Edição do genoma no mosquito da febre amarela Aedes aegypti usando CRISPR-Cas9

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para edição do genoma por meio de microinjeção embrionária no mosquito A. aegypti usando a tecnologia CRISPR-Cas9.

Resumo

O surgimento da tecnologia de repetições palindrômicas curtas agrupadas, regularmente intercaladas (CRISPR)-Cas9 revolucionou o campo da engenharia genética e abriu as portas para a edição precisa do genoma em várias espécies, incluindo organismos não modelo. No mosquito Aedes aegypti, mutações de perda de função e inserções de DNA foram realizadas com essa tecnologia. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para edição de genoma por meio de microinjeção embrionária no mosquito A. aegypti usando a tecnologia CRISPR-Cas9, com foco na geração de linhas de nocaute e knockin de genes. Neste protocolo, as agulhas de quartzo são preenchidas com uma mistura de RNA guia, Cas9 recombinante e um plasmídeo contendo um de DNA que codifica um gene para um marcador fluorescente, se o gene knockin for desejado. Os embriões no estágio de pré-blastoderma são alinhados em uma tira de fita adesiva dupla face colocada em uma lamínula, que é posteriormente montada em uma lâmina de vidro. Com a ajuda de um microinjetor, as agulhas são inseridas suavemente na extremidade posterior dos embriões e um pequeno volume da mistura CRISPR é dispensado. Quando os embriões são eclodidos, as larvas são verificadas sob o escopo fluorescente e as pupas são classificadas por sexo e separadas em gaiolas diferentes. Uma vez que os adultos emergem, eles são cruzados reciprocamente com indivíduos do tipo selvagem, alimentados com sangue e colocados para postura de ovos. Uma vez que esses ovos são eclodidos, as larvas fluorescentes coletadas representam indivíduos com inserção estável do de DNA em seu genoma. Essas larvas são então cultivadas até o estágio adulto, cruzadas para indivíduos do tipo selvagem e, em seguida, avaliadas por meio de técnicas moleculares para confirmar que a sequência exata do de DNA está presente no local desejado do genoma do mosquito. Linhas homozigóticas também podem ser obtidas seguindo o pipeline fornecido de esquema de cruzamento e triagem molecular das mutações.

Introdução

A edição precisa do genoma tornou-se indiscutivelmente mais fácil, mas possível, com o estabelecimento das tecnologias CRISPR-Cas de tesouras moleculares¹. Essas tecnologias aproveitam um mecanismo que o sistema imunológico procariótico usa para combater infecções por fagos². Entre esses sistemas, repetições palindrômicas curtas agrupadas, regularmente intercaladas (CRISPR), juntamente com a nuclease Cas9, geralmente dependem de 20 RNAs de pares de bases, os RNAs guia (gRNAs), com sequências homólogas ao DNA alvo, que são seguidas por uma sequência de motivo adjacente ao protoespaçador NGG (PAM)³. Os gRNAs carregados no Cas9 guiam essas nucleases precisamente para locais-alvo específicos no genoma, desencadeando quebras de DNA de fita dupla³.

As quebras de fita dupla de DNA induzem os mecanismos de reparo a remendar a dupla hélice⁴. Embora se espere que qualquer reparo de DNA seja preciso, existem mecanismos de reparo de DNA menos precisos que podem deixar cicatrizes de sequência e, por sua vez, mutações de perda de função⁴. Entre os mecanismos de reparo de DNA propensos a erros, o Non-Homousus End-Joining (NHEJ) pode causar mutações de mudança de quadro, incluindo pequenas deleções, inserções e alterações de nucleotídeos (SNPs), que podem resultar em mutação de perda de função. O mecanismo de Reparo Dirigido por Homologia (HDR), por outro lado, depende do cromossomo homólogo como modelo para copiar a sequência exata do alelo não danificado e fazer um reparo perfeito da sequência de DNA alvo⁴.

