Édition du génome du moustique de la fièvre jaune Aedes aegypti à l’aide de CRISPR-Cas9

Résumé

Nous décrivons ici un protocole détaillé d’édition du génome par micro-injection embryonnaire chez le moustique A. aegypti à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9.

Résumé

L’émergence de la technologie CRISPR-Cas9 a révolutionné le domaine du génie génétique et ouvert les portes à l’édition précise du génome chez de multiples espèces, y compris des organismes non modèles. Chez le moustique Aedes aegypti, des mutations de perte de fonction et des insertions d’ADN ont été réalisées avec cette technologie. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour l’édition du génome par micro-injection embryonnaire chez le moustique A. aegypti à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9, en se concentrant à la fois sur la génération de lignées de knock-out et de knockin. Dans ce protocole, les aiguilles de quartz sont remplies d’un mélange d’ARN guide, de Cas9 recombinant et d’un plasmide contenant une cassette d’ADN codant pour un gène pour un marqueur fluorescent, si l’on souhaite une knock-in génique. Les embryons au stade préblastoderme sont alignés sur une bande de ruban adhésif double face placée sur une lamelle, qui est ensuite montée sur une lame de verre. À l’aide d’un micro-injecteur, les aiguilles sont insérées doucement dans l’extrémité postérieure des embryons et un petit volume du mélange CRISPR est distribué. Lorsque les embryons éclosent, les larves sont vérifiées sous la lunette fluorescente, et les pupes sont triées par sexe et séparées dans différentes cages. Une fois que les adultes émergent, ceux-ci sont croisés réciproquement avec des individus de type sauvage, nourris au sang et placés pour la ponte. Une fois ces œufs éclos, les larves fluorescentes collectées représentent des individus avec une insertion stable de la cassette d’ADN dans leur génome. Ces larves sont ensuite cultivées jusqu’au stade adulte, croisées avec des individus de type sauvage, puis évaluées davantage à l’aide de techniques moléculaires pour confirmer que la séquence exacte de la cassette d’ADN est présente au site souhaité du génome du moustique. Des lignées homozygotes peuvent également être obtenues en suivant le pipeline fourni de schéma de croisement et de criblage moléculaire des mutations.

Introduction

L’édition précise du génome est sans doute devenue plus facile, mais possible, avec la mise en place des technologies CRISPR-Cas des ciseaux moléculaires¹. Ces technologies tirent parti d’un mécanisme que le système immunitaire procaryote utilise pour lutter contre les phagues². Parmi ces systèmes, les répétitions palindromiques courtes (CRISPR) groupées, régulièrement intercalées et la nucléase Cas9 reposent généralement sur 20 ARN à paires de bases, les ARN guides (ARNg), avec des séquences homologues à l’ADN ciblé, qui sont suivies d’un motif adjacent au protospacer NGG (PAM) séquence³. Les ARNg chargés sur le Cas9 guident précisément ces nucléases vers des sites cibles spécifiques du génome, déclenchant des cassures de l’ADN double brin³.

Les cassures double brin de l’ADN induisent les mécanismes de réparation pour patcher la double hélice⁴. Alors que toute réparation de l’ADN est censée être précise, il existe des mécanismes de réparation de l’ADN moins précis qui peuvent laisser des cicatrices de séquence et, à leur tour, des mutations de perte de fonction⁴. Parmi les mécanismes de réparation de l’ADN sujets aux erreurs, le NHEJ (Non-Homologous End-Joindre) peut provoquer des mutations par décalage de trame, y compris de petites délétions et insertions et des modifications nucléotidiques (SNP), qui peuvent entraîner une mutation de perte de fonction. Le mécanisme de réparation dirigée par homologie (HDR), quant à lui, s’appuie sur le chromosome homologue comme modèle pour copier la séquence exacte de l’allèle non endommagé et effectuer une réparation parfaite de la séquence d’ADN ciblée⁴.

Sur la base de ces connaissances, la technologie CRISPR-Cas9 a été développée pour modifier précisément les génomes, sans doute au niveau de n’importe quelle séquence contenant un site PAM³. Chez les moustiques, la technologie CRISPR-Cas9 a été utilisée pour éliminer une variété de gènes, par micro-injection embryonnaire d’un mélange de Cas9 et d’ARNg, en profitant du mécanisme de réparation NHEJ ^5,6. Une mutagenèse germinale similaire est obtenue avec l’injection d’un mélange ARNg + Cas9 dans l’hémolymphe de moustiques femelles adultes⁷. Cette technologie a été inventée sous le nom de contrôle ReMOT et repose sur une version modifiée d’un Cas9 marqué avec un peptide qui est absorbé par les ovaires par endocytose pendant le processus de développement de l’ovule (vitellogenèse)⁷. L’insertion de cassettes de gènes spécifiques dans un génome n’est possible que par micro-injection embryonnaire d’un mélange d’ARNg et de Cas9 (ou d’un plasmide exprimant ces molécules) ainsi que d’un plasmide codant pour une cassette d’ADN^{souhaitée 8}. Tirant parti du mécanisme HDR, le plasmide contenant la cassette d’ADN d’intérêt flanquée de séquences homologues (500-1 000 bp)^9,10 en amont et en aval du site cible est utilisé comme modèle pour réécrire la cassure double brin, en copiant également la cassette d’ADN dans la séquence cible⁹.

