Editing del genoma nella zanzara della febbre gialla Aedes aegypti utilizzando CRISPR-Cas9

Riepilogo

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'editing del genoma attraverso la microiniezione embrionale nella zanzara A. aegypti utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9.

Abstract

L'emergere della tecnologia CRISPR-Cas9 (clustered, regularly intersranged, short palindromic repeats)-Cas9 ha rivoluzionato il campo dell'ingegneria genetica e ha aperto le porte all'editing preciso del genoma in più specie, compresi gli organismi non modello. Nella zanzara Aedes aegypti, con questa tecnologia sono state realizzate mutazioni con perdita di funzione e inserzioni di DNA. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'editing del genoma attraverso la microiniezione embrionale nella zanzara A. aegypti utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9, concentrandosi sia sulla generazione di knockout genico che sulle linee knockin. In questo protocollo, gli aghi di quarzo sono riempiti con una miscela di RNA guida, Cas9 ricombinante e un plasmide contenente una cassetta di DNA che codifica un gene per un marcatore fluorescente, se si desidera il knockin genico. Gli embrioni allo stadio di preblastoderma vengono allineati su una striscia di nastro biadesivo posizionata su un vetrino, che viene successivamente montato su un vetrino. Con l'aiuto di un microiniettore, gli aghi vengono inseriti delicatamente nell'estremità posteriore degli embrioni e viene erogato un piccolo volume della miscela CRISPR. Quando gli embrioni si schiudono, le larve vengono controllate sotto il cannocchiale fluorescente e le pupe vengono selezionate per sesso e separate in gabbie diverse. Una volta che gli adulti emergono, questi vengono reciprocamente incrociati con individui di tipo selvatico, nutriti con sangue e posti per la deposizione delle uova. Una volta che queste uova si sono schiuse, le larve fluorescenti raccolte rappresentano individui con inserimento stabile della cassetta del DNA nel loro genoma. Queste larve vengono poi cresciute fino allo stadio adulto, incrociate con individui di tipo selvatico e quindi ulteriormente valutate attraverso tecniche molecolari per confermare che l'esatta sequenza della cassetta del DNA sia presente nel sito desiderato del genoma della zanzara. Le linee omozigoti possono essere ottenute anche seguendo la pipeline fornita di schema di incrocio e screening molecolare delle mutazioni.

Introduzione

L'editing preciso del genoma è diventato probabilmente più facile, ma possibile, con l'istituzione delle tecnologie CRISPR-Cas delle forbici molecolari¹. Queste tecnologie sfruttano un meccanismo che il sistema immunitario procariotico utilizza per combattere le infezioni da fagi². Tra questi sistemi, le ripetizioni palindromiche brevi (CRISPR) raggruppate, regolarmente intervallate, insieme alla nucleasi Cas9 di solito si basano su 20 RNA di coppie di basi, gli RNA guida (gRNA), con sequenze omologhe al DNA bersaglio, che sono seguite da una sequenza³ del motivo adiacente al protospaziatore NGG (PAM). I gRNA caricati sul Cas9 guidano queste nucleasi con precisione verso specifici siti bersaglio nel genoma, innescando rotture del DNA a doppio filamento³.

Le rotture del doppio filamento del DNA inducono i meccanismi di riparazione a rattoppare la doppia elica⁴. Mentre ci si aspetta che qualsiasi riparazione del DNA sia precisa, esistono meccanismi di riparazione del DNA meno accurati che possono lasciare cicatrici di sequenza e, a loro volta, mutazioni con perdita di funzione⁴. Tra i meccanismi di riparazione del DNA soggetti a errori, l'unione terminale non omologa (NHEJ) può causare mutazioni frame-shift, tra cui piccole delezioni, inserzioni e cambiamenti nucleotidici (SNP), che possono provocare mutazioni con perdita di funzione. Il meccanismo di riparazione diretta per omologia (HDR), d'altra parte, si basa sul cromosoma omologo come modello per copiare l'esatta sequenza dell'allele non danneggiato e realizzare una riparazione perfetta della sequenza di DNA mirata⁴.

Sulla base di queste conoscenze, la tecnologia CRISPR-Cas9 è stata sviluppata per modificare con precisione i genomi, probabilmente in qualsiasi sequenza contenente un sito PAM³. Nelle zanzare, la tecnologia CRISPR-Cas9 è stata utilizzata per eliminare una varietà di geni, attraverso la microiniezione embrionale di una miscela di Cas9 e gRNA, sfruttando il meccanismo di riparazione NHEJ ^5,6. Una mutagenesi germinale simile si ottiene con l'iniezione di una miscela di gRNA + Cas9 nell'emolinfa di zanzare femmine adulte⁷. Questa tecnologia è stata coniata come controllo ReMOT e si basa su una versione modificata di un Cas9 marcato con un peptide che viene assorbito dalle ovaie attraverso l'endocitosi durante il processo di sviluppo dell'uovo (vitellogenesi)⁷. L'inserimento di specifiche cassette geniche in un genoma è possibile solo attraverso la microiniezione embrionale di una miscela di gRNA e Cas9 (o di un plasmide che esprime tali molecole) insieme a un plasmide che codifica una cassetta di DNA desiderata⁸. Sfruttando il meccanismo HDR, il plasmide contenente la cassetta di DNA di interesse affiancato da sequenze omologhe (500-1.000bp)^9,10 a monte e a valle del sito bersaglio viene utilizzato come stampo per riscrivere la rottura del doppio filamento, copiando anche la cassetta di DNA nella sequenza bersaglio⁹.