Com base nesse conhecimento, a tecnologia CRISPR-Cas9 foi desenvolvida para editar genomas com precisão, sem dúvida em qualquer sequência contendo um sítio PAM³. Em mosquitos, a tecnologia CRISPR-Cas9 tem sido usada para nocautear uma variedade de genes, por meio da microinjeção embrionária de uma mistura de Cas9 e gRNAs, aproveitando o mecanismo de reparo do NHEJ ^5,6. Mutagênese germinativa semelhante é obtida com a injeção da mistura gRNA + Cas9 na hemolinfa de mosquitos fêmeas adultas⁷. Essa tecnologia foi denominada ReMOT control e se baseia em uma versão modificada de um Cas9 marcado com um peptídeo que é absorvido pelos ovários por meio de endocitose durante o processo de desenvolvimento do óvulo (vitelogênese)⁷. A inserção de de genes específicos em um genoma só é possível por meio da microinjeção embrionária de uma mistura de gRNA e Cas9 (ou um plasmídeo expressando essas moléculas) junto com um plasmídeo que codifica um de DNA desejado⁸. Aproveitando o mecanismo HDR, o plasmídeo contendo o de DNA de interesse flanqueado por sequências homólogas (500-1.000 pb) ^{9 , 10} a montante e a jusante do local alvo é usado como modelo para reescrever a quebra de fita dupla, copiando também o de DNA para a sequência alvo⁹.

A tecnologia CRISPR-Cas9 tem sido usada para eliminar vários genes envolvidos principalmente com os sistemas sensoriais do mosquito Aedes aegypti¹¹, mas também genes associados à fertilidade masculina e viabilidade feminina (PgSIT) para controle populacional¹². A eliminação de genes-alvo também foi realizada pela inserção de genes que codificam marcadores fluorescentes nas sequências codificantes de genes específicos^13,14. Essa estratégia tem a vantagem de não apenas induzir mutações frame-shift, mas também permitir o uso de luz fluorescente para classificar os indivíduos da nova linha de nocaute ^13,14. O genoma do A. aegypti também foi editado com sequências de sistemas de expressão binária, como o sistema Q (QF-QUAS⁾¹¹. A introdução do gene que codifica o transativador QF a jusante de um promotor de um gene específico garante a expressão espaço-temporal definida do transativador ^15,16. Uma vez que uma linha de mosquito que expressa QF é cruzada com outra linha de mosquito contendo os locais de ligação (QUAS) para QF, este último se liga a ela e desencadeia a expressão de genes a jusante da sequência QUAS^15,16. Esse sistema, em geral, permite a expressão específica do tecido e do tempo de tais genes efetores, que podem ser marcadores fluorescentes usados para localização celular ou detecção de atividade neuronal, e até mesmo nucleases Cas9 para interromper genes em tecidos específicos (ou seja, nocaute somático)¹¹.

Dadas todas as informações disponíveis para a transformação genética do A. aegypti , fornecemos aqui um protocolo detalhado com instruções passo a passo para realizar a edição do genoma com o sistema CRISPR-Cas9 por meio de microinjeção embrionária. Estratégias para gerar knockout, por meio de mutações e deleções de mudança de quadro mediadas por NHEJ, e linhas knockin, por inserções de de genes mediadas por HDR, são discutidas.

Protocolo

Os detalhes relacionados aos equipamentos e reagentes utilizados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais. Todos os animais foram manipulados seguindo o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, conforme recomendado pelo National Institutes of Health. Os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UCSD (IACUC, Protocolo de Uso de Animais #S17187) e pela Autorização de Uso Biológico da UCSD (BUA #R2401).

1. gRNAs e design de plasmídeo de doadores

1. Para fazer mutantes knockout, projete dois gRNAs espaçados por ~ 20-100 bp ( Figura 1A ).
   1. Projete gRNAs de 20 pb para CRISPR-Cas9, excluindo a sequência PAM (NGG) usando uma ferramenta online (Figura 1A), como CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/)¹⁷ou Benchling (benchling.com) ou CRISPOR (http://crispor.gi.ucsc.edu/)¹⁸. Selecione os gRNAs mais específicos e livres de alvos para experimentos, conforme sugerido pela ferramenta online.
   2. Certifique-se de que um local de corte de enzima de restrição eficiente seja incluído na sequência entre os locais de corte de gRNA (Figura 1A). Inclua um local de enzima de restrição entre os locais de corte do gRNA para permitir a confirmação visual rápida de edições bem-sucedidas.
      NOTA: Quando ocorre a deleção, o local de restrição é removido, de modo que a enzima não cortará a sequência, produzindo uma única banda não cortada em um gel para confirmar a exclusão.
2. Para inserções de de genes mediadas por HDR, projete vários gRNAs usando as ferramentas mencionadas para fazer mutantes knockout e selecione o mais eficaz após avaliação posterior.
3. Projete plasmídeos doadores para reparo dirigido por homologia (HDR) contendo braços de homologia do local alvo, a sequência de DNA de carga, um marcador fluorescente, a origem da replicação e um gene de resistência a antibióticos (Figura 1B).
   1. Escolha os braços de homologia das regiões a montante e a jusante do local alvo, cada um abrangendo 500-1.000 pb¹⁰ (Figura 1B).
   2. Selecione a sequência de carga, que pode incluir um marcador fluorescente, um gene de interesse ou um elemento regulador (por exemplo, QF2).
   3. Selecione um marcador fluorescente. Marcadores fluorescentes comuns usados para A. aegypti estão incluídos em um de DNA contendo um promotor, um gene codificador de marcador fluorescente e uma sequência 3' UTR. Veja a discussão para mais detalhes.