La technologie CRISPR-Cas9 a été utilisée pour éliminer plusieurs gènes principalement impliqués dans les systèmes sensoriels du moustique Aedes aegypti¹¹, mais aussi des gènes associés à la fertilité masculine et à la viabilité féminine (PgSIT) pour le contrôle de la population¹². L’inactivation des gènes cibles a également été accomplie en introduisant des gènes codant pour des marqueurs fluorescents dans les séquences codantes de gènes spécifiques^13,14. Cette stratégie a l’avantage non seulement d’induire des mutations de décalage de cadre mais aussi de permettre l’utilisation de la lumière fluorescente pour trier les individus de la nouvelle lignée knock-out^13,14. Le génome d’A. aegypti a également été modifié avec des séquences de systèmes d’expression binaires, tels que le système Q (QF-QUAS)¹¹. L’insertion du gène codant pour le transactivateur QF en aval vers un promoteur d’un gène spécifique assure une expression spatio-temporelle définie du transactivateur ^15,16. Une fois qu’une lignée de moustique exprimant QF est croisée avec une autre lignée de moustiques contenant les sites de liaison (QUAS) pour QF, ce dernier se lie à celle-ci et déclenche l’expression des gènes en aval de la séquence QUAS^15,16. Dans l’ensemble, ce système permet l’expression tissulaire et temporelle de ces gènes effecteurs, qui peuvent être des marqueurs fluorescents utilisés pour la localisation cellulaire ou la détection de l’activité neuronale, et même des nucléases Cas9 pour perturber les gènes dans des tissus spécifiques (c’est-à-dire l’inactivation somatique⁾¹¹.

Compte tenu de toutes les informations disponibles pour la transformation génétique d’A. aegypti , nous fournissons ici un protocole détaillé avec des instructions étape par étape pour effectuer l’édition du génome avec le système CRISPR-Cas9 par micro-injection embryonnaire. Les stratégies pour générer à la fois l’inactivation, par le biais de mutations et de délétions par décalage de cadre médiées par NHEJ, et les lignes d’knockin, par l’insertion de cassettes de gènes médiées par HDR, sont discutées.

Protocole

Les détails relatifs à l’équipement et aux réactifs utilisés dans ce protocole sont énumérés dans la table des matières. Tous les animaux ont été manipulés conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, tel que recommandé par les National Institutes of Health. Les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de l’UCSD sur le soin et l’utilisation des animaux (IACUC, Animal Use Protocol #S17187) et l’Autorisation d’utilisation biologique de l’UCSD (BUA #R2401).

1. Conception des ARNg et du plasmide donneur

1. Pour fabriquer des mutants knock-out, concevez deux ARNg espacés de ~20 à 100 pb (Figure 1A).
   1. Concevez des ARNg de 20 pb pour CRISPR-Cas9, à l’exclusion de la séquence PAM (NGG) à l’aide d’un outil en ligne (Figure 1A), tel que CHOPCHOP ( https://chopchop.cbu.uib.no/)¹⁷ou Benchling (benchling.com) ou CRISPOR (http://crispor.gi.ucsc.edu/)¹⁸. Sélectionnez les ARNg les plus spécifiques et sans cible pour les expériences, comme suggéré par l’outil en ligne.
   2. Assurez-vous qu’un site de coupe d’enzyme de restriction efficace est inclus dans la séquence entre les sites de coupe de l’ARNg (Figure 1A). Inclure un site d’enzyme de restriction entre les sites de coupe de l’ARNg pour permettre une confirmation visuelle rapide des modifications réussies.
      REMARQUE : Lorsque la délétion se produit, le site de restriction est supprimé, de sorte que l’enzyme ne coupera pas la séquence, produisant une seule bande non coupée sur un gel pour confirmer la délétion.
2. Pour les insertions de cassettes de gènes médiées par HDR, concevez plusieurs ARNg à l’aide des outils mentionnés pour la fabrication de mutants knock-out et sélectionnez le plus efficace après une évaluation ultérieure.
3. Concevez des plasmides donneurs pour la réparation dirigée par homologie (HDR) contenant des bras d’homologie de site cible, la séquence d’ADN cargo, un marqueur fluorescent, l’origine de la réplication et un gène de résistance aux antibiotiques (Figure 1B).
   1. Choisissez les bras d’homologie dans les régions en amont et en aval du site cible, chacun couvrant 500-1 000 pb¹⁰ (Figure 1B).
   2. Sélectionnez la séquence cargo, qui peut inclure un marqueur fluorescent, un gène d’intérêt ou un élément régulateur (p. ex., QF2).
   3. Sélectionnez un marqueur fluorescent. Les marqueurs fluorescents courants utilisés pour A. aegypti sont inclus dans une cassette d’ADN contenant un promoteur, un gène codant pour un marqueur fluorescent et une séquence UTR 3'. Voir la discussion pour plus de détails.