La tecnologia CRISPR-Cas9 è stata utilizzata per eliminare diversi geni coinvolti principalmente con i sistemi sensoriali nella zanzara Aedes aegypti¹¹, ma anche geni associati alla fertilità maschile e alla vitalità femminile (PgSIT) per il controllo della popolazione¹². Il knocking out di geni bersaglio è stato ottenuto anche inserendo geni che codificano marcatori fluorescenti nelle sequenze codificanti di geni specifici^13,14. Questa strategia ha il vantaggio non solo di indurre mutazioni frame-shift, ma anche di consentire l'uso della luce fluorescente per selezionare gli individui della nuova linea knockout^13,14. Il genoma di A. aegypti è stato anche modificato con sequenze di sistemi di espressione binaria, come il sistema Q (QF-QUAS⁾¹¹. L'inserimento del gene che codifica per il transattivatore QF a valle di un promotore di un gene specifico assicura un'espressione spazio-temporale definita del transattivatore^15,16. Una volta che una linea di zanzara che esprime QF viene incrociata con un'altra linea di zanzara contenente i siti di legame (QUAS) per QF, quest'ultima si lega ad essa e innesca l'espressione dei geni a valle della sequenza QUAS^15,16. Questo sistema, nel complesso, consente l'espressione tessuto-specifica e tempo-specifica di tali geni effettori, che possono essere marcatori fluorescenti utilizzati per la localizzazione cellulare o il rilevamento dell'attività neuronale, e persino nucleasi Cas9 per l'interruzione di geni in tessuti specifici (ad esempio, knockout somatico)¹¹.

Date tutte le informazioni disponibili per la trasformazione genetica di A. aegypti , forniamo qui un protocollo dettagliato con indicazioni dettagliate per eseguire l'editing del genoma con il sistema CRISPR-Cas9 attraverso la microiniezione embrionale. Vengono discusse le strategie per generare sia knockout, attraverso mutazioni frame-shift e delezioni mediate da NHEJ, sia linee knockin, mediante inserzioni di cassette geniche mediate da HDR.

Protocollo

I dettagli relativi alle apparecchiature e ai reagenti utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei materiali. Tutti gli animali sono stati gestiti seguendo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, come raccomandato dal National Institutes of Health. Le procedure sono state approvate dall'UCSD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, Animal Use Protocol #S17187) e dall'UCSD Biological Use Authorization (BUA #R2401).

1. gRNA e progettazione di plasmidi donatori

1. Per creare mutanti knockout, progettare due gRNA distanziati di ~20-100 bp (Figura 1A).
   1. Progettare gRNA da 20 bp per CRISPR-Cas9, escludendo la sequenza PAM (NGG) utilizzando uno strumento online (Figura 1A), come CHOPCHOP ( https://chopchop.cbu.uib.no/)¹⁷o Benchling (benchling.com) o CRISPOR (http://crispor.gi.ucsc.edu/)¹⁸. Seleziona i gRNA più specifici e privi di bersagli per gli esperimenti, come suggerito dallo strumento online.
   2. Assicurarsi che un sito di taglio dell'enzima di restrizione efficiente sia incluso nella sequenza tra i siti di taglio del gRNA (Figura 1A). Includere un sito enzimatico di restrizione tra i siti di taglio del gRNA per consentire una rapida conferma visiva delle modifiche riuscite.
      NOTA: Quando si verifica la delezione, il sito di restrizione viene rimosso, quindi l'enzima non taglierà la sequenza, producendo una singola banda non tagliata su un gel per confermare la delezione.
2. Per gli inserimenti di cassette geniche mediate da HDR, progettare più gRNA utilizzando gli strumenti menzionati per creare mutanti knockout e selezionare quello più efficace dopo una valutazione successiva.
3. Progettare plasmidi donatori per la riparazione diretta dall'omologia (HDR) contenenti bracci di omologia del sito bersaglio, la sequenza del DNA cargo, un marcatore fluorescente, l'origine della replicazione e un gene di resistenza agli antibiotici (Figura 1B).
   1. Scegliere i bracci di omologia dalle regioni a monte e a valle del sito target, ciascuno dei quali si estende a 500-1.000 bp¹⁰ (Figura 1B).
   2. Seleziona la sequenza del carico, che può includere un marcatore fluorescente, un gene di interesse o un elemento regolatorio (ad esempio, QF2).
   3. Seleziona un marcatore fluorescente. I marcatori fluorescenti comuni utilizzati per A. aegypti sono inclusi in una cassetta di DNA contenente un promotore, un gene codificante un marcatore fluorescente e una sequenza UTR 3'. Per ulteriori dettagli, vedere la discussione.