2. Preparação da mistura de injeção

1. Diluir a proteína Cas9 com o tampão de diluição Cas9 até 1 μg/μl.
   NOTA: Não descongele e congele Cas9 mais de 2x. É aconselhável fazer alíquotas da proteína Cas9.
2. Compre os gRNAs ou produza-os internamente.
   NOTA: Para produção interna, use práticas padrão de descontaminação de RNA e materiais livres de RNAse.
   1. Projete 4-6 gRNAs e escolha os dois melhores gRNAs para injeção (veja o ensaio de clivagem in vitro abaixo).
   2. Projete um primer direto que inclua a sequência do promotor T7 a montante da sequência de gRNA. Use o primer reverso universal de gRNA para as reações de PCR não modelo, conforme descrito abaixo. A base da sequência sobreposta emparelha-se com a sequência correspondente no primer reverso universal (negrito e sublinhado), criando um modelo para a DNA polimerase amplificar suas sequências.
      NOTA: Para essas reações de PCR, o primer direto deve conter o promotor T7 (negrito), seguido por duas guaninas (importante para o início da transcrição via RNA polimerase T7), a sequência de 20 nucleotídeos do gRNA (N₂₀; sem a sequência PAM) e a sequência de sobreposição do primer (sublinhado).
      Primer para a frente: 5'- GAAATTAATACGACTCACTATAGGN₂₀ GTTTTAGAGCTAGAAATAGC- 3'
      Primer reverso: 5 '' - AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTT CAAGTTGATAACGGACTAGC
      CTTATT TTAACTT GCTATTTCTAGCTCTAAAAC - 3'
   3. Sintetize o molde de DNA por PCR sem molde. Configure várias reações (cada uma contendo 12,5 μL da mistura principal 2x, 1,25 μL da solução de 10 μM de primer direto, 1,25 μL da solução de 10 μM de primer reverso e 10 μL de água ultrapura) para que produto de PCR suficiente (300 ng) esteja disponível para a reação de transcrição in vitro . Utilizar as seguintes condições de PCR: desnaturação inicial durante 30 s a 98 °C; 35 ciclos de amplificação durante 10 s a 98 °C, 10 s a 62 °C e 10 s a 72 °C; extensão final a 72 °C por 2 min; e armazenamento a 4 °C.
   4. Confirme a amplificação de um único fragmento de DNA (122 pares de bases) em um gel de agarose (2%).
   5. Limpe o modelo de PCR usando um kit de purificação de PCR, seguindo as recomendações do fabricante.
   6. Realize uma reação de transcrição in vitro com um kit de transcrição T7. Misture 2 μL de tampão de reação 10x, 2 μL de nucleotídeos (ATP, CTP, UTP e GTP), 2 μL de RNA polimerase T7, 3 μL do DNA molde (100 ng/μL) e 5 μL de água ultrapura. Incubar a mistura a 37 °C durante pelo menos 2 h (não mais de 16 h) a uma noite (12 h).
      NOTA: Nesta reação, a RNA polimerase T7 se liga ao promotor T7 incluído na sequência direta do primer, o que leva à transcrição do gRNA.
   7. Trate a reação de transcrição com DNase adicionando 1 μL de DNase (misture bem) e incubando a 37 ° C por 15 min.
   8. Purifique os sgRNAs sintetizados com um kit de limpeza de transcrição seguindo as recomendações do fabricante.
   9. Realize um ensaio de clivagem in vitro para avaliar a eficiência de corte dos gRNAs selecionados (Figura 1C).
      1. Projete primers para amplificar um fragmento de DNA (500-1.000 pb) flanqueando o local de corte do gRNA.
      2. Configure as reações de PCR da seguinte forma: 12,5 μL da mistura principal 2x, 1,25 μL da solução de 10 μM de primer direto, 1,25 μL da solução de 10 μM de primer reverso, 9 μL de água ultrapura e 1 μL de DNA molde de 5 ng/μL.
      3. Utilizar as seguintes condições de PCR: condições: desnaturação inicial durante 30 s a 98 °C; 35 ciclos de amplificação por 10 s a 98 °C, 15-30 s a X °C (temperatura ideal de recozimento para primers) e 35 s a 72 °C; extensão final a 72 °C por 2 min; e armazenamento final a longo prazo a 4 °C.
      4. Consulte as diretrizes do fabricante para obter as melhores temperaturas de amplificação e intervalo de tempo. Agrupe pelo menos cinco reações ou aumente os volumes dos reagentes para que produto de PCR suficiente (1,5-2 μg) seja obtido após a limpeza da PCR (banda única) ou purificação da banda de PCR em gel de agarose.
      5. Configure as reações de clivagem de Cas9 com Cas9 recombinante incubando a seguinte mistura a 37 ° C por 1 h: 1 μL de tampão de reação 10x Cas9, 0,35 μL de Cas9 recombinante (1 μg / μL), 1 μL de gRNA (100 ng / μL), 6,65 μL de água ultrapura e 1 μL de 300 ng / μL de DNA molde.
      6. Configure uma reação de controle negativo sem nenhum gRNA.
      7. Verifique a eficiência da clivagem executando reações em um gel de agarose (1,5-2,0%; Figura 1C).