2. Préparation du mélange d’injection

1. Diluez la protéine Cas9 avec le tampon de dilution Cas9 à 1 μg/μL.
   REMARQUE : Ne décongelez pas et ne congelez pas Cas9 plus de 2 fois. Il est conseillé de faire des aliquotes de la protéine Cas9.
2. Achetez les ARNg ou produisez-les en interne.
   REMARQUE : Pour la production en interne, utilisez des pratiques standard de décontamination de l’ARN et des matériaux sans ARNse.
   1. Concevez 4 à 6 ARNg et choisissez les deux meilleurs ARNg pour l’injection (voir le test de clivage in vitro ci-dessous).
   2. Concevez une amorce directe qui inclut la séquence du promoteur T7 en amont de la séquence de l’ARNg. Utilisez l’amorce inverse universelle de l’ARNg pour les réactions PCR non matricielles, comme décrit ci-dessous. La base de séquence qui se chevauche s’apparie à la séquence correspondante dans l’amorce inverse universelle (en gras et soulignée), créant ainsi un modèle pour l’ADN polymérase afin d’amplifier leurs séquences.
      REMARQUE : Pour ces réactions de PCR, l’amorce directe doit contenir le promoteur T7 (en gras), suivi de deux guanines (importantes pour l’initiation de la transcription via l’ARN polymérase T7), de la séquence à 20 nucléotides de l’ARNg (N₂₀ ; sans la séquence PAM) et de la séquence de chevauchement de l’amorce (soulignée).
      Amorce vers l’avant : 5'- GAAATTAATACGACTCACTATAGGN₂₀ GTTTTAGAGCTAGAAATAGC- 3'
      Amorce revers : 5''-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTT CAAGTTGATAACGGACTAGC
      CTTATT TTAACTT GCTATTTCTAGCTCTAAAAC - 3'
   3. Synthétisez le modèle d’ADN par PCR non modèle. Mettez en place plusieurs réactions (chacune contenant 12,5 μL du mélange maître 2x, 1,25 μL de la solution 10 μM d’amorce directe, 1,25 μL de la solution 10 μM d’amorce inverse et 10 μL d’eau ultrapure) de sorte qu’il y ait suffisamment de produit PCR (300 ng) disponible pour la réaction de transcription in vitro . Utiliser les conditions de PCR suivantes : dénaturation initiale pendant 30 s à 98 °C ; 35 cycles d’amplification pendant 10 s à 98 °C, 10 s à 62 °C et 10 s à 72 °C ; extension finale à 72 °C pendant 2 min ; et stockage à 4 °C.
   4. Confirmer l’amplification d’un seul fragment d’ADN (122 paires de bases) sur un gel d’agarose (2 %).
   5. Nettoyez le modèle PCR à l’aide d’un kit de purification PCR, en suivant les recommandations du fabricant.
   6. Effectuez une réaction de transcription in vitro avec un kit de transcription T7. Mélangez 2 μL de tampon réactionnel 10x, 2 μL de nucléotides (ATP, CTP, UTP et GTP), 2 μL d’ARN polymérase T7, 3 μL d’ADN matrice (100 ng/μL) et 5 μL d’eau ultrapure. Incuber le mélange à 37 °C pendant au moins 2 h (pas plus de 16 h) jusqu’à toute la nuit (12 h).
      REMARQUE : Dans cette réaction, l’ARN polymérase T7 se lie au promoteur T7 inclus dans la séquence directe de l’amorce, ce qui conduit à la transcription de l’ARNg.
   7. Traitez la réaction de transcription avec la DNase en ajoutant 1 μL de DNase (bien mélanger) et en incubant à 37 °C pendant 15 min.
   8. Purifiez les ARNsg synthétisés à l’aide d’un kit de nettoyage de transcription en suivant les recommandations du fabricant.
   9. Effectuer un test de clivage in vitro pour évaluer l’efficacité de coupe des ARNg sélectionnés (Figure 1C).
      1. Concevez des amorces pour amplifier un fragment d’ADN (500-1 000 pb) flanquant le site de coupe de l’ARNg.
      2. Configurez les réactions de PCR comme suit : 12,5 μL du mélange maître 2x, 1,25 μL de la solution 10 μM d’amorce directe, 1,25 μL de la solution 10 μM d’amorce inverse, 9 μL d’eau ultrapure et 1 μL d’ADN matrice 5 ng/μL.
      3. Utiliser les conditions de PCR suivantes : conditions : dénaturation initiale pendant 30 s à 98 °C ; 35 cycles d’amplification pendant 10 s à 98 °C, 15-30 s à X °C (température de recuit idéale pour les amorces) et 35 s à 72 °C ; extension finale à 72 °C pendant 2 min ; et stockage final à long terme à 4 °C.
      4. Reportez-vous aux directives du fabricant pour connaître les meilleures températures d’amplification et la durée de l’amplification. Regrouper au moins cinq réactions ou augmenter les volumes des réactifs de manière à obtenir suffisamment de produit PCR (1,5 à 2 μg) après le nettoyage par PCR (bande unique) ou la purification en bande PCR sur gel d’agarose.
      5. Établissez des réactions de clivage de Cas9 avec du Cas9 recombinant en incubant le mélange suivant à 37 °C pendant 1 h : 1 μL de tampon réactionnel 10x Cas9, 0,35 μL de Cas9 recombinant (1 μg/μL), 1 μL d’ARNg (100 ng/μL), 6,65 μL d’eau ultrapure et 1 μL de 300 ng/μL d’ADN matrice.
      6. Mettez en place une réaction de contrôle négative sans aucun ARNg.
      7. Vérifiez l’efficacité du clivage en exécutant des réactions sur un gel d’agarose (1,5-2,0 % ; Figure 1C).

