Sarı Humma Sivrisineği Aedes aegypti'de CRISPR-Cas9 Kullanılarak Genom Düzenleme

Özet

Burada, CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak sivrisinek A. aegypti'de embriyonik mikroenjeksiyon yoluyla genom düzenleme için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Özet

Kümelenmiş, düzenli olarak serpiştirilmiş, kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)-Cas9 teknolojisinin ortaya çıkışı, genetik mühendisliği alanında devrim yarattı ve model olmayan organizmalar da dahil olmak üzere birçok türde hassas genom düzenlemesi için kapıları açtı. Sivrisinek Aedes aegypti'de, fonksiyon kaybı mutasyonları ve DNA eklemeleri bu teknoloji ile gerçekleştirilmiştir. Burada, CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak sivrisinek A. aegypti'de embriyonik mikroenjeksiyon yoluyla genom düzenleme için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz ve hem gen nakavt hem de knockin hatlarının oluşturulmasına odaklanıyoruz. Bu protokolde kuvars iğneleri, gen knockin isteniyorsa, kılavuz RNA, rekombinant Cas9 ve bir floresan markör için bir geni kodlayan bir DNA kaseti içeren bir plazmit karışımı ile doldurulur. Preblastoderm aşamasındaki embriyolar, daha sonra bir cam slayt üzerine monte edilen bir lamel üzerine yerleştirilmiş çift taraflı yapışkan bir bant şeridi üzerine dizilir. Bir mikroenjektör yardımıyla, iğneler embriyoların arka ucuna nazikçe yerleştirilir ve küçük bir hacimde CRISPR karışımı dağıtılır. Embriyolar yumurtadan çıktığında, larvalar floresan kapsamı altında kontrol edilir ve pupalar cinsiyete göre sıralanır ve farklı kafeslerde ayrılır. Yetişkinler ortaya çıktıktan sonra, bunlar karşılıklı olarak vahşi tip bireylerle çaprazlanır, kanla beslenir ve yumurtlama için yerleştirilir. Bu yumurtalar yumurtadan çıktıktan sonra, toplanan floresan larvalar, DNA kasetinin genomlarına kararlı bir şekilde yerleştirildiği bireyleri temsil eder. Bu larvalar daha sonra yetişkin aşamasına kadar büyütülür, vahşi tip bireylere çaprazlanır ve daha sonra DNA kasetinin tam dizisinin sivrisinek genomunun istenen bölgesinde mevcut olduğunu doğrulamak için moleküler tekniklerle daha fazla değerlendirilir. Homozigot çizgiler, sağlanan geçiş şeması boru hattı ve mutasyonların moleküler taraması izlenerek de elde edilebilir.

Giriş

Hassas genom düzenleme, moleküler makasın CRISPR-Cas teknolojilerinin kurulmasıyla tartışmalı bir şekilde daha kolay hale geldi, ancak mümkün hale geldi¹. Bu teknolojiler, prokaryotik bağışıklık sisteminin faj enfeksiyonlarına karşı savaşmak için kullandığı bir mekanizmadan yararlanır². Bu sistemler arasında, kümelenmiş, düzenli olarak serpiştirilmiş, kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) Cas9 nükleaz ile birlikte genellikle 20 baz çifti RNA'ya, kılavuz RNA'lara (gRNA'lar) dayanır ve hedeflenen DNA'ya homolog diziler izler ve bunu bir NGG protospacer bitişik motif (PAM) dizisi³ izler. Cas9'a yüklenen gRNA'lar, bu nükleazları tam olarak genomdaki belirli hedef bölgelere yönlendirir ve çift sarmallı DNA kırılmalarını tetikler³.

DNA çift iplikçik kırılmaları, çift sarmal^4'ü yamalamak için onarım mekanizmalarını indükler. Herhangi bir DNA onarımının kesin olması beklenirken, dizi izlerini ve dolayısıyla işlev kaybı mutasyonlarını geride bırakabilecek daha az doğru DNA onarım mekanizmaları vardır⁴. Hataya eğilimli DNA onarım mekanizmaları arasında, Homolog Olmayan Uç Birleştirme (NHEJ), fonksiyon kaybı mutasyonuna neden olabilecek küçük delesyonlar, eklemeler ve nükleotid değişiklikleri (SNP'ler) dahil olmak üzere çerçeve kayması mutasyonlarına neden olabilir. Öte yandan, Homoloji Yönlendirilmiş Onarım (HDR) mekanizması, hasarsız alelin tam dizisini kopyalamak ve hedeflenen DNA dizisinin⁴ mükemmel bir onarımını yapmak için bir şablon olarak homolog kromozoma dayanır.