3. Montagem do plasmídeo doador

1. PCR-amplifica os braços de homologia do DNA genômico de A. aegypti.
   1. Para o design do primer, consulte as diretrizes do fabricante do kit de clonagem. Use uma ferramenta online (por exemplo, Benchling), que fornece suporte para design e montagem de plasmídeos usando diferentes estratégias de clonagem (por exemplo, Gibson, Golden Gate e clonagem baseada em enzimas de restrição).
   2. Amplifique a sequência de carga do DNA genômico de A. aegypti ou solicite um fragmento de gene sintetizado comercialmente.
   3. Amplificar marcadores fluorescentes de plasmídeos internamente.
2. Ligue fragmentos de DNA das etapas 3.1.1 a 3.1.3 na espinha dorsal de um plasmídeo existente pela montagem de Gibson. Incubar uma mistura de 10 μL de 2x master mix, X μL de todos os fragmentos de DNA, 10-X μL de água ultrapura a 50 °C por 1 h.
   NOTA: Consulte as diretrizes do fabricante para calcular a proporção ideal de insertos para a estrutura do plasmídeo.
   1. Calcule as concentrações de cada fragmento de clonagem em pico mols: pmols = (peso em ng) × 1.000/(pares de bases × 650 daltons).
   2. Use 50-100 ng de esqueleto de plasmídeo e excesso molar de 2-3 vezes de cada inserto.
   3. Se estiver montando 2-3 fragmentos, adicione 0,02-0,5 pmols de cada fragmento na reação de Gibson. Se estiver montando 4-6 fragmentos, adicione 0,2-1,0 pmols de cada um.
3. Use 3-5 μL da reação de montagem de Gibson para transformar células competentes para E. coli JM109.
   NOTA: O JM109 foi escolhido para a montagem de Gibson devido ao seu genótipo recA- , que reduz eventos indesejáveis de recombinação e evita o transporte de nuclease durante a colheita celular, garantindo a integridade dos fragmentos de DNA montados
   Para plasmídeos maiores que 10 kb, recomendamos a transformação de células competentes para DH5α usando o protocolo estendido, seguindo as recomendações do fabricante.
4. Expanda as bactérias transformadas e purifique o plasmídeo usando um kit de minipreparação.
5. Para confirmação da montagem correta do plasmídeo, execute uma digestão diagnóstica da enzima de restrição com o DNA do plasmídeo purificado e visualize por eletroforese em gel de agarose ( Figura 1D , E ).
   NOTA: Sugerimos o uso de uma ferramenta online para a seleção de algumas enzimas de restrição que podem cortar o plasmídeo em um único local. Softwares como o Benchling possuem uma ferramenta integrada que realiza a digestão virtual de sequências de plasmídeos com as enzimas de restrição selecionadas, exibindo o padrão de banda de DNA esperado em um gel de eletroforese virtual (Figura 1D).
   1. Efectuar a digestão da enzima de restrição do plasmídeo. Incubar uma mistura de 1 μL de tampão de digestão de restrição 10x, 0,5 μL de enzima de restrição 1, 0,5 μL de enzima de restrição 2, 1 μL de DNA de plasmídeo (300 ng/mL) e 7 μL de água ultrapura a 37 °C por 2 h.
   2. Execute as reações de digestão de restrição em um gel de agarose (1,5%).
      NOTA: O padrão de banda de DNA (Figura 1E) deve se assemelhar ao padrão de banda de resumo virtual (Figura 1D). Os plasmídeos também podem ser enviados para sequenciamento de plasmídeo completo se o serviço estiver disponível.
6. Cultive o clone do plasmídeo em 150 mL de meio LB.
7. Realize o plasmídeo maxiprep, seguindo as orientações do fabricante.
8. Suspender o plasmídeo em água ultrapura.