3. Assemblage du plasmide donneur

1. PCR-amplifier les bras d’homologie à partir de l’ADN génomique d’A. aegypti.
   1. Pour la conception de l’amorce, reportez-vous aux instructions du fabricant du kit de clonage. Utilisez un outil en ligne (p. ex., Benchling), qui fournit un soutien pour la conception et l’assemblage de plasmides à l’aide de différentes stratégies de clonage (p. ex., Gibson, Golden Gate et clonage basé sur des enzymes de restriction).
   2. Amplifiez la séquence cargo de l’ADN génomique d’A. aegypti ou commandez un fragment de gène synthétisé commercialement.
   3. Amplifiez les marqueurs fluorescents des plasmides en interne.
2. Comparez les fragments d’ADN des étapes 3.1.1 à 3.1.3 dans le squelette d’un plasmide existant par assemblage Gibson. Incuber un mélange de 10 μL de 2x master mix, X μL de tous les fragments d’ADN, 10-X μL d’eau ultrapure à 50 °C pendant 1 h.
   REMARQUE : Reportez-vous aux directives du fabricant pour calculer le rapport idéal entre les inserts et le squelette plasmidique.
   1. Calculez les concentrations de chaque fragment de clonage en pico mols : pmols = (poids en ng) × 1 000/(paires de bases × 650 daltons).
   2. Utilisez 50 à 100 ng de squelette plasmidique et 2 à 3 fois l’excès molaire de chaque insert.
   3. Si vous assemblez 2 à 3 fragments, ajoutez 0,02 à 0,5 mol de chaque fragment dans la réaction de Gibson. Si vous assemblez 4 à 6 fragments, ajoutez 0,2 à 1,0 pmols de chacun.
3. Utilisez 3 à 5 μL de la réaction d’assemblage de Gibson pour transformer les cellules compétentes d’E. coli JM109.
   REMARQUE : JM109 a été choisi pour l’assemblage Gibson en raison de son génotype recA- , qui réduit les événements de recombinaison indésirables et empêche le transfert de nucléases pendant la récolte cellulaire, garantissant ainsi l’intégrité des fragments d’ADN assemblés
   Pour les plasmides de plus de 10 kb, nous recommandons la transformation des cellules compétentes DH5α à l’aide du protocole étendu, en suivant les recommandations du fabricant.
4. Développez les bactéries transformées et purifiez le plasmide à l’aide d’un kit miniprep.
5. Pour confirmer l’assemblage correct du plasmide, exécutez une digestion d’enzyme de restriction diagnostique avec l’ADN plasmidique purifié et visualisez par électrophorèse sur gel d’agarose (Figure 1D,E).
   REMARQUE : Nous suggérons l’utilisation d’un outil en ligne pour la sélection de quelques enzymes de restriction qui peuvent couper le plasmide sur un seul site. Un logiciel comme Benchling dispose d’un outil intégré qui effectue la digestion virtuelle des séquences plasmidiques avec les enzymes de restriction sélectionnées, en affichant le motif de bande d’ADN attendu sur un gel d’électrophorèse virtuel (Figure 1D).
   1. Effectuer la digestion de l’enzyme de restriction plasmidique. Incuber un mélange de 1 μL de tampon de digestion de restriction 10x, 0,5 μL d’enzyme de restriction 1, 0,5 μL d’enzyme de restriction 2, 1 μL d’ADN plasmidique (300 ng/mL) et 7 μL d’eau ultrapure à 37 °C pendant 2 h.
   2. Exécutez les réactions de digestion de restriction sur un gel d’agarose (1,5 %).
      REMARQUE : Le motif de bande d’ADN (Figure 1E) doit ressembler au motif de bande de digestion virtuelle (Figure 1D). Les plasmides peuvent également être envoyés pour le séquençage de plasmides entiers si le service est disponible.
6. Cultivez le clone plasmidique dans 150 mL de milieu LB.
7. Effectuez le plasmide maxiprep, en suivant les directives du fabricant.
8. Mettez le plasmide en suspension dans de l’eau ultrapure.