Bu bilgiye dayanarak, CRISPR-Cas9 teknolojisi, muhtemelen bir PAM bölgesi³ içeren herhangi bir dizide genomları hassas bir şekilde düzenlemek için geliştirilmiştir. Sivrisineklerde, CRISPR-Cas9 teknolojisi, NHEJ onarım mekanizmasından ^5,6 yararlanarak, Cas9 ve gRNA'ların bir karışımının embriyonik mikroenjeksiyonu yoluyla çeşitli genleri devre dışı bırakmak için kullanılmıştır. Benzer germline mutajenez, gRNA + Cas9 karışımının yetişkin dişi sivrisineklerin^{hemolenfine enjekte} edilmesiyle elde edilir 7. Bu teknoloji ReMOT kontrolü olarak adlandırıldı ve yumurta gelişimi (vitellogenez) sürecinde endositoz yoluyla yumurtalıklar tarafından alınan bir peptit ile etiketlenmiş bir Cas9'un değiştirilmiş bir versiyonuna ^dayanıyor7. Spesifik gen kasetlerinin bir genoma çalınması, yalnızca istenen bir DNA kasetini⁸ kodlayan bir plazmit ile birlikte bir gRNA ve Cas9 karışımının (veya bu molekülleri ifade eden bir plazmitin) embriyonik mikroenjeksiyonu ile mümkündür. HDR mekanizmasından yararlanılarak, homolog dizilerle (500-1.000bp)^9,10 hedef bölgenin yukarı ve aşağı akışında çevrili ilgilenilen DNA kasetini içeren plazmit, çift iplikli kopmayı yeniden yazmak için bir şablon olarak kullanılır ve ayrıca DNA kasetini hedef diziye^{kopyalar 9}.

CRISPR-Cas9 teknolojisi, sivrisinek Aedes aegypti^11'deki duyusal sistemlerle ilgili çoklu genleri devre dışı bırakmak için kullanılmıştır, aynı zamanda popülasyon kontrolü¹² için erkek doğurganlığı ve dişi canlılığı (PgSIT) ile ilişkili genleri de devre dışı bırakmak için kullanılmıştır. Hedef genlerin devre dışı bırakılması, floresan belirteçleri kodlayan genlerin belirli genlerin kodlama dizilerine çarpılmasıyla da gerçekleştirilmiştir^13,14. Bu strateji, yalnızca çerçeve kaydırma mutasyonlarını indüklemekle kalmayıp, aynı zamanda yeni nakavt hattının^13,14 bireylerini sıralamak için floresan ışığın kullanılmasına da izin verme avantajına sahiptir. A. aegypti genomu, Q-sistemi (QF-QUAS)¹¹ gibi ikili ekspresyon sistemlerinin dizileri ile de düzenlenmiştir. QF transaktivatörünü kodlayan genin aşağı akışta belirli bir genin bir promotörüne vurulması, transaktivatörün^15,16 tanımlanmış uzay-zamansal ekspresyonunu sağlar. QF eksprese eden bir sivrisinek hattı, QF için bağlanma bölgelerini (QUAS) içeren başka bir sivrisinek hattına geçtiğinde, ikincisi ona bağlanır ve QUAS dizisi ^15,16'ya akış aşağı akıştaki genlerin ekspresyonunu tetikler. Bu sistem, genel olarak, hücre lokalizasyonu veya nöronal aktivitenin tespiti için kullanılan floresan belirteçler ve hatta belirli dokulardaki genleri bozmak için Cas9 nükleazları (yani, somatik nakavt) olabilen bu tür efektör genlerin dokuya ve zamana özgü ekspresyonuna izin ^verir11.

A. aegypti genetik dönüşümü için mevcut tüm bilgiler göz önüne alındığında, burada embriyonik mikroenjeksiyon yoluyla CRISPR-Cas9 sistemi ile genom düzenlemesi yapmak için adım adım talimatlar içeren ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. NHEJ'nin aracılık ettiği çerçeve kaydırmalı mutasyonlar ve delesyonlar yoluyla hem nakavt hem de HDR aracılı gen kaseti eklemeleri ile knockin hatları oluşturma stratejileri tartışılmaktadır.