4. Misturando a construção de injeção

NOTA: As faixas de concentração final sugeridas para cada construto são fornecidas na Tabela 1. Comece com uma proporção de 2:1:2 (ng Cas9: ng sgRNA: ng plasmídeo doador) e ajuste conforme necessário para otimizar a eficiência do HDR. O monitoramento dos resultados ajudará a identificar a combinação mais eficaz.

1. Para fazer mutantes nocaute,
   1. Diluir a alíquota da proteína Cas9 até à concentração desejada utilizando o tampão de diluição Cas9 e diluir a alíquota do RNAg com água ultrapura.
   2. Pré-misture a proteína Cas9 com cada gRNA para formar um complexo de ribonucleoproteína (RNP). Combine as soluções pré-misturadas.
2. Para inserções de de genes mediadas por HDR,
   1. Dilua e misture a proteína Cas9 e os gRNAs conforme sugerido para fazer mutantes nocaute.
   2. Diluir o plasmídeo dador com água ultrapura.
   3. Combine todas as construções.

5. Puxando e carregando agulhas de microinjeção

1. Use filamento de quartzo para puxar as agulhas de injeção (Figura 2). Certifique-se de que o filamento tenha 10 cm de comprimento, com um diâmetro externo de 1 mm e um diâmetro interno de 0,7 mm.
2. Puxe as agulhas usando um extrator de micropipeta a laser com um dos dois programas a seguir:
   Programa 1: Calor 805, Filamento 4, Velocidade 50, Atraso 145, Tração 145
   Programa 2: Calor 650, Filamento 4, Velocidade 40, Atraso 150, Tração 156
   NOTA: O programa 1 resulta em uma ponta de agulha mais fina, porém mais longa, tornando-o adequado para injeções com construções de concentração mais baixa, onde uma ponta mais fina é benéfica para a precisão. O programa 2 produz uma ponta de agulha mais curta, porém mais grossa, ideal para injeções de maior concentração, pois a construção é mais espessa e requer uma agulha mais resistente.

6. Colheita de embriões

1. Prepare um aspirador elétrico ou manual para coletar mosquitos e use frascos de plástico para coleta e coleta de embriões.
2. Umedeça os papéis de filtro de círculo branco e coloque-os na parede interna ou em cima do algodão úmido no coletor.
3. Coloque de 5 a 10 mosquitos fêmeas que foram alimentadas com sangue há 5 a 10 dias no coletor. Coloque o coletor no escuro por 45 min.
4. Retire os papéis de filtro para a colheita de embriões.

7. Linha de embriões

1. Use uma cepa selvagem (Liverpool) de A. aegypti para injeção de embriões.
2. Selecione embriões em estágio de pré-blastoderma, particularmente aqueles de cor cinza claro, do papel de colheita (Figura 3).
3. Transfira alguns embriões com um pincel umedecido para a fita adesiva dupla face colocada em cima de uma lamínula. Alinhe os embriões em paralelo enquanto seus arredores ainda estão molhados, garantindo que estejam lado a lado, com todas as extremidades posteriores voltadas para a frente.
4. Uma vez posicionado corretamente, deixe o ambiente secar um pouco para prender os embriões no lugar.
5. Adicione óleo de halocarbono 700 aos embriões durante o alinhamento para evitar a dessecação.
   NOTA: Certifique-se de que os embriões não estejam cercados por água ao adicionar o óleo, pois isso faria com que os embriões flutuassem no óleo.

8. Microinjeção de embriões

NOTA: A injeção é realizada à temperatura ambiente ou a 18 °C. A temperatura de 18°C é recomendada por razões práticas, pois atrasa o desenvolvimento do embrião.

1. Configure um microinjetor com os seguintes parâmetros: pressão de compensação (Pc) 300 hPa, pressão de injeção (Pi) 500 hPa. Ajuste essas condições sempre que necessário.
2. Carregue 3 μL da construção mista em uma agulha usando um microcarregador.
3. Coloque a lamínula com embriões alinhados em cima de uma lâmina de microscópio (Figura 3). Posicione a lamínula e deslize sob o microscópio para injeção. Certifique-se de que a extremidade posterior do embrião esteja posicionada em direção à agulha.
4. Coloque uma agulha em um porta-agulha junto com um micromanipulador e posicione a agulha em um ângulo de 10° em direção à extremidade posterior dos embriões alinhados, mantendo-a estacionária (Figura 4A). Abra suavemente a agulha sob um microscópio e toque-a levemente com a ponta de uma lamínula.
   NOTA: Outra opção é criar uma pequena abertura na agulha batendo nela com um embrião. No entanto, recomenda-se uma abertura de agulha um pouco mais larga, pois a viscosidade da proteína Cas9 pode entupir a agulha.
5. Mova o vidro deslizante em direção à agulha para injeção (Figura 5).

