Edición del genoma del mosquito Aedes aegypti de la fiebre amarilla mediante CRISPR-Cas9

Resumen

En este trabajo describimos un protocolo detallado para la edición del genoma mediante microinyección embrionaria en el mosquito A. aegypti utilizando la tecnología CRISPR-Cas9.

Resumen

La aparición de la tecnología CRISPR-Cas9 de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente intercaladas ha revolucionado el campo de la ingeniería genética y ha abierto las puertas a la edición precisa del genoma en múltiples especies, incluidos organismos no modelo. En el mosquito Aedes aegypti, se han logrado mutaciones de pérdida de función e inserciones de ADN con esta tecnología. En este trabajo describimos un protocolo detallado para la edición del genoma mediante microinyección embrionaria en el mosquito A. aegypti utilizando la tecnología CRISPR-Cas9, centrándonos tanto en la generación de líneas de knockout como de knockin de genes. En este protocolo, las agujas de cuarzo se llenan con una mezcla de ARN guía, Cas9 recombinante y un plásmido que contiene un casete de ADN que codifica un gen para un marcador fluorescente, si se desea knockin del gen. Los embriones en la etapa de preblastodermo se alinean en una tira de cinta adhesiva de doble cara colocada en un cubreobjetos, que posteriormente se monta en un portaobjetos de vidrio. Con la ayuda de un microinyector, las agujas se insertan suavemente en el extremo posterior de los embriones y se dispensa un pequeño volumen de la mezcla CRISPR. Cuando los embriones eclosionan, las larvas se revisan bajo el visor fluorescente y las pupas se clasifican por sexo y se separan en diferentes jaulas. Una vez que emergen los adultos, estos se cruzan recíprocamente con individuos de tipo salvaje, se alimentan con sangre y se colocan para la puesta de huevos. Una vez que estos huevos eclosionan, las larvas fluorescentes recolectadas representan individuos con inserción estable del casete de ADN en su genoma. Luego, estas larvas se cultivan hasta la etapa adulta, se cruzan con individuos de tipo silvestre y luego se evalúan más a fondo mediante técnicas moleculares para confirmar que la secuencia exacta del casete de ADN está presente en el sitio deseado del genoma del mosquito. Las líneas homocigóticas también se pueden obtener siguiendo el esquema de cruzamiento y el cribado molecular de las mutaciones.

Introducción

La edición precisa del genoma se ha vuelto posiblemente más fácil, pero posible, con el establecimiento de las tecnologías CRISPR-Cas de tijeras moleculares¹. Estas tecnologías aprovechan un mecanismo que el sistema inmunitario procariota utiliza para luchar contra las infecciones por fagos². Entre estos sistemas, las repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) agrupadas, intercaladas regularmente, junto con la nucleasa Cas9 generalmente se basan en 20 ARN de pares de bases, los ARN guía (ARNg), con secuencias homólogas al ADN objetivo, que son seguidas por una secuencia³ de motivo adyacente al protoespaciador NGG (PAM). Los ARNg cargados en el Cas9 guían estas nucleasas con precisión a sitios objetivo específicos en el genoma, lo que desencadena roturas de ADN de doble cadena³.

Las roturas de la doble cadena de ADN inducen los mecanismos de reparación para parchear la doble hélice⁴. Si bien se espera que cualquier reparación del ADN sea precisa, existen mecanismos de reparación del ADN menos precisos que pueden dejar cicatrices en la secuencia y, a su vez, mutaciones de pérdida de^función. Entre los mecanismos de reparación del ADN propensos a errores, la unión de extremos no homólogos (NHEJ) puede causar mutaciones de cambio de marco, incluidas pequeñas deleciones, inserciones y cambios de nucleótidos (SNP), que pueden resultar en una mutación de pérdida de función. El mecanismo de Reparación Dirigida por Homología (HDR), por otro lado, se basa en el cromosoma homólogo como plantilla para copiar la secuencia exacta del alelo no dañado y hacer una reparación perfecta de la secuencia de ADN objetivo⁴.

Sobre la base de este conocimiento, se ha desarrollado la tecnología CRISPR-Cas9 para editar genomas con precisión, posiblemente en cualquier secuencia que contenga un sitio PAM³. En mosquitos, la tecnología CRISPR-Cas9 se ha utilizado para eliminar una variedad de genes, a través de la microinyección embrionaria de una mezcla de Cas9 y ARNg, aprovechando el mecanismo de reparación de NHEJ ^5,6. Una mutagénesis de la línea germinal similar se obtiene con la inyección de la mezcla de ARNg + Cas9 en la hemolinfa de mosquitos hembra adultos⁷. Esta tecnología fue bautizada como ReMOT control y se basa en una versión modificada de un Cas9 marcado con un péptido que es absorbido por los ovarios a través de la endocitosis durante el proceso de desarrollo del óvulo (vitelogénesis)⁷. La introducción de casetes de genes específicos en un genoma solo es posible mediante la microinyección embrionaria de una mezcla de ARNg y Cas9 (o un plásmido que exprese esas moléculas) junto con un plásmido que codifica un^{casete de} ADN 8 deseado. Aprovechando el mecanismo HDR, el plásmido que contiene el casete de ADN de interés flanqueado por secuencias homólogas (500-1.000 pb)^9,10 aguas arriba y aguas abajo del sitio objetivo se utiliza como plantilla para reescribir la rotura de doble cadena, copiando también el casete de ADN en la secuencia diana⁹.