Protokol

Bu protokolde kullanılan ekipman ve reaktiflerle ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Tüm hayvanlar, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından önerildiği şekilde Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na göre ele alındı. Prosedürler, UCSD Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC, Hayvan Kullanım Protokolü #S17187) ve UCSD Biyolojik Kullanım İzni (BUA #R2401) tarafından onaylandı.

1. gRNA'lar ve donör plazmit tasarımı

1. Nakavt mutantları yapmak için, ~20-100 bp aralıklı iki gRNA tasarlayın (Şekil 1A).
   1. CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/)¹⁷veya Benchling (benchling.com) veya CRISPOR (http://crispor.gi.ucsc.edu/)18 gibi çevrimiçi bir araç (Şekil 1A) kullanarak PAM dizisi (NGG) hariç olmak üzere CRISPR-Cas9 için ²⁰ bp gRNA tasarlayın. Çevrimiçi araç tarafından önerildiği gibi, deneyler için en spesifik ve hedef dışı gRNA'ları seçin.
   2. gRNA kesim bölgeleri arasındaki diziye verimli bir kısıtlama enzimi kesme bölgesinin dahil edildiğinden emin olun (Şekil 1A). Başarılı düzenlemelerin hızlı bir şekilde görsel olarak onaylanmasını sağlamak için gRNA kesim bölgeleri arasına bir kısıtlama enzimi bölgesi ekleyin.
      NOT: Silme gerçekleştiğinde, kısıtlama bölgesi kaldırılır, böylece enzim diziyi kesmez ve silmeyi doğrulamak için bir jel üzerinde tek, kesilmemiş bir bant üretir.
2. HDR aracılı gen kaseti yerleştirmeleri için, nakavt mutantları yapmak için bahsedilen araçları kullanarak birden fazla gRNA tasarlayın ve daha sonraki değerlendirmeden sonra en etkili olanı seçin.
3. Hedef bölge homoloji kolları, kargo DNA dizisi, bir floresan işaretleyici, replikasyonun kökeni ve bir antibiyotik direnç geni içeren Homolojiye Yönelik Onarım (HDR) için donör plazmitleri tasarlayın (Şekil 1B).
   1. Hedef sahanın yukarı ve aşağı bölgelerinden, her biri 500-1.000 bp^10'u kapsayan homoloji kollarını seçin (Şekil 1B).
   2. Bir floresan işaretleyici, ilgilenilen bir gen veya düzenleyici bir unsur (örneğin, QF2) içerebilecek kargo sırasını seçin.
   3. Bir floresan kalemi seçin. A. aegypti için kullanılan yaygın floresan işaretleyiciler, bir promotör, bir floresan işaretleyici kodlama geni ve bir 3' UTR dizisi içeren bir DNA kasetine dahil edilir. Daha fazla ayrıntı için tartışmaya bakın.