9. Cuidados posteriores ao embrião injetado

1. Use lenços descartáveis e sem fiapos para remover o óleo ao redor dos embriões.
2. Adicione água deionizada para enxaguar os embriões e mova os embriões para um papel de filtro úmido. Coloque o papel de filtro úmido em um lenço úmido dentro de copos Karat de 9 onças (Figura 4B e Figura 6A,B).
3. Coloque o algodão úmido no fundo do copo para manter a umidade (Figura 6B).
4. Conservar os embriões injectados em papel de filtro húmido.

10. Eclosão de embriões e triagem de larvas G0

1. Pelo menos 4 dias após a injeção, transfira o papel de filtro com embriões para aproximadamente 3 L de água deionizada em panelas Sterilite de 6 litros para incubação.
   NOTA: Os ovos normalmente eclodem com mais eficiência dentro de 2 semanas após a injeção. Certifique-se de que os ovos permaneçam úmidos durante este período. O papel de filtro não deve estar muito úmido, pois a umidade excessiva pode levar à eclosão precoce dos embriões. Embora a preservação mais longa possa melhorar as taxas de eclosão, não exceda um mês para obter os melhores resultados. O uso de água desoxigenada também pode ajudar na eclosão.
2. Assim que as larvas G0 eclodirem, adicione comida de peixe misturada com água à panela como alimento.
3. Rastreie as larvas G0 para o marcador fluorescente no estágio larval de 3º a 4º ínstar (Figura 7).
4. Mantenha as larvas separadamente com base em seu status fluorescente, com larvas fluorescentes positivas e fluorescentes negativas mantidas em panelas separadas.

11. Pupas de classificação sexual e cruzamento com o tipo selvagem

1. Separe os mosquitos injetados por sexo quando eles se transformam em pupa, usando estruturas específicas de tamanho e sexo no lobo genital para identificação:
   1. Machos: Tamanho menor, lobo genital mais proeminente e pontiagudo e pás mais largas (estruturas na extremidade da cauda das pupas; Figura 8A 1,A2).
   2. Fêmeas: Tamanho maior, lobo genital menor e menos pronunciado e pás mais estreitas (Figura 8B1, B2).
2. Agrupar mosquitos fluorescentes positivos ou negativos fluorescentes de cada sexo.
3. Cruze os mosquitos agrupados com mosquitos do sexo oposto da cepa Liverpool. Use uma proporção de 3:1 a 5:1 do tipo selvagem para o mosquito G0.
4. Atravesse os mosquitos por 4 dias.
5. Forneça às fêmeas uma refeição de sangue após a travessia.

12. Triagem G1

1. Três dias após a alimentação com sangue, forneça copos de ovos colocando uma toalha de papel dentro da parede dos copos Karat de 9 onças e adicionando cerca de 3 onças de água deionizada.
2. Após 3-4 dias, colha e ecloda os embriões G1. Rastreie as larvas G1 para o marcador fluorescente nos estágios de 3º a 4º ínstar (Figura 7).
3. Colete as larvas fluorescentes, sugerindo uma inserção de HDR. Quando os indivíduos fluorescentes G1 atingirem o estágio de pupa, separe-os por sexo e coloque cada sexo em gaiolas separadas.
4. Cruze os mosquitos fluorescentes G1 com indivíduos do sexo oposto da cepa Liverpool.