La tecnología CRISPR-Cas9 se ha utilizado para eliminar múltiples genes implicados principalmente en los sistemas sensoriales del mosquito Aedes aegypti¹¹, pero también genes asociados a la fertilidad masculina y la viabilidad femenina (PgSIT) para el control de la población¹². La eliminación de genes objetivo también se ha logrado mediante la incursión de genes que codifican marcadores fluorescentes en las secuencias codificantes de genes específicos^13,14. Esta estrategia tiene la ventaja no solo de inducir mutaciones de cambio de marco, sino también de permitir el uso de luz fluorescente para clasificar los individuos de la nueva línea knockout^13,14. El genoma de A. aegypti también ha sido editado con secuencias de sistemas de expresión binarios, como el sistema Q (QF-QUAS⁾¹¹. La detonación en el gen que codifica el transactivador QF aguas abajo a un promotor de un gen específico asegura una expresión espacio-temporal definida del transactivador^15,16. Una vez que una línea de mosquitos que expresa QF se cruza con otra línea de mosquitos que contiene los sitios de unión (QUAS) para QF, este último se une a ella y desencadena la expresión de genes aguas abajo de la secuencia QUAS^15,16. Este sistema, en general, permite la expresión específica de tejidos y tiempos de dichos genes efectores, que pueden ser marcadores fluorescentes utilizados para la localización celular o la detección de actividad neuronal, e incluso nucleasas Cas9 para interrumpir genes en tejidos específicos (es decir, knockout somático)¹¹.

Teniendo en cuenta toda la información disponible para la transformación genética de A. aegypti , proporcionamos a continuación un protocolo detallado con instrucciones paso a paso para realizar la edición del genoma con el sistema CRISPR-Cas9 mediante microinyección embrionaria. Se discuten las estrategias para generar tanto knockout, a través de mutaciones y deleciones de cambio de marco mediadas por NHEJ, como líneas de knockin, mediante inserciones de casetes de genes mediadas por HDR.

Protocolo

Los detalles relacionados con el equipo y los reactivos utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales. Todos los animales fueron manejados siguiendo la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, según lo recomendado por los Institutos Nacionales de Salud. Los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de UCSD (IACUC, Protocolo de Uso Animal #S17187) y la Autorización de Uso Biológico de UCSD (BUA #R2401).

1. Diseño de gRNAs y plásmidos donantes

1. Para hacer mutantes knockout, diseñe dos ARNg espaciados por ~20-100 pb (Figura 1A).
   1. Diseñe ARNg de 20 pb para CRISPR-Cas9, excluyendo la secuencia PAM (NGG) mediante el uso de una herramienta en línea (Figura 1A), como CHOPCHOP ( https://chopchop.cbu.uib.no/)¹⁷o Benchling (benchling.com) o CRISPOR (http://crispor.gi.ucsc.edu/)¹⁸. Seleccione los ARNg más específicos y libres de fuera del objetivo para los experimentos, según lo sugerido por la herramienta en línea.
   2. Asegúrese de que se incluya un sitio de corte de enzima de restricción eficiente dentro de la secuencia entre los sitios de corte de ARNg (Figura 1A). Incluya un sitio de enzima de restricción entre los sitios de corte de ARNg para permitir una confirmación visual rápida de las ediciones exitosas.
      NOTA: Cuando se produce la deleción, se elimina el sitio de restricción, por lo que la enzima no cortará la secuencia, produciendo una sola banda sin cortar en un gel para confirmar la deleción.
2. En el caso de las inserciones de casetes de genes mediadas por HDR, diseñe múltiples ARNg utilizando las herramientas mencionadas para crear mutantes knockout y seleccione el más eficaz después de una evaluación posterior.
3. Diseñar plásmidos donantes para la reparación dirigida por homología (HDR) que contengan brazos de homología del sitio diana, la secuencia de ADN de carga, un marcador fluorescente, el origen de la replicación y un gen de resistencia a los antibióticos (Figura 1B).
   1. Elija los brazos de homología de las regiones aguas arriba y aguas abajo del sitio objetivo, cada uno de los cuales abarca 500-1.000 pb¹⁰ (Figura 1B).
   2. Seleccione la secuencia de carga, que puede incluir un marcador fluorescente, un gen de interés o un elemento regulador (por ejemplo, QF2).
   3. Selecciona un marcador fluorescente. Los marcadores fluorescentes comunes utilizados para A. aegypti se incluyen en un casete de ADN que contiene un promotor, un gen codificante de marcadores fluorescentes y una secuencia UTR 3'. Consulte la discusión para obtener más detalles.