2. Preparazione della miscela per iniezione

1. Diluire la proteina Cas9 con il tampone di diluizione Cas9 a 1 μg/μL.
   NOTA: Non scongelare e congelare Cas9 più di 2 volte. Si consiglia di fare aliquote della proteina Cas9.
2. Acquista i gRNA o producili internamente.
   NOTA: Per la produzione interna, utilizzare pratiche standard di decontaminazione dell'RNA e materiali privi di RNAsi.
   1. Progettare 4-6 gRNA e scegliere i due migliori gRNA per l'iniezione (vedere il saggio di scissione in vitro di seguito).
   2. Progettare un primer diretto che includa la sequenza del promotore T7 a monte della sequenza di gRNA. Utilizzare il primer inverso universale al gRNA per le reazioni PCR non stampo, come descritto di seguito. La base della sequenza sovrapposta si accoppia alla sequenza corrispondente nel primer inverso universale (grassetto e sottolineato), creando un modello per la DNA polimerasi per amplificare le loro sequenze.
      NOTA: Per queste reazioni di PCR, il primer diretto deve contenere il promotore T7 (grassetto), seguito da due guanine (importanti per l'inizio della trascrizione tramite l'RNA polimerasi T7), la sequenza di 20 nucleotidi del gRNA (N₂₀; senza la sequenza PAM) e la sequenza di sovrapposizione del primer (sottolineata).
      Innesco in avanti: 5'- GAAATTAATACGACTCACTATAGGN₂₀ GTTTTAGAGCTAGAAATAGC- 3'
      Innesco inverso: 5''-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTT CAAGTTGATAACGGACTAGC
      CTTATT TTAACTT GCTATTTCTAGCTCTAAAAC - 3'
   3. Sintetizzare il modello di DNA mediante PCR non modello. Impostare reazioni multiple (ciascuna contenente 12,5 μl della miscela master 2x, 1,25 μl della soluzione 10 μM di primer diretto, 1,25 μl della soluzione 10 μM di primer inverso e 10 μl di acqua ultrapura) in modo che sia disponibile una quantità sufficiente di prodotto PCR (300 ng) per la reazione di trascrizione in vitro . Utilizzare le seguenti condizioni PCR: denaturazione iniziale per 30 s a 98 °C; 35 cicli di amplificazione per 10 s a 98 °C, 10 s a 62 °C e 10 s a 72 °C; prolungamento finale a 72 °C per 2 min; e stoccaggio a 4 °C.
   4. Confermare l'amplificazione di un singolo frammento di DNA (122 paia di basi) su un gel di agarosio (2%).
   5. Pulisci il modello PCR utilizzando un kit di purificazione PCR, seguendo le raccomandazioni del produttore.
   6. Eseguire una reazione di trascrizione in vitro con un kit di trascrizione T7. Miscelare 2 μL di tampone di reazione 10x, 2 μL ciascuno di nucleotidi (ATP, CTP, UTP e GTP), 2 μL di RNA polimerasi T7, 3 μL di DNA stampo (100 ng/μL) e 5 μL di acqua ultrapura. Incubare la miscela a 37 °C per almeno 2 ore (non più di 16 ore) fino a una notte (12 ore).
      NOTA: In questa reazione, l'RNA polimerasi T7 si lega al promotore T7 incluso nella sequenza di primer in avanti, che porta alla trascrizione del gRNA.
   7. Trattare la reazione di trascrizione con DNasi aggiungendo 1 μL di DNasi (mescolare bene) e incubando a 37 °C per 15 minuti.
   8. Purificare gli sgRNA sintetizzati con un kit di pulizia della trascrizione seguendo le raccomandazioni del produttore.
   9. Eseguire un saggio di scissione in vitro per valutare l'efficienza di taglio dei gRNA selezionati (Figura 1C).
      1. Progettare primer per amplificare un frammento di DNA (500-1.000 bp) che fiancheggia il sito di taglio del gRNA.
      2. Impostare le reazioni PCR come segue: 12,5 μL della miscela master 2x, 1,25 μL della soluzione 10 μM di primer diretto, 1,25 μL della soluzione 10 μM di primer inverso, 9 μL di acqua ultrapura e 1 μL di DNA stampo da 5 ng/μL.
      3. Utilizzare le seguenti condizioni PCR: condizioni: denaturazione iniziale per 30 s a 98 °C; 35 cicli di amplificazione per 10 s a 98 °C, 15-30 s a X °C (temperatura di ricottura ideale per i primer) e 35 s a 72 °C; prolungamento finale a 72 °C per 2 min; e stoccaggio finale a lungo termine a 4 °C.
      4. Fare riferimento alle linee guida del produttore per il miglior amptemperature di amplificazione e intervallo di tempo. Raggruppare almeno cinque reazioni o aumentare i volumi dei reagenti in modo da ottenere una quantità sufficiente di prodotto PCR (1,5-2 μg) dopo la pulizia PCR (banda singola) o la purificazione della banda PCR su gel di agarosio.
      5. Impostare le reazioni di scissione di Cas9 con Cas9 ricombinante incubando la seguente miscela a 37 °C per 1 ora: 1 μL di tampone di reazione Cas9 10x, 0,35 μL di Cas9 ricombinante (1 μg/μL), 1 μL di gRNA (100 ng/μL), 6,65 μL di acqua ultrapura e 1 μL di 300 ng/μL di DNA stampo.
      6. Impostare una reazione di controllo negativo senza alcun gRNA.
      7. Verificare l'efficienza della scissione eseguendo reazioni su un gel di agarosio (1,5-2,0%; Figura 1C).