13. Confirmação do local de inserção G1

1. Depois de fornecer a refeição de sangue, prepare as fêmeas G1 para postura de ovos de fêmeas únicas, colocando um pequeno pedaço de papel toalha em frascos individuais de Drosophila e adicionando 3 mL de água deionizada.
2. Para mutantes knockout:
   1. Após a postura dos ovos, a água evapora e a toalha de papel seca, choca os ovos das fêmeas que exibem claramente mutações nocaute e obtém a geração G2.
   2. Colete o corpo das mães G1 que eclodiram com sucesso a prole G2 e extraia o DNA.
   3. Use o DNA como modelo para PCR para amplificar a sequência que cobre o local alvo. Certifique-se de que os primers amplificam um fragmento de DNA de ~ 200 pb. Configure as reações (cada uma contendo 12,5 μL da mistura principal 2x, 1,25 μL da solução de 10 μM de primer direto, 1,25 μL da solução de 10 μM de primer reverso, 9 μL de água ultrapura e 1 μL de DNA molde [5 ng/μL]). Utilizar as seguintes condições de PCR: desnaturação inicial durante 30 s a 98 °C; 35 ciclos de amplificação por 10 s a 98 °C, 15-30 s a X °C (temperatura ideal de recozimento dos primers) e 10 s a 72 °C; extensão final a 72 °C por 2 min; e armazenamento final a longo prazo a 4 °C.
   4. Purifique os fragmentos de PCR e realize a digestão enzimática de restrição dos fragmentos de PCR incubando uma mistura de 1 μL de tampão de digestão de restrição 10x, 0,5 μL de enzima de restrição 1, 0,5 μL de enzima de restrição 2, 1 μL de fragmento de PCR (200 ng/mL) e 7 μL de água ultrapura a 37 °C por 30 min.
      NOTA: Certas enzimas de restrição podem ser usadas na mistura de PCR sem purificação prévia.
   5. Visualize a digestão do fragmento de PCR por eletroforese em gel para confirmar se ocorreu clivagem.
   6. Sequencie o fragmento de PCR não digerido para identificar as mutações nocaute.
   7. Para inserções mediadas por HDR, após a postura:
      1. Colete o corpo das mães G1 e extraia o DNA.
      2. Use o DNA como modelo para PCR para amplificar a sequência que cobre o local alvo.
      3. Realize o sequenciamento do fragmento de DNA amplificado para confirmar a integridade do de DNA inserido.
      4. Chocar o ovo e obter a geração G2.

14. Expandindo as novas linhas CRISPR

1. Para linhagens mutantes nocaute:
   1. Configure fêmeas G2 para postura de ovos, com 20 fêmeas por G1. Cada G1 representa uma linha.
   2. Após a postura dos ovos, confirme as mutações nocaute da mesma maneira que para G1.
   3. Prossiga com cinco linhagens G1 que exibem mutações claramente identificadas em G1 e G2. Chocar os ovos coletados do G2 de cada linhagem, dando origem à geração G3.
   4. Das cinco linhas cruzadas, selecione duas linhas com mutações claramente identificadas e alta aptidão ou o fenótipo desejado.
   5. Cruze fêmeas G3 de cada linhagem selecionada com machos da linhagem Liverpool.
   6. Configure 50 fêmeas solteiras para postura de ovos de cada linhagem. Confirme as mutações nocaute como feito anteriormente para G1.
      NOTA: Aumente o número de mulheres na configuração para manter a diversidade.
   7. Repita os procedimentos por mais duas gerações com as duas linhas (Figura 4J).
2. Para novas linhas de inserções mediadas por HDR:
   1. Verificar a presença de indivíduos fluorescentes na geração G2.
   2. Cruze os mosquitos G2, de cada indivíduo G1, com a cepa Liverpool. Cada indivíduo G1 representa uma linha.
   3. Prossiga com mais três gerações de cruzamentos. Verifique continuamente o marcador fluorescente e observe a adequação¹⁹ de cada linha (Figura 4x).
   4. Selecione uma linha com inserções corretas e alta aptidão e o fenótipo desejado.

