下游基因的表达^15,16。总体而言，该系统允许此类效应基因的组织特异性和时间特异性表达，这些效应基因可以是用于细胞定位或检测神经元活性的荧光标记物，甚至可以是用于破坏特定组织中基因的 Cas9 核酸酶（即体细胞敲除）¹¹。

鉴于埃及 曲霉 遗传转化的所有可用信息，我们在此提供了一个详细的方案，其中包含通过胚胎显微注射使用 CRISPR-Cas9 系统进行基因组编辑的分步指导。讨论了通过 NHEJ 介导的移码突变和缺失产生敲除的策略，以及通过 HDR 介导的基因盒插入产生敲除系的策略。

研究方案

与本协议中使用的设备和试剂相关的详细信息列在 材料表中。按照美国国立卫生研究院的建议，所有动物均按照实验动物护理和使用指南进行处理。这些程序得到了 UCSD 机构动物护理和使用委员会 （IACUC，动物使用协议 #S17187） 和 UCSD 生物使用授权 （BUA #R2401） 的批准。

1. gRNA 和供体质粒设计

1. 为了制造敲除突变体，设计两个间隔 ~20-100 bp 的 gRNA（图 1A）。
   1. 使用在线工具（图 1A）为 CRISPR-Cas9 设计 20 bp gRNA，不包括 PAM 序列 （NGG），例如 CHOPCHOP （https://chopchop.cbu.uib.no/）¹⁷或 Benchling （benchling.com） 或 CRISPOR （http://crispor.gi.ucsc.edu/）¹⁸。按照在线工具的建议，选择最特异性和脱靶的 gRNA 进行实验。
   2. 确保 gRNA 切割位点之间的序列中包含有效的限制性内切酶切割位点（图 1A）。在 gRNA 切割位点之间包括一个限制性内切酶位点，以便快速目视确认编辑成功。
      注：当发生缺失时，限制性位点被去除，因此酶不会切割序列，在凝胶上产生一个未切割的条带以确认缺失。
2. 对于 HDR 介导的基因盒插入，使用上述用于制造敲除突变体的工具设计多个 gRNA，并在以后评估后选择最有效的一种。
3. 设计用于同源定向修复 （HDR） 的供体质粒，包含目标位点同源臂、货物 DNA 序列、荧光标记、复制起点和抗生素抗性基因（图 1B）。
   1. 从目标位点的上游和下游区域选择同源臂，每个臂跨越 500-1,000 bp¹⁰ （图 1B）。
   2. 选择货物序列，其中可能包括荧光标记物、目标基因或调节元件（例如 QF2）。
   3. 选择荧光标记。用于 埃及曲霉 的常见荧光标记包含在包含启动子、荧光标记编码基因和 3' UTR 序列的 DNA 盒中。有关更多详细信息，请参阅讨论。