3. Assemblaggio del plasmide donatore

1. PCR-amplificare i bracci di omologia dal DNA genomico di A. aegypti.
   1. Per la progettazione del primer, fare riferimento alle linee guida del produttore del kit di clonazione. Utilizzare uno strumento online (ad esempio, Benchling), che fornisce supporto per la progettazione e l'assemblaggio di plasmidi utilizzando diverse strategie di clonazione (ad esempio, Gibson, Golden Gate e clonazione basata su enzimi di restrizione).
   2. Amplifica la sequenza cargo dal DNA genomico di A. aegypti o ordina un frammento genico sintetizzato commercialmente.
   3. Amplifica internamente i marcatori fluorescenti dei plasmidi.
2. Frammenti di DNA ligate dai passaggi 3.1.1 a 3.1.3 nella spina dorsale di un plasmide esistente mediante assemblaggio di Gibson. Incubare una miscela di 10 μL di 2x master mix, X μL di tutti i frammenti di DNA, 10-X μL di acqua ultrapura a 50 °C per 1 ora.
   NOTA: Fare riferimento alle linee guida del produttore per il calcolo del rapporto ideale tra inserti e dorsale plasmidica.
   1. Calcola le concentrazioni di ogni frammento di clonazione in pico mol: pmol = (peso in ng) × 1.000/(paia di basi × 650 dalton).
   2. Utilizzare 50-100 ng di spina dorsale plasmidica e un eccesso molare di 2-3 volte di ciascun inserto.
   3. Se si assemblano 2-3 frammenti, aggiungere 0,02-0,5 pmol di ciascun frammento nella reazione di Gibson. Se si assemblano 4-6 frammenti, aggiungere 0,2-1,0 pmol di ciascuno.
3. Utilizzare 3-5 μl della reazione di assemblaggio di Gibson per trasformare le cellule competenti di E. coli JM109.
   NOTA: JM109 è stato scelto per l'assemblaggio di Gibson grazie al suo genotipo recA- , che riduce gli eventi di ricombinazione indesiderati e previene il carryover della nucleasi durante la raccolta delle cellule, garantendo l'integrità dei frammenti di DNA assemblati
   Per plasmidi di dimensioni superiori a 10 kb, si consiglia la trasformazione di cellule competenti per DH5α utilizzando il protocollo esteso, seguendo le raccomandazioni del produttore.
4. Espandi i batteri trasformati e purifica il plasmide utilizzando un kit di miniprep.
5. Per confermare il corretto assemblaggio del plasmide, eseguire un digest dell'enzima di restrizione diagnostica con il DNA plasmidico purificato e visualizzare mediante elettroforesi su gel di agarosio (Figura 1D, E).
   NOTA: Suggeriamo l'uso di uno strumento online per la selezione di un paio di enzimi di restrizione in grado di tagliare il plasmide su un singolo sito. Software come Benchling hanno uno strumento integrato che esegue la digestione virtuale delle sequenze plasmidiche con gli enzimi di restrizione selezionati, visualizzando il modello di bande di DNA previsto su un gel di elettroforesi virtuale (Figura 1D).
   1. Effettuare la digestione dell'enzima di restrizione plasmidica. Incubare una miscela di 1 μL di tampone digest di restrizione 10x, 0,5 μL di enzima di restrizione 1, 0,5 μL di enzima di restrizione 2, 1 μL di DNA plasmidico (300 ng/mL) e 7 μL di acqua ultrapura a 37 °C per 2 ore.
   2. Eseguire le reazioni digest di restrizione su un gel di agarosio (1,5%).
      NOTA: Il modello di banda del DNA (Figura 1E) dovrebbe assomigliare al modello di banda del digest virtuale (Figura 1D). I plasmidi possono anche essere inviati per il sequenziamento dell'intero plasmide, se il servizio è disponibile.
6. Coltura del clone plasmidico in 150 mL di terreno LB.
7. Eseguire il plasmide maxiprep, seguendo le linee guida del produttore.
8. Sospendi il plasmide in acqua ultrapura.