15. Faça linhas homozigóticas

1. Para linhagens mutantes nocaute:
   1. Geração G6:
      1. Chocar os ovos produzidos pelo G5 e obter a geração G6.
      2. Intercruze adultos G6 dentro de suas respectivas linhas (Figura 4K e Figura 9A).
      3. Configure 50 fêmeas G6 solteiras para postura de ovos por linha e choque os ovos conforme descrito anteriormente (Figura 9B).
      4. Colete as fêmeas G6 que eclodiram com sucesso a prole G7, extraia o DNA e realize PCR e digestão da enzima de restrição como feito para G1 (Figura 9C).
         NOTA: Um tampão de compressão simples e barato (SB) pode ser usado nesta etapa para extração de DNA.
         1. Usando um moedor portátil, macere um único mosquito em 100 μL de 1x SB (10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA e 25 mM NaCl). Adicione a proteinase K (200 μg/mL) e incube a 37 °C por 30 min, seguido de 95 °C por 2 min. Gire para baixo a 10.000 × g por 5 min e colete o sobrenadante²⁰.
      5. Confirme a mutação visualizando os resultados em um gel.
      6. Descarte os ovos produzidos por fêmeas sem mutações (Figura 9D).
      7. Mantenha larvas de fêmeas com mutações confirmadas para estabelecer várias linhagens G7 e descarte ninhadas sem mutações (Figura 9D).
   2. Geração G7:
      1. Intercruze fêmeas e machos dentro de cada linhagem G7 (Figura 9E).
      2. Configure 10 fêmeas G7 únicas para postura de ovos por linha e choque os ovos conforme descrito anteriormente (Figura 9F).
      3. Colete as fêmeas G7 que eclodiram com sucesso a prole G7, extraia DNA e realize PCR e digestão de enzimas de restrição (Figura 9G).
      4. Detecte mutações nocaute em ambos os alelos ou em um único alelo visualizando os resultados em um gel.
      5. Manter larvas de fêmeas G7 confirmadas com nocautes em ambos os alelos, produzindo a geração G8 (Figura 9H). Descarte as ninhadas sem mutações (Figura 9H).
         NOTA: Esta etapa garante que as fêmeas sejam homozigóticas. No G8, testar a homozigosidade da progênie confirma se os pais também são homozigotos.
   3. Geração G8:
      1. Cruze adultos G8 para cada linhagem feminina G7 (Figura 9I).
      2. Escolha aleatoriamente cinco machos G8, extraia DNA e realize PCR e digestão de enzimas de restrição (Figura 9J).
      3. Forneça uma refeição de sangue e choque os ovos de fêmeas G8 que foram cruzadas com machos G8 confirmados como nocautes em ambos os alelos.
      4. Continue com as linhagens G7 onde todos os machos detectados têm nocautes em ambos os alelos, indicando que essas linhagens são homozigotos.
2. Para linhas de inserções mediadas por HDR:
   1. Chocar os ovos produzidos pelo G5 e obter a geração G6. Filtre as larvas no estágio G6 para marcadores fluorescentes.
   2. Descarte as larvas sem marcadores fluorescentes (Figura 4xi).
   3. Mosquitos cruzados que exibem marcadores fluorescentes.
   4. Continue este procedimento para cada geração subsequente até que nenhuma larva não fluorescente seja observada. Neste ponto, a linha do mosquito será homozigótica.

Resultados

Desenho e validação de direcionamento de genes mediados por gRNA para recombinação de homologia HDR
Para garantir que o gene desejado seja direcionado com precisão, recomendamos selecionar alguns gRNAs e posicionar os braços de homologia 5 'e 3' próximos ao local de corte para recombinação homóloga mediada por HDR ( Figura 1A ). Por exemplo, projetamos dois gRNAs para atingir ambos os lados do c?...

Discussão

A tecnologia CRISPR-Cas mudou o cenário da edição do genoma, promovendo mudanças específicas do alvo nos cromossomos¹. Embora os elementos transponíveis tenham sido essenciais para a geração dos primeiros mosquitos transgênicos, seus locais de inserção são um tanto aleatórios, e a expressão da construção de carga (promotor + gene) pode não corresponder ao perfil de expressão do gene real devido a um efeito posicional do genoma (ou seja, local de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Cas9 reaction buffer	PNA Bio	CB01
Benchling software	Benchling	N/A	www.benchling.com
Cas9 dilution buffer	PNA Bio	CB03
Cas9 protein	PNA Bio	CP01-50
DH5α E. coli Competent Cells	New England Biolabs	C2987
Double-sided sticky tape	Scotch Permanent	3136
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-109
Filter papers	GE Healthcare Life Science	1450-042
Fish food	Tetra	B00025Z6YI	goldfish flakes
Flugs	Genesee Scientific	AS273
Fluorescent microscope	Leica Microsystems	M165 FC
Gene fragment	Integrated DNA Technologies	N/A
gRNA	Synthego	N/A
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Injection microscope	Leica Microsystems	DM2000
JM109  E. coli Competent Cells	Zymo Research	T3005
Microinjector	Eppendorf		FemtoJet 4x
Microloader Tips for Filling Femtotips	Eppendorf	E5242956003
Micromanipulator	Eppendorf		TransferMan 4r
Micropipette Pullers	Sutter Instrument	P-2000
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-542-B
Microscope slide	Eisco	12-550-A3
Mouse blood (live mice used for feeding)	University of California	IACUC, Animal Use Protocol #S17187	Used for mosquito blood feeding; details comply with animal ethics protocols
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0491S
PCR Purification Kit	Qiagen	28004
Plasmid Miniprep Kit	Zymo Research	D4036
Quartz filament	Sutter Instruments	QF100-70-10
Transcription Clean-Up Kit	Fisher Scientific	AM1908
Ultra-pure water	Life Technologies	10977-023