2. 注射混合物制备

1. 用 Cas9 稀释缓冲液将 Cas9 蛋白稀释至 1 μg/μL。
   注意：不要将 Cas9 解冻和冷冻超过 2 次。建议将 Cas9 蛋白分装。
2. 购买 gRNA 或在内部生产。
   注：对于内部生产，请使用标准 RNA 去污方法和无 RNAse 材料。
   1. 设计 4-6 个 gRNA 并选择最好的两个 gRNA 进行注射（参见下面的 体外 切割测定）。
   2. 设计一种正向引物，包括 gRNA 序列上游的 T7 启动子序列。使用通用 gRNA 反向引物进行非模板 PCR 反应，如下所述。重叠的序列碱基与通用反向引物中的相应序列配对（粗体和下划线），为 DNA 聚合酶创建一个模板来扩增它们的序列。
      注：对于这些 PCR 反应，正向引物应包含 T7 启动子（粗体），后跟两个鸟嘌呤（对通过 T7 RNA 聚合酶的转录起始很重要）、gRNA 的 20 个核苷酸序列（N₂₀;没有 PAM 序列）和引物重叠序列（下划线）。
      引物向前：5'- GAAATTAATACGACTCACTATAGGN₂₀ GTTTTAGAGCTAGAAATAGC- 3'
      引物反面：5''-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTT CAAGTTGATAACGGACTAGC
      CTTATT TTAACTT GCTATTTCTAGCTCTAAAAC - 3'
   3. 通过非模板 PCR 合成 DNA 模板。设置多个反应（每个反应包含 12.5 μL 的 2x 预混液、1.25 μL 的 10 μM 正向引物溶液、1.25 μL 的 10 μM 反向引物溶液和 10 μL 的超纯水），以便有足够的 PCR 产物 （300 ng） 可用于 体外 转录反应。使用以下 PCR 条件：在 98 °C 下初始变性 30 秒;在 98 °C 下扩增 10 秒，在 62 °C 下扩增 10 秒，在 72 °C 下扩增 10 秒;在 72 °C 下最终延伸 2 分钟;并在 4 °C 下储存。
   4. 确认在琼脂糖凝胶 （2%） 上扩增单个 DNA 片段（122 个碱基对）。
   5. 按照制造商的建议，使用 PCR 纯化试剂盒清理 PCR 模板。
   6. 使用 T7 转录试剂盒进行 体外 转录反应。混合 2 μL 10x 反应缓冲液、2 μL 核苷酸（ATP、CTP、UTP 和 GTP）、2 μL T7 RNA 聚合酶、3 μL 模板 DNA （100 ng/μL） 和 5 μL 超纯水。将混合物在 37 °C 下孵育至少 2 小时（不超过 16 小时）至过夜（12 小时）。
      注：在该反应中，T7 RNA 聚合酶与引物正向序列中包含的 T7 启动子结合，从而导致 gRNA 的转录。
   7. 加入 1 μL DNase（充分混合）并在 37 °C 下孵育 15 分钟，用 DNase 处理转录反应。
   8. 按照制造商的建议，用转录清理试剂盒纯化合成的 sgRNA。
   9. 进行 体外 切割测定以评估所选 gRNA 的切割效率（图 1C）。
      1. 设计引物以扩增 gRNA 切割位点两侧的 DNA 片段 （500-1,000 bp）。
      2. 按如下方式设置 PCR 反应：12.5 μL 的 2x 预混液、1.25 μL 的 10 μM 正向引物溶液、1.25 μL 的 10 μM 反向引物溶液、9 μL 的超纯水和 1 μL 的 5 ng/μL 模板 DNA。
      3. 使用以下 PCR 条件：条件：在 98 °C 下初始变性 30 秒;在 98 °C 下扩增 35 次，扩增 10 秒，在 X °C（引物的理想退火温度）下扩增 15-30 秒，在 72 °C 下扩增 35 秒;在 72 °C 下最终延伸 2 分钟;最终在 4 °C 下长期储存。
      4. 请参阅制造商的指南，了解最佳扩增温度和时间跨度。混合至少 5 个反应或放大试剂的体积，以便在 PCR 纯化（单条带）或琼脂糖凝胶 PCR 条带纯化后获得足够的 PCR 产物 （1.5-2 μg）。
      5. 通过在 37 °C 下孵育以下混合物 1 小时，用重组 Cas9 建立 Cas9 切割反应：1 μL 10x Cas9 反应缓冲液、0.35 μL 重组 Cas9 （1 μg/μL）、1 μL gRNA （100 ng/μL）、6.65 μL 超纯水和 1 μL 300 ng/μL 模板 DNA。
      6. 设置不含任何 gRNA 的阴性对照反应。
      7. 通过在琼脂糖凝胶 （1.5-2.0%; 图 1C）。