4. Miscelazione del costrutto di iniezione

NOTA: Gli intervalli di concentrazione finali suggeriti per ciascun costrutto sono forniti nella Tabella 1. Inizia con un rapporto di 2:1:2 (ng Cas9: ng sgRNA: ng plasmide donatore) e regola se necessario per ottimizzare l'efficienza HDR. Il monitoraggio dei risultati aiuterà a identificare la combinazione più efficace.

1. Per fare mutanti knockout,
   1. Diluire l'aliquota della proteina Cas9 alla concentrazione desiderata utilizzando il tampone di diluizione Cas9 e diluire l'aliquota di gRNA con acqua ultrapura.
   2. Premiscelare la proteina Cas9 con ciascun gRNA per formare un complesso ribonucleoproteico (RNP). Unire le soluzioni premiscelate.
2. Per l'inserimento di cassette geniche mediate da HDR,
   1. Diluire e mescolare la proteina Cas9 e i gRNA come suggerito per la produzione di mutanti knockout.
   2. Diluire il plasmide donatore con acqua ultrapura.
   3. Combina tutti i costrutti.

5. Estrazione e caricamento degli aghi per microiniezione

1. Utilizzare il filamento di quarzo per tirare gli aghi di iniezione (Figura 2). Assicurati che il filamento sia lungo 10 cm, con un diametro esterno di 1 mm e un diametro interno di 0,7 mm.
2. Tirare gli aghi utilizzando un estrattore laser per micropipette con uno dei due programmi seguenti:
   Programma 1: Calore 805, Filamento 4, Velocità 50, Ritardo 145, Tiro 145
   Programma 2: Calore 650, Filamento 4, Velocità 40, Ritardo 150, Tiro 156
   NOTA: Il programma 1 si traduce in una punta dell'ago più sottile ma più lunga, che lo rende adatto per iniezioni con costrutti a concentrazione inferiore, dove una punta più fine è vantaggiosa per la precisione. Il programma 2 produce una punta dell'ago più corta ma più spessa, ideale per iniezioni ad alta concentrazione, poiché il costrutto è più spesso e richiede un ago più robusto.

6. Prelievo di embrioni

1. Preparare un aspiratore elettrico o manuale per raccogliere le zanzare e utilizzare fiale di plastica per la raccolta e la raccolta degli embrioni.
2. Inumidire le carte da filtro bianche circolari e posizionarle sulla parete interna o sopra il cotone umido nel raccoglitore.
3. Metti 5-10 zanzare femmine che sono state nutrite con sangue 5-10 giorni fa nel raccoglitore. Posizionare il raccoglitore al buio per 45 min.
4. Estrarre la carta da filtro per la raccolta degli embrioni.

7. Allineamento degli embrioni

1. Utilizzare un ceppo wildtype (Liverpool) di A. aegypti per l'iniezione di embrioni.
2. Selezionare gli embrioni allo stadio di preblastoderma, in particolare quelli di colore grigio chiaro, dalla carta da raccolta (Figura 3).
3. Trasferisci alcuni embrioni con un pennello bagnato sul nastro biadesivo posizionato sopra un vetrino coprioggetti. Allinea gli embrioni in parallelo mentre i loro bordi sono ancora bagnati assicurandoti che siano fianco a fianco, con tutte le estremità posteriori rivolte in avanti.
4. Una volta posizionato correttamente, lasciare asciugare leggermente l'ambiente per fissare gli embrioni in posizione.
5. Aggiungere l'olio di alocarburi 700 sugli embrioni durante l'allineamento per evitare l'essiccazione.
   NOTA: Assicurati che gli embrioni non siano circondati dall'acqua quando aggiungi l'olio, poiché ciò farebbe galleggiare gli embrioni nell'olio.

8. Microiniezione di embrioni

NOTA: L'iniezione viene condotta a temperatura ambiente o a 18 °C. La temperatura di 18°C è consigliata per motivi pratici, in quanto ritarda lo sviluppo dell'embrione.