2. Preparación de la mezcla inyectable

1. Diluir la proteína Cas9 con el tampón de dilución Cas9 a 1 μg/μL.
   NOTA: No descongele ni congele Cas9 más de 2 veces. Es recomendable hacer alícuotas de la proteína Cas9.
2. Compre los ARNg o prodúzcalos internamente.
   NOTA: Para la producción interna, utilice prácticas estándar de descontaminación de ARN y materiales libres de ARNasa.
   1. Diseñe de 4 a 6 ARNg y elija los dos mejores ARNg para la inyección (consulte el ensayo de escisión in vitro a continuación).
   2. Diseñe un cebador directo que incluya la secuencia promotora T7 aguas arriba de la secuencia de ARNg. Utilice el cebador inverso de ARNg universal para las reacciones de PCR no molde de PCR, como se describe a continuación. La base de la secuencia superpuesta se empareja con la secuencia correspondiente en el cebador inverso universal (negrita y subrayado), creando una plantilla para que la ADN polimerasa amplifique sus secuencias.
      NOTA: Para estas reacciones de PCR, el cebador directo debe contener el promotor T7 (negrita), seguido de dos guaninas (importantes para el inicio de la transcripción a través de la ARN polimerasa T7), la secuencia de 20 nucleótidos del ARNg (N₂₀; sin la secuencia PAM) y la secuencia superpuesta del cebador (subrayado).
      Avance del cebador: 5'- GAAATTAATACGACTCACTATAGGN₂₀ GTTTTAGAGCTAGAAATAGC- 3'
      Imprimación inversa: 5''-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTT CAAGTTGATAACGGACTAGC
      CTTATT TTAACTT GCTATTTCTAGCTCTAAAAC - 3'
   3. Sintetizar la plantilla de ADN mediante PCR no plantilla. Configure múltiples reacciones (cada una con 12,5 μL de la mezcla maestra 2x, 1,25 μL de la solución de 10 μM de cebador directo, 1,25 μL de la solución de 10 μM de cebador inverso y 10 μL de agua ultrapura) para que haya suficiente producto de PCR (300 ng) disponible para la reacción de transcripción in vitro . Utilice las siguientes condiciones de PCR: desnaturalización inicial durante 30 s a 98 °C; 35 ciclos de amplificación durante 10 s a 98 °C, 10 s a 62 °C y 10 s a 72 °C; extensión final a 72 °C durante 2 min; y almacenamiento a 4 °C.
   4. Confirmar la amplificación de un solo fragmento de ADN (122 pares de bases) en un gel de agarosa (2%).
   5. Limpie la plantilla de PCR con un kit de purificación de PCR, siguiendo las recomendaciones del fabricante.
   6. Realice una reacción de transcripción in vitro con un kit de transcripción T7. Mezcle 2 μL de tampón de reacción 10x, 2 μL de nucleótidos (ATP, CTP, UTP y GTP), 2 μL de ARN polimerasa T7, 3 μL del ADN molde (100 ng/μL) y 5 μL de agua ultrapura. Incubar la mezcla a 37 °C durante al menos 2 h (no más de 16 h) hasta toda la noche (12 h).
      NOTA: En esta reacción, la ARN polimerasa T7 se une al promotor T7 incluido en la secuencia directa del cebador, lo que conduce a la transcripción del ARNg.
   7. Tratar la reacción de transcripción con DNasa añadiendo 1 μL de DNasa (mezclar bien) e incubar a 37 °C durante 15 min.
   8. Purifique los sgRNAs sintetizados con un kit de limpieza de transcripción siguiendo las recomendaciones del fabricante.
   9. Realizar un ensayo de escisión in vitro para evaluar la eficiencia de corte de los ARNg seleccionados (Figura 1C).
      1. Diseñe cebadores para amplificar un fragmento de ADN (500-1.000 pb) que flanquea el sitio de corte del ARNg.
      2. Configure las reacciones de PCR de la siguiente manera: 12,5 μL de la mezcla maestra 2x, 1,25 μL de la solución de 10 μM de cebador directo, 1,25 μL de la solución 10 μM de cebador inverso, 9 μL de agua ultrapura y 1 μL de 5 ng/μL de ADN molde.
      3. Utilice las siguientes condiciones de PCR: condiciones: desnaturalización inicial durante 30 s a 98 °C; 35 ciclos de amplificación durante 10 s a 98 °C, 15-30 s a X °C (temperatura ideal de recocido para imprimaciones) y 35 s a 72 °C; extensión final a 72 °C durante 2 min; y almacenamiento final a largo plazo a 4 °C.
      4. Consulte las pautas del fabricante para conocer las mejores temperaturas de amplificación y el intervalo de tiempo. Agrupar al menos cinco reacciones o aumentar los volúmenes de los reactivos para obtener suficiente producto de PCR (1,5-2 μg) después de la limpieza de PCR (banda única) o la purificación de la banda de PCR en gel de agarosa.
      5. Configure las reacciones de escisión de Cas9 con Cas9 recombinante incubando la siguiente mezcla a 37 °C durante 1 h: 1 μL de tampón de reacción 10x Cas9, 0,35 μL de Cas9 recombinante (1 μg/μL), 1 μL de ARNg (100 ng/μL), 6,65 μL de agua ultrapura y 1 μL de 300 ng/μL de ADN moltal.
      6. Establezca una reacción de control negativo sin ningún ARNg.
      7. Compruebe la eficacia de la escisión mediante la ejecución de reacciones en un gel de agarosa (1,5-2,0%; Figura 1C).