4. Mélange de la construction d’injection

REMARQUE : Les plages de concentration finale suggérées pour chaque construction sont fournies dans le tableau 1. Commencez par un rapport de 2:1:2 (ng Cas9 : ng sgRNA : ng plasmide donneur) et ajustez si nécessaire pour optimiser l’efficacité du HDR. Le suivi des résultats aidera à déterminer la combinaison la plus efficace.

1. Pour fabriquer des mutants knock-out,
   1. Diluer l’aliquote de la protéine Cas9 à la concentration souhaitée à l’aide du tampon de dilution Cas9 et diluer l’aliquote de l’ARNg avec de l’eau ultrapure.
   2. Prémélangez la protéine Cas9 avec chaque ARNg pour former un complexe de ribonucléoprotéines (RNP). Combinez les solutions prémélangées.
2. Pour les insertions de cassettes de gènes médiées par HDR,
   1. Diluez et mélangez la protéine Cas9 et les ARNg comme suggéré pour fabriquer des mutants knock-out.
   2. Diluez le plasmide donneur avec de l’eau ultra-pure.
   3. Combinez toutes les constructions.

5. Tirer et charger les aiguilles de micro-injection

1. Utilisez du filament de quartz pour tirer les aiguilles d’injection (Figure 2). Assurez-vous que le filament mesure 10 cm de long, avec un diamètre extérieur de 1 mm et un diamètre intérieur de 0,7 mm.
2. Tirez les aiguilles à l’aide d’un extracteur de micropipette laser avec l’un des deux programmes suivants :
   Programme 1 : Heat 805, Filament 4, Velocity 50, Delay 145, Pull 145
   Programme 2 : Heat 650, Filament 4, Velocity 40, Delay 150, Pull 156
   REMARQUE : Le programme 1 permet d’obtenir une pointe d’aiguille plus fine mais plus longue, ce qui le rend adapté aux injections avec des constructions à faible concentration, où une pointe plus fine est bénéfique pour la précision. Le programme 2 permet d’obtenir une pointe d’aiguille plus courte mais plus épaisse, idéale pour les injections à plus forte concentration, car la construction est plus épaisse et nécessite une aiguille plus robuste.

6. Prélèvement d’embryons

1. Préparez un aspirateur électrique ou manuel pour recueillir les moustiques et utilisez des flacons en plastique pour la collecte et la récolte des embryons.
2. Humidifiez les papiers-filtres à cercle blanc et placez-les sur la paroi intérieure ou sur du coton humide dans le collecteur.
3. Placez 5 à 10 moustiques femelles qui ont été nourries de sang il y a 5 à 10 jours dans le collecteur. Placez le collecteur dans l’obscurité pendant 45 min.
4. Sortez les papiers-filtres pour le prélèvement d’embryons.

7. Alignement des embryons

1. Utiliser une souche sauvage (Liverpool) d’A. aegypti pour l’injection d’embryons.
2. Sélectionnez les embryons au stade préblastodermique, en particulier ceux de couleur gris clair, sur le papier de récolte (Figure 3).
3. Transférez quelques embryons avec une brosse mouillée sur le ruban adhésif double face placé sur une lamelle. Alignez les embryons en parallèle pendant que leur entourage est encore humide, en vous assurant qu’ils sont côte à côte, avec toutes les extrémités postérieures tournées vers l’avant.
4. Une fois correctement positionné, laissez l’environnement sécher légèrement pour fixer les embryons en place.
5. Ajoutez de l’huile d’halocarbure 700 sur les embryons pendant l’alignement pour éviter la dessiccation.
   REMARQUE : Assurez-vous que les embryons ne sont pas entourés d’eau lors de l’ajout de l’huile, car cela ferait flotter les embryons dans l’huile.

8. Micro-injection d’embryons

REMARQUE : L’injection est effectuée à température ambiante ou à 18 °C. La température de 18°C est recommandée pour des raisons pratiques, car elle retarde le développement de l’embryon.