2. Enjeksiyon karışımı hazırlama

1. Cas9 proteinini Cas9 seyreltme tamponu ile 1 μg/μL'ye seyreltin.
   NOT: Cas9'u 2 kattan fazla çözdürmeyin ve dondurmayın. Cas9 proteininin alikotlarının yapılması tavsiye edilir.
2. gRNA'ları satın alın veya şirket içinde üretin.
   NOT: Şirket içi üretim için standart RNA dekontaminasyon uygulamaları ve RNAse içermeyen malzemeler kullanın.
   1. 4-6 gRNA tasarlayın ve enjeksiyon için en iyi iki gRNA'yı seçin (aşağıdaki in vitro bölünme testine bakın).
   2. gRNA dizisinin yukarı akışında T7 promotör dizisini içeren bir ileri astar tasarlayın. Aşağıda açıklandığı gibi şablon olmayan PCR reaksiyonları için evrensel gRNA ters astarını kullanın. Üst üste binen dizi bazı, evrensel ters astardaki (kalın ve altı çizili) karşılık gelen diziyle eşleşir ve DNA polimerazın dizilerini yükseltmesi için bir şablon oluşturur.
      NOT: Bu PCR reaksiyonları için, ileri primer T7 promotörü (kalın), ardından iki guanin (T7 RNA polimeraz yoluyla transkripsiyon başlangıcı için önemlidir), gRNA'nın 20 nükleotid dizisi (N₂₀; PAM dizisi olmadan) ve primer örtüşme dizisi (altı çizili) içermelidir.
      Astar ileri: 5'- GAAATTAATACGACTCACTATAGGN₂₀ GTTTTAGAGCTAGAAATAGC- 3'
      Astar ters: 5''-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTT CAAGTTGATAACGGACTAGC
      CTTATT TTAACTT GCTATTTCTAGCTCTAAAAC - 3'
   3. DNA şablonunu şablon olmayan PCR ile sentezleyin. Birden fazla reaksiyon ayarlayın (her biri 12.5 μL 2x ana karışım, 1.25 μL 10 μM ileri astar çözeltisi, 1.25 μL 10 μM ters astar çözeltisi ve 10 μL ultra saf su içerir) böylece in vitro transkripsiyon reaksiyonu için yeterli PCR ürünü (300 ng) mevcuttur. Aşağıdaki PCR koşullarını kullanın: 98 °C'de 30 saniye boyunca ilk denatürasyon; 98 °C'de 10 sn, 62 °C'de 10 sn ve 72 °C'de 10 sn boyunca 35 döngü amplifikasyon; 72 °C'de 2 dakika son uzatma; ve 4 °C'de depolama.
   4. Tek bir DNA fragmanının (122 baz çifti) bir agaroz jeli (% 2) üzerinde amplifikasyonunu onaylayın.
   5. Üreticinin tavsiyelerine uyarak bir PCR Saflaştırma kiti kullanarak PCR şablonunu temizleyin.
   6. Bir T7 Transkripsiyon Kiti ile in vitro transkripsiyon reaksiyonu gerçekleştirin. 2 μL 10x reaksiyon tamponu, 2 μL nükleotid (ATP, CTP, UTP ve GTP), 2 μL T7 RNA polimeraz, 3 μL şablon DNA (100 ng/μL) ve 5 μL ultra saf suyu karıştırın. Karışımı 37 ° C'de en az 2 saat (en fazla 16 saat) ila gece (12 saat) arasında inkübe edin.
      NOT: Bu reaksiyonda, T7 RNA polimeraz, primer ileri diziye dahil edilen T7 promotörüne bağlanır ve bu da gRNA'nın transkripsiyonuna yol açar.
   7. 1 μL DNaz ekleyerek (iyice karıştırın) ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe ederek transkripsiyon reaksiyonunu DNaz ile tedavi edin.
   8. Üreticinin tavsiyelerine uyarak sentezlenen sgRNA'ları bir transkripsiyon temizleme kiti ile saflaştırın.
   9. Seçilen gRNA'ların kesme verimliliğini değerlendirmek için bir in vitro bölünme testi yapın (Şekil 1C).
      1. gRNA kesme bölgesini çevreleyen bir DNA fragmanını (500-1.000 bp) amplifiye etmek için primerler tasarlayın.
      2. PCR reaksiyonlarını aşağıdaki gibi ayarlayın: 12.5 μL 2x ana karışım, 1.25 μL 10 μM ileri primer çözeltisi, 1.25 μL 10 μM ters astar çözeltisi, 9 μL ultra saf su ve 1 μL 5 ng/μL şablon DNA.
      3. Aşağıdaki PCR koşullarını kullanın: koşullar: 98 ° C'de 30 saniye boyunca ilk denatürasyon; 98 °C'de 10 sn, X °C'de 15-30 sn (astarlar için ideal tavlama sıcaklığı) ve 72 °C'de 35 sn için 35 döngü amplifikasyon; 72 °C'de 2 dakika son uzatma; ve son olarak 4 °C'de uzun süreli depolama.
      4. En iyi amplifikasyon sıcaklıkları ve zaman aralığı için üreticinin yönergelerine bakın. PCR temizlemesi (tek bant) veya agaroz jel PCR bandı saflaştırmasından sonra yeterli PCR ürünü (1.5-2 μg) elde etmek için en az beş reaksiyonu bir araya getirin veya reaktiflerin hacimlerini büyütün.
      5. Aşağıdaki karışımı 37 °C'de 1 saat inkübe ederek rekombinant Cas9 ile Cas9 bölünme reaksiyonlarını ayarlayın: 1 μL 10x Cas9 reaksiyon tamponu, 0.35 μL rekombinant Cas9 (1 μg/μL), 1 μL gRNA (100 ng/μL), 6.65 μL ultra saf su ve 1 μL 300 ng/μL şablon DNA.
      6. Herhangi bir gRNA olmadan negatif bir kontrol reaksiyonu ayarlayın.
      7. Bir agaroz jel (% 1.5-2.0) üzerinde reaksiyonlar çalıştırarak bölünme verimliliğini kontrol edin; Şekil 1C).