3. Montaje del plásmido donante

1. PCR-amplifica los brazos de homología a partir del ADN genómico de A. aegypti.
   1. Para el diseño del cebador, consulte las pautas del fabricante del kit de clonación. Utilice una herramienta en línea (p. ej., Benchling), que proporcione soporte para el diseño y ensamblaje de plásmidos utilizando diferentes estrategias de clonación (p. ej., Gibson, Golden Gate y clonación basada en enzimas de restricción).
   2. Amplifique la secuencia de carga del ADN genómico de A. aegypti o solicite un fragmento de gen sintetizado comercialmente.
   3. Amplifique los marcadores fluorescentes de plásmidos internamente.
2. Ligar fragmentos de ADN de los pasos 3.1.1 a 3.1.3 en la columna vertebral de un plásmido existente mediante el ensamblaje de Gibson. Incubar una mezcla de 10 μL de mezcla maestra 2x, X μL de todos los fragmentos de ADN, 10-X μL de agua ultrapura a 50 °C durante 1 h.
   NOTA: Consulte las directrices del fabricante para calcular la proporción ideal de insertos y la columna vertebral del plásmido.
   1. Calcular las concentraciones de cada fragmento de clonación en picos moles: pmols = (peso en ng) × 1.000/(pares de bases × 650 daltons).
   2. Utilice 50-100 ng de columna vertebral de plásmido y un exceso de molar de 2-3 veces de cada inserto.
   3. Si ensambla 2-3 fragmentos, agregue 0.02-0.5 pmols de cada fragmento en la reacción de Gibson. Si ensambla 4-6 fragmentos, agregue 0.2-1.0 pmols de cada uno.
3. Utilice 3-5 μL de la reacción de ensamblaje de Gibson para transformar las células competentes de E. coli JM109.
   NOTA: JM109 fue elegido para el ensamblaje de Gibson debido a su genotipo recA- , que reduce los eventos de recombinación indeseables y evita el arrastre de nucleasas durante la recolección de células, asegurando la integridad de los fragmentos de ADN ensamblados
   Para plásmidos de más de 10 kb, recomendamos la transformación de las células competentes para DH5α utilizando el protocolo ampliado, siguiendo las recomendaciones del fabricante.
4. Expanda las bacterias transformadas y purifique el plásmido con un kit de minipreparación.
5. Para confirmar el ensamblaje correcto del plásmido, ejecute una digestión de la enzima de restricción diagnóstica con el ADN del plásmido purificado y visualice mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 1D, E).
   NOTA: Sugerimos el uso de una herramienta en línea para la selección de un par de enzimas de restricción que pueden cortar el plásmido en un solo sitio. Software como Benchling tiene una herramienta incorporada que realiza la digestión virtual de secuencias de plásmidos con las enzimas de restricción seleccionadas, mostrando el patrón de bandas de ADN esperado en un gel de electroforesis virtual (Figura 1D).
   1. Llevar a cabo la digestión de la enzima de restricción de plásmidos. Incubar una mezcla de 1 μL de tampón de digestión de restricción 10x, 0,5 μL de enzima de restricción 1, 0,5 μL de enzima de restricción 2, 1 μL de ADN plasmídico (300 ng/mL) y 7 μL de agua ultrapura a 37 °C durante 2 h.
   2. Ejecute las reacciones de digestión de restricción en un gel de agarosa (1,5%).
      NOTA: El patrón de bandas de ADN (Figura 1E) debe parecerse al patrón de bandas de resumen virtual (Figura 1D). Los plásmidos también se pueden enviar para la secuenciación de plásmidos completos si el servicio está disponible.
6. Cultive el clon del plásmido en 150 mL de medio LB.
7. Realizar maxiprep plásmido, siguiendo las indicaciones del fabricante.
8. Suspenda el plásmido en agua ultrapura.