1. Impostare un microiniettore con i seguenti parametri: pressione di compensazione (Pc) 300 hPa, pressione di iniezione (Pi) 500 hPa. Regolare queste condizioni ogni volta che è necessario.
2. Caricare 3 μl del costrutto misto in un ago utilizzando un microcaricatore.
3. Posizionare il vetro di copertura con gli embrioni allineati sopra un vetrino da microscopio (Figura 3). Posizionare il vetro di copertura e farlo scorrere sotto il microscopio per l'iniezione. Assicurati che l'estremità posteriore dell'embrione sia posizionata verso l'ago.
4. Posizionare un ago in un portaaghi insieme a un micromanipolatore e posizionare l'ago con un angolo di 10° verso l'estremità posteriore degli embrioni allineati, mantenendolo fermo (Figura 4A). Aprire delicatamente l'ago al microscopio e toccarlo leggermente con il bordo di un vetrino coprioggetti.
   NOTA: Un'altra opzione è quella di creare una piccola apertura nell'ago picchiettandolo con un embrione. Tuttavia, si consiglia un'apertura dell'ago leggermente più ampia, poiché la viscosità della proteina Cas9 può ostruire l'ago.
5. Spostare il vetrino del vetrino verso l'ago per l'iniezione (Figura 5).

9. Cura dell'embrione iniettato

1. Usa salviette usa e getta prive di lanugine per rimuovere l'olio che circonda gli embrioni.
2. Aggiungere acqua deionizzata per sciacquare gli embrioni e spostare gli embrioni su una carta da filtro bagnata. Posizionare la carta da filtro bagnata su un fazzoletto umido all'interno di tazze Karat da 9 once (Figura 4B e Figura 6A, B).
3. Posizionare del cotone bagnato sul fondo della tazza per mantenere l'umidità (Figura 6B).
4. Conservare gli embrioni iniettati su carta da filtro bagnata.

10. Schiusa degli embrioni e screening delle larve G0

1. Almeno 4 giorni dopo l'iniezione, trasferire la carta da filtro con gli embrioni in circa 3 L di acqua deionizzata in pentole Sterilite da 6 quarti per la schiusa.
   NOTA: Le uova in genere si schiudono in modo più efficiente entro 2 settimane dall'iniezione. Assicurati che le uova rimangano umide durante questo periodo. La carta da filtro non deve essere troppo bagnata, poiché un'umidità eccessiva può portare a una schiusa precoce degli embrioni. Sebbene una conservazione più lunga possa migliorare i tassi di schiusa, non superare il mese per ottenere risultati ottimali. L'uso di acqua deossigenata può anche aiutare con la schiusa.
2. Una volta che le larve G0 si schiudono, aggiungi cibo per pesci mescolato con acqua nella padella come cibo.
3. Esaminare le larve G0 per il marcatore fluorescente allo stadio larvale dal 3° al 4° stadio (Figura 7).
4. Mantenere le larve separatamente in base al loro stato di fluorescenza, con le larve fluorescenti positive e fluorescenti negative tenute in vasche separate.

11. Selezione del sesso delle pupe e incrocio con il tipo selvatico

1. Separare le zanzare iniettate in base al sesso quando si impupano, utilizzando le dimensioni e le strutture specifiche del sesso nel lobo genitale per l'identificazione:
   1. Maschi: di dimensioni più piccole, un lobo genitale più prominente e appuntito e pale più larghe (strutture all'estremità della coda delle pupe; Figura 8A 1,A2).
   2. Femmine: dimensioni maggiori, lobo genitale più piccolo e meno pronunciato e pale più strette (Figura 8B1, B2).
2. Pool di zanzare fluorescenti positive o fluorescenti negative di ogni sesso.
3. Incrocia le zanzare raggruppate con zanzare del sesso opposto del ceppo Liverpool. Utilizzare un rapporto da 3:1 a 5:1 tra zanzara selvatica e zanzara G0.
4. Incrocia le zanzare per 4 giorni.
5. Fornisci alle femmine un pasto di sangue dopo l'attraversamento.

12. Vagliatura G1

1. Tre giorni dopo l'alimentazione del sangue, fornire portauova posizionando un tovagliolo di carta all'interno del muro di tazze da 9 once di Karat e aggiungendo circa 3 once di acqua deionizzata.
2. Dopo 3-4 giorni, raccogli e schiudi gli embrioni G1. Screening delle larve G1 per il marcatore fluorescente al 3° e 4° stadio (Figura 7).
3. Raccogli le larve fluorescenti, suggerendo un inserimento HDR. Quando gli individui fluorescenti G1 raggiungono lo stadio pupale, separali per sesso e metti ogni sesso in gabbie separate.
4. Incrocia le zanzare fluorescenti G1 con individui del sesso opposto del ceppo Liverpool.