1. Mettre en place un micro-injecteur avec les paramètres suivants : pression de compensation (Pc) 300 hPa, pression d’injection (Pi) 500 hPa. Ajustez ces conditions si nécessaire.
2. Chargez 3 μL de la construction mixte dans une aiguille à l’aide d’un microchargeur.
3. Placez le verre de protection avec les embryons alignés sur une lame de microscope (Figure 3). Positionnez le verre de protection et la lame sous le microscope pour l’injection. Assurez-vous que l’extrémité postérieure de l’embryon est positionnée vers l’aiguille.
4. Placez une aiguille dans un porte-aiguille avec un micromanipulateur et positionnez l’aiguille à un angle de 10° vers l’extrémité postérieure des embryons alignés, en la maintenant immobile (Figure 4A). Ouvrez doucement l’aiguille sous un microscope et touchez-la légèrement avec le bord d’une lamelle.
   REMARQUE : Une autre option consiste à créer une petite ouverture dans l’aiguille en la tapotant avec un embryon. Cependant, une ouverture de l’aiguille légèrement plus large est recommandée, car l’adhérence de la protéine Cas9 peut obstruer l’aiguille.
5. Déplacez le verre de la lame vers l’aiguille d’injection (Figure 5).

9. Suivi de l’embryon injecté

1. Utilisez des lingettes jetables non pelucheuses pour enlever l’huile entourant les embryons.
2. Ajoutez de l’eau déminéralisée pour rincer les embryons et déplacez-les sur un papier filtre humide. Placez le papier filtre humide sur un mouchoir humide à l’intérieur de gobelets de 9 oz de Carat (Figure 4B et Figure 6A,B).
3. Placez du coton humide au fond de la tasse pour maintenir l’humidité (Figure 6B).
4. Conservez les embryons injectés sur du papier filtre humide.

10. Éclosion d’embryons et dépistage des larves G0

1. Au moins 4 jours après l’injection, transférez le papier filtre contenant des embryons dans environ 3 L d’eau déminéralisée dans des casseroles Sterilite de 6 pintes pour l’éclosion.
   REMARQUE : Les œufs éclosent généralement plus efficacement dans les 2 semaines suivant l’injection. Assurez-vous que les œufs restent humides pendant cette période. Le papier filtre ne doit pas être trop humide, car une humidité excessive peut entraîner une éclosion précoce des embryons. Bien qu’une conservation plus longue puisse améliorer les taux d’éclosion, ne dépassez pas un mois pour des résultats optimaux. L’utilisation d’eau désoxygénée peut également aider à l’éclosion.
2. Une fois que les larves G0 éclosent, ajoutez de la nourriture pour poissons mélangée à de l’eau dans la casserole comme nourriture.
3. Criblez les larves G0 pour détecter le marqueur fluorescent au stade larvaire du 3e au 4e stade (figure 7).
4. Conservez les larves séparément en fonction de leur statut fluorescent, les larves fluorescentes positives et négatives fluorescentes étant conservées dans des bacs séparés.

11. Tri sexuel des pupes et croisement avec le type sauvage

1. Séparez les moustiques injectés par sexe lorsqu’ils se nymphosent, en utilisant des structures spécifiques à la taille et au sexe au niveau du lobe génital pour l’identification :
   1. Mâles : De plus petite taille, un lobe génital plus proéminent et pointu, et des pagaies plus larges (structures à l’extrémité de la queue des nymphes ; Figure 8A 1,A2).
   2. Femelles : De plus grande taille, un lobe génital plus petit et moins prononcé, et des pagaies plus étroites (figures 8B 1,B2).
2. Pool de moustiques fluorescents positifs ou fluorescents négatifs de chaque sexe.
3. Croisez les moustiques regroupés avec des moustiques du sexe opposé de la souche Liverpool. Utilisez un rapport de 3:1 à 5:1 entre le type sauvage et le moustique G0.
4. Croisez les moustiques pendant 4 jours.
5. Donnez aux femelles un repas de sang après le croisement.

12. Dépistage G1

1. Trois jours après l’alimentation sanguine, fournissez des coquetiers en plaçant une serviette en papier à l’intérieur de la paroi des tasses de 9 oz de Karat et en ajoutant environ 3 oz d’eau déminéralisée.
2. Après 3-4 jours, récoltez et faites éclore les embryons G1. Criblez les larves G1 pour détecter la présence du marqueur fluorescent aux stades 3 et 4 (figure 7).
3. Recueillir les larves fluorescentes, en suggérant une insertion HDR. Lorsque les individus fluorescents G1 atteignent le stade de nymphe, séparez-les par sexe et placez chaque sexe dans des cages séparées.
4. Croisez les moustiques fluorescents G1 avec des individus du sexe opposé de la souche Liverpool.