4. Mezclar la construcción de inyección

NOTA: Los rangos de concentración final sugeridos para cada constructo se proporcionan en la Tabla 1. Comience con una proporción de 2:1:2 (ng Cas9: ng sgRNA: ng plásmido donante) y ajústela según sea necesario para optimizar la eficiencia del HDR. El seguimiento de los resultados ayudará a identificar la combinación más eficaz.

1. Para hacer mutantes nocauts,
   1. Diluir la alícuota de la proteína Cas9 a la concentración deseada utilizando el tampón de dilución Cas9 y diluir la alícuota de ARNg con agua ultrapura.
   2. Premezcle la proteína Cas9 con cada ARNg para formar un complejo de ribonucleoproteína (RNP). Combine las soluciones premezcladas.
2. En el caso de las inserciones de casetes de genes mediadas por HDR,
   1. Diluya y mezcle la proteína Cas9 y los ARNg como se sugiere para hacer mutantes knockout.
   2. Diluir el plásmido donante con agua ultrapura.
   3. Combina todas las construcciones.

5. Extracción y carga de agujas de microinyección

1. Utilice filamento de cuarzo para tirar de las agujas de inyección (Figura 2). Asegúrate de que el filamento tenga 10 cm de largo, con un diámetro exterior de 1 mm y un diámetro interior de 0,7 mm.
2. Tire de las agujas con un extractor de micropipetas láser con uno de los dos programas siguientes:
   Programa 1: Calor 805, Filamento 4, Velocidad 50, Retardo 145, Tirón 145
   Programa 2: Calor 650, Filamento 4, Velocidad 40, Retardo 150, Tirón 156
   NOTA: El programa 1 da como resultado una punta de aguja más delgada pero más larga, lo que lo hace adecuado para inyecciones con construcciones de concentración más bajas, donde una punta más fina es beneficiosa para la precisión. El programa 2 produce una punta de aguja más corta pero más gruesa, ideal para inyecciones de mayor concentración, ya que la construcción es más gruesa y requiere una aguja más resistente.

6. Recolección de embriones

1. Prepare un aspirador eléctrico o manual para recolectar mosquitos y use viales de plástico para la recolección y recolección de embriones.
2. Humedece los papeles de filtro circulares blancos y colócalos en la pared interior o encima de algodón húmedo en el colector.
3. Coloque de 5 a 10 mosquitos hembra que fueron alimentados con sangre hace 5 a 10 días en el colector. Coloque el colector en la oscuridad durante 45 min.
4. Saca los papeles de filtro para la recolección de embriones.

7. Alineación de embriones

1. Utilice una cepa de tipo salvaje (Liverpool) de A. aegypti para la inyección de embriones.
2. Seleccione los embriones en etapa de preblastodermo, particularmente aquellos que son de color gris claro, del papel de recolección (Figura 3).
3. Transfiera algunos embriones con un cepillo húmedo a la cinta adhesiva de doble cara colocada encima de un cubreobjetos. Alinee los embriones en paralelo mientras sus alrededores aún están húmedos, asegurándose de que estén uno al lado del otro, con todos los extremos posteriores mirando hacia el frente.
4. Una vez colocado correctamente, deje que el entorno se seque ligeramente para asegurar los embriones en su lugar.
5. Agregue aceite de halocarbono 700 a los embriones durante la alineación para evitar la desecación.
   NOTA: Asegúrese de que los embriones no estén rodeados de agua al agregar el aceite, ya que esto haría que los embriones floten en el aceite.

8. Microinyección de embriones

NOTA: La inyección se realiza a temperatura ambiente o a 18 °C. La temperatura de 18°C se recomienda por razones prácticas, ya que retrasa el desarrollo embrionario.

1. Configure un microinyector con los siguientes parámetros: presión de compensación (Pc) 300 hPa, presión de inyección (Pi) 500 hPa. Ajuste estas condiciones siempre que sea necesario.
2. Cargue 3 μL de la construcción mezclada en una aguja utilizando un microcargador.
3. Coloque el cubreobjetos con los embriones alineados encima de un portaobjetos de microscopio (Figura 3). Coloque el cubreobjetos y deslícelo bajo el microscopio para la inyección. Asegúrate de que el extremo posterior del embrión esté colocado hacia la aguja.
4. Coloque una aguja en un soporte de agujas junto con un micromanipulador y coloque la aguja en un ángulo de 10° hacia el extremo posterior de los embriones alineados, manteniéndola inmóvil (Figura 4A). Abra suavemente la aguja bajo un microscopio y tóquela ligeramente con el borde de un cubreobjetos.
   NOTA: Otra opción es crear una pequeña abertura en la aguja golpeándola con un embrión. Sin embargo, se recomienda una apertura de la aguja un poco más ancha, ya que la pegajosidad de la proteína Cas9 puede obstruir la aguja.
5. Mueva el vaso deslizante hacia la aguja para la inyección (Figura 5).