13. Conferma del sito di inserimento G1

1. Dopo aver fornito il pasto di sangue, impostare le femmine G1 per la deposizione di un singolo ovulo femminile mettendo un piccolo pezzo di carta assorbente in singole fiale di Drosophila e aggiungendo 3 ml di acqua deionizzata.
2. Per i mutanti knockout:
   1. Dopo la deposizione delle uova, l'acqua evapora e il tovagliolo di carta si asciuga, schiude le uova dalle femmine che mostrano chiaramente mutazioni knockout e ottengono la generazione G2.
   2. Raccogli il corpo delle madri G1 che hanno schiuso con successo la prole G2 ed estrai il DNA.
   3. Utilizzare il DNA come modello per la PCR per amplificare la sequenza che copre il sito target. Assicurati che i primer amplifichino un frammento di DNA di ~200 bp. Impostare le reazioni (ciascuna contenente 12,5 μl della miscela master 2x, 1,25 μl della soluzione 10 μM di primer diretto, 1,25 μl della soluzione 10 μM di primer inverso, 9 μl di acqua ultrapura e 1 μl di DNA stampo [5 ng/μl]). Utilizzare le seguenti condizioni PCR: denaturazione iniziale per 30 s a 98 °C; 35 cicli di amplificazione per 10 s a 98 °C, 15-30 s a X °C (temperatura di ricottura ideale dei primer) e 10 s a 72 °C; prolungamento finale a 72 °C per 2 min; e stoccaggio finale a lungo termine a 4 °C.
   4. Purificare i frammenti di PCR ed eseguire la digestione con l'enzima di restrizione dei frammenti di PCR incubando una miscela di 1 μL di tampone digest di restrizione 10x, 0,5 μL di enzima di restrizione 1, 0,5 μL di enzima di restrizione 2, 1 μL di frammento PCR (200 ng/mL) e 7 μL di acqua ultrapura a 37 °C per 30 minuti.
      NOTA: Alcuni enzimi di restrizione possono essere utilizzati nella miscela PCR senza previa purificazione.
   5. Visualizzare la digestione dei frammenti PCR mediante elettroforesi su gel per confermare se si è verificata la scissione.
   6. Sequenziare il frammento di PCR non digerito per identificare le mutazioni knockout.
   7. Per gli inserimenti mediati da HDR, dopo la deposizione delle uova:
      1. Raccogli il corpo delle madri G1 ed estrai il DNA.
      2. Utilizzare il DNA come modello per la PCR per amplificare la sequenza che copre il sito target.
      3. Eseguire il sequenziamento del frammento di DNA amplificato per confermare l'integrità della cassetta di DNA inserita.
      4. Schiudi l'uovo e ottieni la generazione G2.

14. Ampliamento delle nuove linee CRISPR

1. Per le linee mutanti knockout:
   1. Prepara le femmine G2 per la deposizione delle uova, con 20 femmine per G1. Ogni G1 rappresenta una riga.
   2. Dopo la deposizione delle uova, confermare le mutazioni knockout allo stesso modo di G1.
   3. Procedere con cinque linee G1 che mostrano mutazioni chiaramente identificate sia in G1 che in G2. Schiudi le uova raccolte da G2 di ogni linea, dando origine alla generazione G3.
   4. Dalle cinque linee incrociate, selezionare due linee con mutazioni chiaramente identificate e alta fitness o il fenotipo desiderato.
   5. Incrocia le femmine G3 di ogni linea selezionata con i maschi del ceppo Liverpool.
   6. Prepara 50 femmine singole per la deposizione delle uova da ogni linea. Confermare le mutazioni knockout come fatto in precedenza per G1.
      NOTA: Aumenta il numero di femmine nella configurazione per mantenere la diversità.
   7. Ripetere le procedure per altre due generazioni con le due linee (Figura 4J).
2. Per le nuove linee di inserimento mediate da HDR:
   1. Verificare la presenza di individui fluorescenti nella generazione G2.
   2. Incrocia le zanzare G2, di ogni individuo G1, con il ceppo Liverpool. Ogni individuo G1 rappresenta una linea.
   3. Procedi con altre tre generazioni di outcrossing. Controllare continuamente il marcatore fluorescente e osservare la fitness¹⁹ di ciascuna linea (Figura 4x).
   4. Selezionare una linea con inserzioni corrette e alta fitness e il fenotipo desiderato.