3. 组装供体质粒

1. PCR 扩增来自 A. aegypti 基因组 DNA 的同源臂。
   1. 有关引物设计，请参阅克隆试剂盒制造商指南。使用在线工具（例如 Benchling），该工具为使用不同的克隆策略（例如 Gibson、Golden Gate 和基于限制性内切酶的克隆）的质粒设计和组装提供支持。
   2. 扩增埃及 曲霉 基因组 DNA 的货物序列或订购市售合成的基因片段。
   3. 在内部扩增质粒的荧光标记物。
2. 通过 Gibson 组装将步骤 3.1.1 至 3.1.3 中的 DNA 片段连接到现有质粒的骨架中。将 10 μL 2x 预混液、X μL 所有 DNA 片段、10 X μL 超纯水的混合物在 50 °C 下孵育 1 小时。
   注：请参阅制造商的指南，以计算插入片段与质粒骨架的理想比例。
   1. 以皮摩尔为单位计算每个克隆片段的浓度：pmols =（以 ng 为单位的重量）× 1,000/（碱基对× 650 道尔顿）。
   2. 使用 50-100 ng 质粒骨架和每个插入片段的 2-3 倍摩尔过量。
   3. 如果组装 2-3 个片段，则向 Gibson 反应中加入 0.02-0.5 pmol 的每个片段。如果组装 4-6 个片段，则每个片段添加 0.2-1.0 pmol。
3. 使用 3-5 μL 的 Gibson 组装反应物转化 大肠杆菌感受态 细胞 JM109。
   注：选择 JM109 进行 Gibson 组装是因为其 recA- 基因型，可减少不需要的重组事件并防止细胞收获过程中的核酸酶残留，从而确保组装的 DNA 片段的完整性
   对于大于 10 kb 的质粒，我们建议按照制造商的建议，使用扩展方案转化 DH5α 感受态细胞。
4. 扩增转化的细菌并使用小量制备试剂盒纯化质粒。
5. 为了确认质粒组装正确，用纯化的质粒 DNA 运行诊断限制酶消化，并通过琼脂糖凝胶电泳观察（图 1D，E）。
   注：我们建议使用在线工具选择几种可以在单个位点切割质粒的限制性内切酶。像 Benchling 这样的软件有一个内置工具，可以使用选定的限制性内切酶对质粒序列进行虚拟消化，在虚拟电泳凝胶上显示预期的 DNA 条带模式（图 1D）。
   1. 进行质粒限制性内切酶消化。将 1 μL 10x 限制性内切缓冲液、0.5 μL 限制性内切酶 1、0.5 μL 限制性内切酶 2、1 μL 质粒 DNA （300 ng/mL） 和 7 μL 超纯水的混合物在 37 °C 下孵育 2 小时。
   2. 在琼脂糖凝胶 （1.5%） 上运行限制性消化反应。
      注意：DNA 条带模式（图 1E）应类似于虚拟消化条带模式（图 1D）。如果服务可用，也可以将质粒送去进行全质粒测序。
6. 将质粒克隆培养到 150 mL LB 培养基中。
7. 按照制造商的指南进行质粒大量提取。
8. 将质粒悬浮在超纯水中。

4. 混合注射结构

注： 表 1 中提供了每种构建体的建议最终浓度范围。从 2：1：2 的比例（ng Cas9：ng sgRNA：ng 供体质粒）开始，并根据需要进行调整以优化 HDR 效率。监测结果将有助于确定最有效的组合。

1. 对于制作敲除突变体，
   1. 使用 Cas9 稀释缓冲液将等分试样的 Cas9 蛋白稀释至所需浓度，并用超纯水稀释等分试样的 gRNA。
   2. 将 Cas9 蛋白与每个 gRNA 预混合，形成核糖核蛋白 （RNP） 复合物。混合预混溶液。
2. 对于 HDR 介导的基因盒插入，
   1. 按照制备敲除突变体的建议稀释和混合 Cas9 蛋白和 gRNA。
   2. 用超纯水稀释供体质粒。
   3. 组合所有构造。

5. 拉动和加载显微注射针

1. 使用石英丝拉动注射针（图 2）。确保细丝长 10 厘米，外径为 1 毫米，内径为 0.7 毫米。
2. 使用激光微量移液器拉拔器使用以下两个程序之一拉针：
   程序 1：加热 805，细丝 4，速度 50，延迟 145，拉动 145
   程序 2：加热 650，细丝 4，速度 40，延迟 150，拉动 156
   注：程序 1 会产生更细但更长的针尖，使其适用于较低浓度结构的注射，其中更细的针尖有利于精度。程序 2 产生更短但更粗的针尖，非常适合更高浓度的注射，因为该结构更厚，需要更坚固的针头。

6. 胚胎采集

1. 准备电动或手动吸尘器来收集蚊子，并使用塑料瓶进行收集和胚胎采集。
2. 弄湿白色圆形滤纸，然后将它们放在收集器的内壁或湿棉布上。
3. 将 5-10 只 5-10 天前采血的雌性蚊子放入收集器中。将收集器置于黑暗中 45 分钟。
4. 取出用于胚胎收获的滤纸。

7. 胚胎阵容

1. 使用 埃及曲霉 的野生型菌株 （Liverpool） 进行胚胎注射。
2. 从收获纸中选择前胚层阶段的胚胎，特别是那些浅灰色的胚胎（图 3）。
3. 用湿刷将一些胚胎转移到放置在盖玻片顶部的双面胶带上。当胚胎周围仍然湿润时，将胚胎平行排列，确保它们并排，所有后端都朝前。
4. 正确定位后，让环境稍微干燥以将胚胎固定到位。
5. 在对齐过程中将卤烃油 700 添加到胚胎上以防止干燥。
   注意：添加油时确保胚胎没有被水包围，因为这会导致胚胎漂浮在油中。