9. Cuidados posteriores al embrión inyectado

1. Use toallitas desechables sin pelusa para eliminar el aceite que rodea a los embriones.
2. Agregue agua desionizada para enjuagar los embriones y mueva los embriones sobre un papel de filtro húmedo. Coloque el papel de filtro húmedo en un pañuelo húmedo dentro de tazas de Karat de 9 oz (Figura 4B y Figura 6A,B).
3. Coloque algodón húmedo en el fondo de la taza para mantener la humedad (Figura 6B).
4. Conservar los embriones inyectados en papel de filtro húmedo.

10. Eclosión de embriones y cribado de larvas G0

1. Al menos 4 días después de la inyección, transfiera el papel de filtro con embriones a aproximadamente 3 L de agua desionizada en bandejas Sterilite de 6 cuartos para incubar.
   NOTA: Los huevos suelen eclosionar de manera más eficiente dentro de las 2 semanas posteriores a la inyección. Asegúrese de que los huevos permanezcan húmedos durante este período. El papel de filtro no debe estar demasiado mojado, ya que la humedad excesiva puede provocar una eclosión temprana de los embriones. Si bien una conservación más prolongada puede mejorar las tasas de eclosión, no exceda un mes para obtener resultados óptimos. El uso de agua desoxigenada también puede ayudar con la eclosión.
2. Una vez que las larvas G0 eclosionen, agregue comida para peces mezclada con agua a la sartén como alimento.
3. Examinar las larvas G0 para detectar el marcador fluorescente en la etapa larvaria del 3º al 4º estadio (Figura 7).
4. Mantenga las larvas por separado en función de su estado fluorescente, con las larvas fluorescentes positivas y fluorescentes negativas en bandejas separadas.

11. Clasificación por sexo de las pupas y cruzamiento con el tipo salvaje

1. Separe los mosquitos inyectados por sexo cuando pupan, utilizando el tamaño y las estructuras específicas del sexo en el lóbulo genital para la identificación:
   1. Machos: Tamaño más pequeño, un lóbulo genital más prominente y puntiagudo, y paletas más anchas (estructuras en el extremo de la cola de las pupas; Figura 8A 1,A2).
   2. Hembras: Mayor tamaño, lóbulo genital más pequeño y menos pronunciado, y paletas más estrechas (Figura 8B 1,B2).
2. Piscina de mosquitos fluorescentes positivos o fluorescentes negativos de cada sexo.
3. Cruza los mosquitos acumulados con mosquitos del sexo opuesto a la cepa Liverpool. Use una proporción de 3:1 a 5:1 de mosquito silvestre por mosquito G0.
4. Cruza los mosquitos durante 4 días.
5. Proporcione a las hembras una comida de sangre después de cruzar.

12. Cribado G1

1. Tres días después de la alimentación con sangre, proporcione hueveras colocando una toalla de papel dentro de la pared de tazas de Karat de 9 onzas y agregando alrededor de 3 onzas de agua desionizada.
2. Después de 3-4 días, cosecha y eclosiona los embriones G1. Examinar las larvas G1 para detectar el marcador fluorescente en las etapas 3 a 4 (Figura 7).
3. Recoja las larvas fluorescentes, lo que sugiere una inserción de HDR. Cuando los individuos fluorescentes G1 alcancen la etapa de pupa, sepárelos por sexo y coloque a cada sexo en jaulas separadas.
4. Supere a los mosquitos fluorescentes G1 a individuos del sexo opuesto a la cepa Liverpool.