15. Crea linee omozigoti

1. Per le linee mutanti knockout:
   1. Generazione G6:
      1. Schiudi le uova prodotte da G5 e ottieni la generazione G6.
      2. Incrociare gli adulti G6 all'interno delle rispettive linee (Figura 4K e Figura 9A).
      3. Prepara 50 femmine G6 singole per la deposizione delle uova per linea e fai schiudere le uova come descritto in precedenza (Figura 9B).
      4. Raccogliere le femmine G6 che hanno schiuso con successo la prole G7, estrarre il DNA ed eseguire la PCR e la digestione con enzimi di restrizione come fatto per G1 (Figura 9C).
         NOTA: In questa fase è possibile utilizzare un tampone di schiacciamento (SB) semplice ed economico per l'estrazione del DNA.
         1. Utilizzando un macinatore portatile, macerare una singola zanzara in 100 μl di 1x SB (10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA e 25 mM NaCl). Aggiungere la proteinasi K (200 μg/mL) e incubare a 37 °C per 30 minuti, quindi a 95 °C per 2 minuti. Centrifugare a 10.000 × g per 5 minuti e raccogliere il surnatante²⁰.
      5. Confermare la mutazione visualizzando i risultati su un gel.
      6. Scartare le uova prodotte dalle femmine senza mutazioni (Figura 9D).
      7. Mantenere le larve delle femmine con mutazioni confermate per stabilire diversi lignaggi G7 e scartare le covate senza mutazioni (Figura 9D).
   2. Generazione G7:
      1. Incrociare femmine e maschi all'interno di ciascun lignaggio G7 (Figura 9E).
      2. Prepara 10 femmine G7 singole per la deposizione delle uova per linea e schiudi le uova come descritto in precedenza (Figura 9F).
      3. Raccogli le femmine G7 che hanno schiuso con successo la prole G7, estrai il DNA ed esegui la PCR e la digestione con enzimi di restrizione (Figura 9G).
      4. Rileva le mutazioni knockout su entrambi gli alleli o su un singolo allele visualizzando i risultati su un gel.
      5. Mantenere le larve delle femmine G7 che hanno confermato di avere knockout in entrambi gli alleli, producendo la generazione G8 (Figura 9H). Scartare le covate senza mutazioni (Figura 9H).
         NOTA: Questo passaggio garantisce che le femmine siano omozigoti. In G8, testare l'omozigosi della progenie conferma se anche i padri sono omozigoti".
   3. Generazione G8:
      1. Incrociare gli adulti G8 per ogni lignaggio femminile G7 (Figura 9I).
      2. Scegli a caso cinque maschi G8, estrai il DNA ed esegui la PCR e la digestione con enzimi di restrizione (Figura 9J).
      3. Fornire un pasto di sangue e far schiudere le uova dalle femmine G8 che sono state incrociate con maschi G8 che hanno confermato di avere knockout in entrambi gli alleli.
      4. Continua con i lignaggi G7 in cui tutti i maschi rilevati hanno knockout in entrambi gli alleli, indicando che questi lignaggi sono omozigoti.
2. Per le linee di inserimento mediate da HDR:
   1. Schiudi le uova prodotte da G5 e ottieni la generazione G6. Screening delle larve allo stadio G6 per marcatori fluorescenti.
   2. Scartare le larve senza marcatori fluorescenti (Figura 4xi).
   3. Zanzare incrociate che mostrano marcatori fluorescenti.
   4. Continuare questa procedura per ogni generazione successiva fino a quando non si osservano larve non fluorescenti. A questo punto, la linea della zanzara sarà omozigote.

Risultati

Progettazione e validazione del gene targeting mediato da gRNA per la ricombinazione di omologia HDR
Per garantire che il gene desiderato sia mirato in modo accurato, si consiglia di selezionare un paio di gRNA e di posizionare i bracci di omologia 5' e 3' vicino al sito di taglio per la ricombinazione omologa mediata da HDR (Figura 1A). Ad esempio, abbiamo progettato due gRNA per colpire entrambi i lati d...

Discussione

La tecnologia CRISPR-Cas ha cambiato il panorama dell'editing del genoma promuovendo cambiamenti specifici del bersaglio nei cromosomi¹. Anche se gli elementi trasponibili sono stati essenziali per la generazione delle prime zanzare transgeniche, i loro siti di inserzione sono in qualche modo casuali e l'espressione del costrutto di carico (promotore + gene) potrebbe non corrispondere al profilo di espressione del gene effettivo a causa di un effetto posizionale d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Cas9 reaction buffer	PNA Bio	CB01
Benchling software	Benchling	N/A	www.benchling.com
Cas9 dilution buffer	PNA Bio	CB03
Cas9 protein	PNA Bio	CP01-50
DH5α E. coli Competent Cells	New England Biolabs	C2987
Double-sided sticky tape	Scotch Permanent	3136
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-109
Filter papers	GE Healthcare Life Science	1450-042
Fish food	Tetra	B00025Z6YI	goldfish flakes
Flugs	Genesee Scientific	AS273
Fluorescent microscope	Leica Microsystems	M165 FC
Gene fragment	Integrated DNA Technologies	N/A
gRNA	Synthego	N/A
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Injection microscope	Leica Microsystems	DM2000
JM109  E. coli Competent Cells	Zymo Research	T3005
Microinjector	Eppendorf		FemtoJet 4x
Microloader Tips for Filling Femtotips	Eppendorf	E5242956003
Micromanipulator	Eppendorf		TransferMan 4r
Micropipette Pullers	Sutter Instrument	P-2000
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-542-B
Microscope slide	Eisco	12-550-A3
Mouse blood (live mice used for feeding)	University of California	IACUC, Animal Use Protocol #S17187	Used for mosquito blood feeding; details comply with animal ethics protocols
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0491S
PCR Purification Kit	Qiagen	28004
Plasmid Miniprep Kit	Zymo Research	D4036
Quartz filament	Sutter Instruments	QF100-70-10
Transcription Clean-Up Kit	Fisher Scientific	AM1908
Ultra-pure water	Life Technologies	10977-023