8. 胚胎显微注射

注：注射在室温或 18 °C 下进行。 出于实际原因，建议使用 18°C 的温度，因为它会延迟胚胎发育。

1. 使用以下参数设置显微注射器： 补偿压力 （Pc） 300 hPa，注射压力 （Pi） 500 hPa。必要时调整这些条件。
2. 使用微量进样器将 3 μL 混合构建体加载到针中。
3. 将带有对齐胚胎的盖玻片放在显微镜载玻片的顶部（图 3）。将盖玻片和载玻片置于显微镜下进行注射。确保胚胎的后端朝向针头。
4. 将一根针与显微作器一起放入持针器中，并将针头以 10° 角朝向对齐胚胎的后端，保持静止（图 4A）。在显微镜下轻轻打开针头，然后用盖玻片的边缘轻轻触摸它。
   注意：另一种选择是通过用胚胎敲击针头在针头上创建一个小开口。但是，建议使用稍宽的针头开口，因为 Cas9 蛋白的粘性会堵塞针头。
5. 将载玻片移向注射针头（图 5）。

9. 注射胚胎后护理

1. 使用无绒的一次性湿巾去除胚胎周围的油脂。
2. 加入去离子水冲洗胚胎，然后将胚胎移到湿滤纸上。将湿滤纸放在 Karat 9 盎司杯内的湿纸巾上（图 4B 和 图 6A、B）。
3. 将湿棉布放在杯子底部以保持水分（图 6B）。
4. 将注射的胚胎保存在湿滤纸上。

10. 胚胎孵化和 G0 幼虫筛选

1. 注射后至少 4 天，将带有胚胎的滤纸转移到 Sterilite 6 夸脱锅中的约 3 L 去离子水中进行孵化。
   注意：鸡蛋通常在注射后 2 周内孵化效率更高。确保鸡蛋在此期间保持湿润。滤纸不应太湿，因为过多的水分可能会导致胚胎过早孵化。虽然保存时间较长可能会提高孵化率，但不要超过一个月以获得最佳结果。使用脱氧水也可能有助于孵化。
2. 一旦 G0 幼虫孵化，将鱼食与水混合到锅中作为食物。
3. 在第 3 至第 4 龄幼虫阶段筛选 G0 幼虫的荧光标记（图 7）。
4. 根据幼虫的荧光状态分别保持幼虫，荧光阳性和荧光阴性幼虫保存在不同的盘中。

11. 对蛹进行性别分选并异交到野生型

1. 在蚊子化蛹时按性别将注射的蚊子分开，使用生殖叶的大小和性别特异性结构进行识别：
   1. 雄性：体型较小，生殖叶更突出和尖锐，桨更宽（蛹尾端的结构;图 8A 1，A2）。
   2. 雌性：体型较大，生殖叶较小且不太明显，桨较窄（图 8B 1，B2）。
2. 汇集每种性别的荧光阳性或荧光阴性蚊子。
3. 将聚集的蚊子与利物浦毒株的异性蚊子杂交。使用 3：1 到 5：1 的野生型蚊子与 G0 蚊子的比例。
4. 穿越蚊子 4 天。
5. 过境后为雌性提供血餐。

12. G1 筛选

1. 采血后三天，将纸巾放入 Karat 9 盎司杯壁内并加入约 3 盎司去离子水，提供蛋杯。
2. 3-4 天后，收获并孵化 G1 胚胎。筛选 G1 幼虫在 3 至 4 龄期的荧光标记物（图 7）。
3. 收集荧光幼虫，建议插入 HDR。当荧光 G1 个体达到蛹期时，按性别将它们分开，并将每种性别放在不同的笼子中。
4. 将荧光 G1 蚊子与利物浦菌株的异性个体杂交。