13. Confirmación del sitio de inserción G1

1. Después de proporcionar la harina de sangre, prepare las hembras G1 para la puesta de huevos de una sola hembra colocando un pequeño trozo de toalla de papel en viales individuales de Drosophila y agregando 3 ml de agua desionizada.
2. Para los mutantes knockout:
   1. Después de la puesta de huevos, el agua se evapora y la toalla de papel se seca, eclosiona los huevos de las hembras que claramente exhiben mutaciones knockout y obtiene la generación G2.
   2. Recoja el cuerpo de las madres G1 que hayan incubado con éxito la descendencia G2 y extraiga el ADN.
   3. Utilice el ADN como plantilla para la PCR con el fin de amplificar la secuencia que cubre el sitio objetivo. Asegúrese de que los cebadores amplifiquen un fragmento de ADN de ~ 200 pb. Configure las reacciones (cada una contiene 12,5 μL de la mezcla maestra 2x, 1,25 μL de la solución de 10 μM de cebador directo, 1,25 μL de la solución de 10 μM de cebador inverso, 9 μL de agua ultrapura y 1 μL de ADN molde [5 ng/μL]). Utilice las siguientes condiciones de PCR: desnaturalización inicial durante 30 s a 98 °C; 35 ciclos de amplificación durante 10 s a 98 °C, 15-30 s a X °C (temperatura ideal de recocido de los cebadores) y 10 s a 72 °C; extensión final a 72 °C durante 2 min; y almacenamiento final a largo plazo a 4 °C.
   4. Purifique los fragmentos de PCR y realice la digestión de los fragmentos de PCR mediante la incubación de una mezcla de 1 μL de tampón de digestión de restricción 10x, 0,5 μL de enzima de restricción 1, 0,5 μL de enzima de restricción 2, 1 μL de fragmento de PCR (200 ng/mL) y 7 μL de agua ultrapura a 37 °C durante 30 min.
      NOTA: Ciertas enzimas de restricción se pueden utilizar en la mezcla de PCR sin purificación previa.
   5. Visualice la digestión del fragmento de PCR mediante electroforesis en gel para confirmar si se ha producido un clivaje.
   6. Secuenciar el fragmento de PCR no digerido para identificar las mutaciones knockout.
   7. Para inserciones mediadas por HDR, después de la puesta de huevos:
      1. Recoge el cuerpo de las madres G1 y extrae el ADN.
      2. Utilice el ADN como plantilla para la PCR con el fin de amplificar la secuencia que cubre el sitio objetivo.
      3. Realice la secuenciación del fragmento de ADN amplificado para confirmar la integridad del casete de ADN insertado.
      4. Eclosiona el huevo y obtén la generación G2.

14. Expansión de las nuevas líneas CRISPR

1. Para líneas mutantes knockout:
   1. Configure hembras G2 para la puesta de huevos, con 20 hembras por G1. Cada G1 representa una línea.
   2. Después de la puesta de huevos, confirme las mutaciones knockout de la misma manera que para G1.
   3. Proceda con cinco líneas G1 que exhiben mutaciones claramente identificadas tanto en G1 como en G2. Eclosionan los huevos recolectados de G2 de cada línea, dando lugar a la generación G3.
   4. De las cinco líneas cruzadas, seleccione dos líneas con mutaciones claramente identificadas y alta aptitud o el fenotipo deseado.
   5. Cruza hembras G3 de cada línea seleccionada con machos de la cepa Liverpool.
   6. Prepare 50 hembras individuales para la puesta de huevos de cada línea. Confirme las mutaciones knockout como se hizo anteriormente para G1.
      NOTA: Aumente el número de hembras en la configuración para mantener la diversidad.
   7. Repita los procedimientos para dos generaciones adicionales con las dos líneas (Figura 4J).
2. Para nuevas líneas de inserciones mediadas por HDR:
   1. Verificar la presencia de individuos fluorescentes en la generación G2.
   2. Cruza los mosquitos G2, de cada individuo G1, con la cepa de Liverpool. Cada individuo G1 representa una línea.
   3. Proceda con tres generaciones más de cruzamiento. Revise continuamente el marcador fluorescente y observe la aptitud¹⁹ de cada línea (Figura 4x).
   4. Seleccione una línea con inserciones correctas y alta aptitud y el fenotipo deseado.