13. Confirmation du site d’insertion G1

1. Après avoir fourni le repas de sang, préparez les femelles G1 pour la ponte d’un seul œuf femelle en plaçant un petit morceau de serviette en papier dans des flacons individuels de drosophile et en ajoutant 3 ml d’eau désionisée.
2. Pour les mutants knock-out :
   1. Après la ponte, l’eau s’évapore et la serviette en papier sèche, faites éclore les œufs des femelles qui présentent clairement des mutations knock-out et obtenez la génération G2.
   2. Collectez le corps des mères G1 qui ont réussi à faire éclore la progéniture G2 et extrayez l’ADN.
   3. Utilisez l’ADN comme modèle pour la PCR afin d’amplifier la séquence couvrant le site cible. Assurez-vous que les amorces amplifient un fragment d’ADN de ~200 pb. Préparez les réactions (chacune contenant 12,5 μL du mélange maître 2x, 1,25 μL de la solution 10 μM d’amorce directe, 1,25 μL de la solution 10 μM d’amorce inverse, 9 μL d’eau ultrapure et 1 μL d’ADN matrice [5 ng/μL]). Utiliser les conditions de PCR suivantes : dénaturation initiale pendant 30 s à 98 °C ; 35 cycles d’amplification pendant 10 s à 98 °C, 15-30 s à X °C (température de recuit idéale des amorces) et 10 s à 72 °C ; extension finale à 72 °C pendant 2 min ; et stockage final à long terme à 4 °C.
   4. Purifiez les fragments de PCR et effectuez la digestion enzymatique de restriction des fragments de PCR en incubant un mélange de 1 μL de tampon de digestion de restriction 10x, 0,5 μL d’enzyme de restriction 1, 0,5 μL d’enzyme de restriction 2, 1 μL de fragment de PCR (200 ng/mL) et 7 μL d’eau ultrapure à 37 °C pendant 30 min.
      REMARQUE : Certaines enzymes de restriction peuvent être utilisées dans le mélange PCR sans purification préalable.
   5. Visualisez la digestion des fragments de PCR par électrophorèse sur gel pour confirmer s’il y a eu clivage.
   6. Séquencez le fragment de PCR non digéré pour identifier les mutations knock-out.
   7. Pour les insertions médiées par HDR, après la ponte :
      1. Collectez le corps des mères G1 et extrayez l’ADN.
      2. Utilisez l’ADN comme modèle pour la PCR afin d’amplifier la séquence couvrant le site cible.
      3. Effectuez le séquençage du fragment d’ADN amplifié pour confirmer l’intégrité de la cassette d’ADN insérée.
      4. Faites éclore l’œuf et obtenez la génération G2.

14. Élargir les nouvelles gammes CRISPR

1. Pour les lignées mutantes knock-out :
   1. Configurez les femelles G2 pour la ponte, avec 20 femelles par G1. Chaque G1 représente une ligne.
   2. Après la ponte, confirmer les mutations knock-out de la même manière que pour G1.
   3. Poursuivez avec cinq lignées G1 qui présentent des mutations clairement identifiées dans G1 et G2. Faites éclore les œufs collectés dans G2 de chaque lignée, donnant naissance à la génération G3.
   4. Parmi les cinq lignées croisées, sélectionnez deux lignées présentant des mutations clairement identifiées et une valeur adaptative élevée ou le phénotype souhaité.
   5. Croisez les femelles G3 de chaque lignée sélectionnée avec les mâles de la souche Liverpool.
   6. Installez 50 femelles seules pour la ponte à partir de chaque ligne. Confirmez les mutations knock-out comme cela a été fait précédemment pour G1.
      REMARQUE : Augmentez le nombre de femmes dans la configuration pour maintenir la diversité.
   7. Répétez les procédures pour deux générations supplémentaires avec les deux lignes (Figure 4J).
2. Pour les nouvelles lignes d’insertions médiées par HDR :
   1. Vérifier la présence d’individus fluorescents dans la génération G2.
   2. Croisez des moustiques G2, de chaque individu G1, avec la souche Liverpool. Chaque individu G1 représente une ligne.
   3. Poursuivez avec trois autres générations de croisement. Vérifiez continuellement le marqueur fluorescent et observez la valeur adaptative¹⁹ de chaque ligne (Figure 4x).
   4. Sélectionnez une ligne avec des insertions correctes et une forme physique élevée et le phénotype souhaité.