13. G1 插入部位确认

1. 提供血粉后，将一小块纸巾放入单个 果蝇 小瓶中并加入 3 mL 去离子水，设置 G1 雌性用于单只雌性卵。
2. 对于敲除突变体：
   1. 产卵后，水分蒸发，纸巾变干，从明显表现出敲除突变的雌性中孵化卵，获得 G2 代。
   2. 收集 G1 母亲成功孵化 G2 后代的尸体并提取 DNA。
   3. 使用 DNA 作为 PCR 模板，扩增覆盖靶位点的序列。确保引物扩增 ~200 bp 的 DNA 片段。设置反应（每个反应包含 12.5 μL 的 2x 预混液、1.25 μL 的 10 μM 正向引物溶液、1.25 μL 的 10 μM 反向引物溶液、9 μL 的超纯水和 1 μL 的模板 DNA [5 ng/μL]）。使用以下 PCR 条件：在 98 °C 下初始变性 30 秒;在 98 °C 下扩增 35 次，在 X °C（引物的理想退火温度）下扩增 10 秒，在 X °C（引物的理想退火温度）下扩增 15-30 秒，在 72 °C 下扩增 10 秒;在 72 °C 下最终延伸 2 分钟;最终在 4 °C 下长期储存。
   4. 通过在 37 °C 下孵育 1 μL 10x 限制性内切缓冲液、0.5 μL 限制性内切酶 1、0.5 μL 内切酶 2、1 μL PCR 片段 （200 ng/mL） 和 7 μL 超纯水的混合物，纯化 PCR 片段并对 PCR 片段进行限制性内切酶消化 30 分钟。
      注：某些限制性内切酶可用于 PCR 混合物，无需事先纯化。
   5. 通过凝胶电泳观察 PCR 片段消化，以确认是否发生切割。
   6. 对未消化的 PCR 片段进行测序以鉴定敲除突变。
   7. 对于 HDR 介导的插入，产卵后：
      1. 收集 G1 母亲的身体并提取 DNA。
      2. 使用 DNA 作为 PCR 模板，扩增覆盖靶位点的序列。
      3. 对扩增的 DNA 片段进行测序，以确认插入的 DNA 盒的完整性。
      4. 孵化鸡蛋并获得 G2 代。

14. 扩展新的 CRISPR 生产线

1. 对于敲除突变体系：
   1. 设置 G2 雌性产卵，每个 G1 有 20 只雌性。每个 G1 代表一行。
   2. 产卵后，以与 G1 相同的方式确认敲除突变。
   3. 继续进行 5 个 G1 细胞系，这些细胞系在 G1 和 G2 中均表现出明确识别的突变。孵化从每条线的 G2 中收集的鸡蛋，产生 G3 代。
   4. 从五个杂交的品系中，选择两个具有明确鉴定的突变和高适应度或所需表型的品系。
   5. 将每个选定品系的 G3 雌性与来自 Liverpool 菌株的雄性杂交。
   6. 每行设置 50 只单身雌性产卵。确认敲除突变，就像之前对 G1 所做的那样。
      注意：增加设置中的女性数量以保持多样性。
   7. 用两条线重复另外两代的程序（图 4J）。
2. 对于新的 HDR 介导的插入行：
   1. 验证 G2 代中是否存在荧光个体。
   2. 用 Liverpool 菌株与每个 G2 个体的 G1 蚊子杂交。每个 G1 个体代表一条线。
   3. 继续进行另外三代异交。不断检查荧光标记并观察每条线的适应度¹⁹ （图 4x）。
   4. 选择一条插入正确且适应性高且具有所需表型的品系。