15. Haz líneas homocigóticas

1. Para líneas mutantes knockout:
   1. Generación G6:
      1. Eclosiona los huevos producidos por G5 y obtén la generación G6.
      2. Cruza adultos G6 dentro de sus respectivas líneas (Figura 4K y Figura 9A).
      3. Coloque 50 hembras G6 individuales para la puesta de huevos por línea, y eclodie los huevos como se describió anteriormente (Figura 9B).
      4. Recoja las hembras G6 que han incubado con éxito la descendencia G7, extraiga el ADN y realice la PCR y la digestión de la enzima de restricción como se hace para G1 (Figura 9C).
         NOTA: En este paso se puede utilizar un tampón de aplastamiento (SB) sencillo y económico para la extracción de ADN.
         1. Con un molinillo de mano, macere un solo mosquito en 100 μL de 1x SB (10 mM de Tris-HCl pH 8, 1 mM de EDTA y 25 mM de NaCl). Añadir proteinasa K (200 μg/mL) e incubar a 37 °C durante 30 min, seguido de 95 °C durante 2 min. Girar a 10.000 × g durante 5 min y recoger el sobrenadante²⁰.
      5. Confirme la mutación visualizando los resultados en un gel.
      6. Deseche los huevos producidos por las hembras sin mutaciones (Figura 9D).
      7. Mantener las larvas de hembras con mutaciones confirmadas para establecer varios linajes G7 y descartar las crías sin mutaciones (Figura 9D).
   2. Generación G7:
      1. Cruza hembras y machos dentro de cada linaje G7 (Figura 9E).
      2. Coloque 10 hembras G7 individuales para la puesta de huevos por línea y eclosione los huevos como se describió anteriormente (Figura 9F).
      3. Recoja las hembras G7 que han incubado con éxito crías G7, extraiga el ADN y realice la PCR y la digestión con enzimas de restricción (Figura 9G).
      4. Detecte mutaciones knockout en ambos alelos o en un solo alelo visualizando los resultados en un gel.
      5. Mantener las larvas de las hembras G7 confirmadas con knockouts en ambos alelos, produciendo la generación G8 (Figura 9H). Deseche las crías sin mutaciones (Figura 9H).
         NOTA: Este paso asegura que las hembras sean homocigóticas. En G8, las pruebas de homocigosis de la progenie confirman si los padres también son homocigotos".
   3. Generación G8:
      1. Cruza adultos G8 por cada linaje femenino G7 (Figura 9I).
      2. Elija al azar cinco machos G8, extraiga el ADN y realice la PCR y la digestión de la enzima de restricción (Figura 9J).
      3. Proporcione una comida de sangre e incube los huevos de las hembras G8 que se cruzaron con machos G8 confirmados con knockouts en ambos alelos.
      4. Continúe con los linajes G7 donde todos los machos detectados tienen knockouts en ambos alelos, lo que indica que estos linajes son homocigotos.
2. Para líneas de inserciones mediadas por HDR:
   1. Eclosiona los huevos producidos por G5 y obtén la generación G6. Examinar las larvas en la etapa G6 para detectar marcadores fluorescentes.
   2. Deseche las larvas sin marcadores fluorescentes (Figura 4xi).
   3. Cruza mosquitos que exhiben marcadores fluorescentes.
   4. Continúe este procedimiento para cada generación subsiguiente hasta que no se observe ninguna larva no fluorescente. En este punto, la línea de mosquitos será homocigótica.

Resultados

Diseño y validación de la segmentación génica mediada por ARNg para la recombinación de homología HDR
Para garantizar que el gen deseado se dirija con precisión, recomendamos seleccionar un par de ARNg y colocar los brazos de homología 5' y 3' cerca del sitio de corte para la recombinación homóloga mediada por HDR (Figura 1A). Por ejemplo, diseñamos dos ARNg para dirigirse a ambos lados del cod?...

Discusión

La tecnología CRISPR-Cas ha cambiado el panorama de la edición del genoma al promover cambios específicos en los cromosomas¹. A pesar de que los elementos transponibles fueron esenciales para la generación de los primeros mosquitos transgénicos, sus sitios de inserción son algo aleatorios, y la expresión del constructo de carga (promotor + gen) puede no corresponder al perfil de expresión del gen real debido a un efecto posicional del genoma (es decir, sit...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Cas9 reaction buffer	PNA Bio	CB01
Benchling software	Benchling	N/A	www.benchling.com
Cas9 dilution buffer	PNA Bio	CB03
Cas9 protein	PNA Bio	CP01-50
DH5α E. coli Competent Cells	New England Biolabs	C2987
Double-sided sticky tape	Scotch Permanent	3136
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-109
Filter papers	GE Healthcare Life Science	1450-042
Fish food	Tetra	B00025Z6YI	goldfish flakes
Flugs	Genesee Scientific	AS273
Fluorescent microscope	Leica Microsystems	M165 FC
Gene fragment	Integrated DNA Technologies	N/A
gRNA	Synthego	N/A
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Injection microscope	Leica Microsystems	DM2000
JM109  E. coli Competent Cells	Zymo Research	T3005
Microinjector	Eppendorf		FemtoJet 4x
Microloader Tips for Filling Femtotips	Eppendorf	E5242956003
Micromanipulator	Eppendorf		TransferMan 4r
Micropipette Pullers	Sutter Instrument	P-2000
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-542-B
Microscope slide	Eisco	12-550-A3
Mouse blood (live mice used for feeding)	University of California	IACUC, Animal Use Protocol #S17187	Used for mosquito blood feeding; details comply with animal ethics protocols
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0491S
PCR Purification Kit	Qiagen	28004
Plasmid Miniprep Kit	Zymo Research	D4036
Quartz filament	Sutter Instruments	QF100-70-10
Transcription Clean-Up Kit	Fisher Scientific	AM1908
Ultra-pure water	Life Technologies	10977-023