15. Faites des lignes homozygotes

1. Pour les lignées mutantes knock-out :
   1. Génération G6 :
      1. Faites éclore les œufs produits par G5 et obtenez la génération G6.
      2. Croiser les adultes G6 à l’intérieur de leurs lignes respectives (figure 4K et figure 9A).
      3. Installez 50 femelles G6 simples pour la ponte par ligne et faites éclore les œufs comme décrit précédemment (figure 9B).
      4. Prélever les femelles G6 qui ont réussi à faire éclore la progéniture G7, extraire l’ADN et effectuer une PCR et une digestion enzymatique de restriction comme pour G1 (figure 9C).
         REMARQUE : Un tampon d’écrasement (SB) simple et peu coûteux peut être utilisé à cette étape pour l’extraction de l’ADN.
         1. À l’aide d’un broyeur à main, faites macérer un seul moustique dans 100 μL de 1x SB (10 mM de Tris-HCl pH 8, 1 mM d’EDTA et 25 mM de NaCl). Ajouter la protéinase K (200 μg/mL) et incuber à 37 °C pendant 30 min, puis à 95 °C pendant 2 min. Faites tourner à 10 000 × g pendant 5 min et récupérez le surnageant²⁰.
      5. Confirmez la mutation en visualisant les résultats sur un gel.
      6. Jetez les œufs produits par les femelles sans mutations (figure 9D).
      7. Conserver les larves des femelles présentant des mutations confirmées afin d’établir plusieurs lignées G7, et jeter les couvées sans mutations (figure 9D).
   2. Génération G7 :
      1. Croisement des femelles et des mâles au sein de chaque lignée G7 (figure 9E).
      2. Installez 10 femelles G7 simples pour la ponte par ligne et faites éclore les œufs comme décrit précédemment (figure 9F).
      3. Collectez les femelles G7 qui ont réussi à faire éclore la progéniture G7, extrayez l’ADN et effectuez une PCR et une digestion par enzyme de restriction (Figure 9G).
      4. Détectez les mutations knock-out sur les deux allèles ou sur un seul allèle en visualisant les résultats sur un gel.
      5. Maintenir les larves des femelles G7 dont il a été confirmé qu’elles ont des knock-out dans les deux allèles, produisant la génération G8 (figure 9H). Jetez les couvées sans mutations (figure 9H).
         REMARQUE : Cette étape permet de s’assurer que les femelles sont homozygotes. Au G8, tester l’homozygotie de la descendance permet de confirmer si les pères sont également homozygotes.
   3. Génération G8 :
      1. Croisez des adultes G8 pour chaque lignée féminine G7 (figure 9I).
      2. Choisissez au hasard cinq mâles G8, extrayez l’ADN et effectuez une PCR et une digestion par enzyme de restriction (Figure 9J).
      3. Fournissez un repas de sang et faites éclore les œufs des femelles G8 qui ont été croisées avec des mâles G8 dont il a été confirmé qu’ils avaient des knock-out dans les deux allèles.
      4. Continuez avec les lignées G7 où tous les mâles détectés ont des knock-out dans les deux allèles, indiquant que ces lignées sont homozygotes.
2. Pour les lignes d’insertion médiées par HDR :
   1. Faites éclore les œufs produits par G5 et obtenez la génération G6. Criblez les larves au stade G6 pour les marqueurs fluorescents.
   2. Jeter les larves sans marqueurs fluorescents (figure 4xi).
   3. Croisez des moustiques qui présentent des marqueurs fluorescents.
   4. Poursuivre cette procédure pour chaque génération subséquente jusqu’à ce qu’aucune larve non fluorescente ne soit observée. À ce stade, la ligne de moustiques sera homozygote.

Résultats

Conception et validation du ciblage génique médié par l’ARNg pour la recombinaison par homologie HDR
Pour s’assurer que le gène souhaité est ciblé avec précision, nous recommandons de sélectionner quelques ARNg et de positionner les bras d’homologie 5' et 3' près du site de coupe pour la recombinaison homologue médiée par HDR (Figure 1A). Par exemple, nous avons conçu deux ARNg pour cible...

Discussion

La technologie CRISPR-Cas a changé le paysage de l’édition du génome en favorisant des changements spécifiques à la cible dans les chromosomes¹. Même si les éléments transposables étaient essentiels à la génération des premiers moustiques transgéniques, leurs sites d’insertion sont quelque peu aléatoires et l’expression de la construction cargo (promoteur + gène) peut ne pas correspondre au profil d’expression du gène réel en raison d’un...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Cas9 reaction buffer	PNA Bio	CB01
Benchling software	Benchling	N/A	www.benchling.com
Cas9 dilution buffer	PNA Bio	CB03
Cas9 protein	PNA Bio	CP01-50
DH5α E. coli Competent Cells	New England Biolabs	C2987
Double-sided sticky tape	Scotch Permanent	3136
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-109
Filter papers	GE Healthcare Life Science	1450-042
Fish food	Tetra	B00025Z6YI	goldfish flakes
Flugs	Genesee Scientific	AS273
Fluorescent microscope	Leica Microsystems	M165 FC
Gene fragment	Integrated DNA Technologies	N/A
gRNA	Synthego	N/A
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Injection microscope	Leica Microsystems	DM2000
JM109  E. coli Competent Cells	Zymo Research	T3005
Microinjector	Eppendorf		FemtoJet 4x
Microloader Tips for Filling Femtotips	Eppendorf	E5242956003
Micromanipulator	Eppendorf		TransferMan 4r
Micropipette Pullers	Sutter Instrument	P-2000
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-542-B
Microscope slide	Eisco	12-550-A3
Mouse blood (live mice used for feeding)	University of California	IACUC, Animal Use Protocol #S17187	Used for mosquito blood feeding; details comply with animal ethics protocols
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0491S
PCR Purification Kit	Qiagen	28004
Plasmid Miniprep Kit	Zymo Research	D4036
Quartz filament	Sutter Instruments	QF100-70-10
Transcription Clean-Up Kit	Fisher Scientific	AM1908
Ultra-pure water	Life Technologies	10977-023