15. 制作纯合线

1. 对于敲除突变体系：
   1. G6 代：
      1. 孵化 G5 产生的鸡蛋并获得 G6 代。
      2. 在各自品系内交叉 G6 成虫（图 4K 和 图 9A）。
      3. 每行设置 50 个单 G6 雌性产卵，并如前所述孵化鸡蛋（图 9B）。
      4. 收集已成功孵化 G7 后代的 G6 雌性，提取 DNA，并像 G1 一样进行 PCR 和限制酶消化（图 9C）。
         注：此步骤可使用简单且廉价的挤压缓冲液 （SB） 进行 DNA 提取。
         1. 使用手持式研磨机，将一只蚊子浸入 100 μL 的 1x SB（10 mM Tris-HCl pH 8、1 mM EDTA 和 25 mM NaCl）中。加入蛋白酶 K （200 μg/mL），在 37 °C 下孵育 30 分钟，然后在 95 °C 下孵育 2 分钟。以 10,000 × g 离心 5 分钟并收集上清液²⁰。
      5. 通过在凝胶上可视化结果来确认突变。
      6. 丢弃没有突变的雌性产生的卵（图 9D）。
      7. 保留已确认突变的雌性幼虫以建立几个 G7 谱系，并丢弃没有突变的育雏（图 9D）。
   2. G7 代：
      1. 每个 G7 谱系中的雌性和雄性杂交（图 9E）。
      2. 每行设置 10 个单 G7 雌性产卵，并如前所述孵化鸡蛋（图 9F）。
      3. 收集已成功孵化 G7 后代的 G7 雌性，提取 DNA，并进行 PCR 和限制性内切酶消化（图 9G）。
      4. 通过在凝胶上可视化结果来检测两个等位基因或单个等位基因上的敲除突变。
      5. 维持来自确认在两个等位基因中都有敲除的 G7 雌性的幼虫，产生 G8 代（图 9H）。丢弃没有突变的育雏（图 9H）。
         注意：此步骤确保雌性是纯合子。在 G8 中，测试后代的纯合性可以确认父亲是否也是纯合子。
   3. G8 代：
      1. 每个 G7 雌性谱系杂交 G8 成虫（图 9I）。
      2. 随机挑选 5 个 G8 雄性，提取 DNA，并进行 PCR 和限制性内切酶消化（图 9J）。
      3. 提供血粉并从 G8 雌性中孵化卵，这些卵与确认在两个等位基因中都有敲除的 G8 雄性杂交。
      4. 继续 G7 谱系，其中所有检测到的雄性在两个等位基因中都有敲除，表明这些谱系是纯合子。
2. 对于 HDR 介导的插入行：
   1. 孵化 G5 产生的鸡蛋并获得 G6 代。筛选 G6 阶段的幼虫荧光标记物。
   2. 丢弃没有荧光标记的幼虫（图 4习）。
   3. 表现出荧光标记物的杂交蚊子。
   4. 对每一代后续产品继续此过程，直到没有观察到非荧光幼虫。此时，蚊子系将是纯合子。

结果

用于 HDR 同源重组的 gRNA 介导基因靶向的设计和验证
为确保准确靶向所需基因，我们建议选择几个 gRNA，并将 5' 和 3' 同源臂定位在靠近 HDR 介导的同源重组的切割位点附近（图 1A）。例如，我们设计了两个 gRNA 来靶向目标基因起始密码子的两侧，并使用 QF2-Hsp70-OpIE2-ECFP-SV40 盒作为标记，通过 HDR 机制通过 1 kb ?...

讨论

CRISPR-Cas 技术通过促进染色体¹ 的靶标特异性变化，改变了基因组编辑的格局。尽管转座因子对于第一批转基因蚊子的产生至关重要，但它们的插入位点在某种程度上是随机的，并且由于基因组位置效应（即插入位点），货物构建体（启动子 + 基因）的表达可能与实际基因的表达谱不对应，这通常会导致异位表达²¹.在 CRISPR-Cas9 分子剪刀?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Cas9 reaction buffer	PNA Bio	CB01
Benchling software	Benchling	N/A	www.benchling.com
Cas9 dilution buffer	PNA Bio	CB03
Cas9 protein	PNA Bio	CP01-50
DH5α E. coli Competent Cells	New England Biolabs	C2987
Double-sided sticky tape	Scotch Permanent	3136
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-109
Filter papers	GE Healthcare Life Science	1450-042
Fish food	Tetra	B00025Z6YI	goldfish flakes
Flugs	Genesee Scientific	AS273
Fluorescent microscope	Leica Microsystems	M165 FC
Gene fragment	Integrated DNA Technologies	N/A
gRNA	Synthego	N/A
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Injection microscope	Leica Microsystems	DM2000
JM109  E. coli Competent Cells	Zymo Research	T3005
Microinjector	Eppendorf		FemtoJet 4x
Microloader Tips for Filling Femtotips	Eppendorf	E5242956003
Micromanipulator	Eppendorf		TransferMan 4r
Micropipette Pullers	Sutter Instrument	P-2000
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-542-B
Microscope slide	Eisco	12-550-A3
Mouse blood (live mice used for feeding)	University of California	IACUC, Animal Use Protocol #S17187	Used for mosquito blood feeding; details comply with animal ethics protocols
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0491S
PCR Purification Kit	Qiagen	28004
Plasmid Miniprep Kit	Zymo Research	D4036
Quartz filament	Sutter Instruments	QF100-70-10
Transcription Clean-Up Kit	Fisher Scientific	AM1908
Ultra-pure water	Life Technologies	10977-023