3. Donör plazmidinin montajı

1. PCR-amplifiye A . aegypti'nin genomik DNA'sından homoloji kolları.
   1. Astar tasarımı için klonlama kiti üreticisinin yönergelerine bakın. Farklı klonlama stratejileri (örneğin, Gibson, Golden Gate ve restriksiyon enzimi tabanlı klonlama) kullanarak plazmit tasarımı ve montajı için destek sağlayan çevrimiçi bir araç (örneğin, Benchling) kullanın.
   2. A. aegypti genomik DNA'sından kargo dizisini çoğaltın veya ticari olarak sentezlenmiş bir gen parçası sipariş edin.
   3. Plazmitlerden floresan belirteçleri şirket içinde çoğaltın.
2. 3.1.1'den 3.1.3'e kadar olan DNA parçalarını Gibson montajı ile mevcut bir plazmitin omurgasına bağlayın. 10 μL 2x ana karışım, tüm DNA fragmanlarının X μL'si, 10-X μL ultra saf su karışımını 50 °C'de 1 saat inkübe edin.
   NOT: Eklerin plazmit omurgasına ideal oranını hesaplamak için üreticinin yönergelerine bakın.
   1. Her bir klonlama parçasının konsantrasyonlarını piko mol cinsinden hesaplayın: pmols = (ng cinsinden ağırlık) × 1.000/(baz çiftleri × 650 dalton).
   2. 50-100 ng plazmit omurgası ve her bir kesici uçtan 2-3 kat fazla molar kullanın.
   3. 2-3 parçayı bir araya getiriyorsanız, Gibson reaksiyonuna her parçadan 0.02-0.5 pmol ekleyin. 4-6 parçayı bir araya getiriyorsanız, her birinden 0.2-1.0 pmol ekleyin.
3. E. coli yetkin hücreleri JM109'u dönüştürmek için 3-5 μL Gibson montaj reaksiyonu kullanın.
   NOT: JM109, istenmeyen rekombinasyon olaylarını azaltan ve hücre hasadı sırasında nükleaz taşınmasını önleyen, birleştirilen DNA parçalarının bütünlüğünü sağlayan recA-genotipi nedeniyle Gibson montajı için seçilmiştir.
   10 kb'den büyük plazmitler için, üreticinin tavsiyelerine uyarak genişletilmiş protokolü kullanarak DH5α yetkin hücrelerinin dönüştürülmesini öneririz.
4. Dönüştürülen bakterileri genişletin ve bir mini hazırlık kiti kullanarak plazmidi saflaştırın.
5. Doğru plazmit düzeneğinin doğrulanması için, saflaştırılmış plazmit DNA ile bir tanısal kısıtlama enzimi sindirimi çalıştırın ve agaroz jel elektroforezi ile görselleştirin (Şekil 1D, E).
   NOT: Plazmidi tek bir bölgede kesebilecek birkaç kısıtlama enziminin seçimi için çevrimiçi bir araç kullanmanızı öneririz. Benchling gibi bir yazılım, seçilen kısıtlama enzimleri ile plazmit dizilerinin sanal sindirimini gerçekleştiren ve beklenen DNA bandı modelini sanal bir elektroforez jeli üzerinde görüntüleyen yerleşik bir araca sahiptir (Şekil 1D).
   1. Plazmit kısıtlama enzimi sindirimini gerçekleştirin. 1 μL 10x restriksiyon sindirim tamponu, 0.5 μL restriksiyon enzimi 1, 0.5 μL restriksiyon enzimi 2, 1 μL plazmit DNA (300 ng/mL) ve 7 μL ultra saf su karışımını 37 ° C'de 2 saat inkübe edin.
   2. Kısıtlama sindirim reaksiyonlarını bir agaroz jel (% 1.5) üzerinde çalıştırın.
      NOT: DNA bant modeli (Şekil 1E), sanal özet bant modeline (Şekil 1D) benzemelidir. Hizmet mevcutsa, plazmitler tüm plazmit dizilimi için de gönderilebilir.
6. Plazmit klonunu 150 mL LB ortamına kültürleyin.
7. Üreticinin yönergelerini izleyerek plazmid maxiprep'i gerçekleştirin.
8. Plazmidi ultra saf suda askıya alın.

4. Enjeksiyon yapısının karıştırılması

NOT: Her yapı için önerilen nihai konsantrasyon aralıkları Tablo 1'de verilmiştir. 2:1:2 oranıyla başlayın (ng Cas9: ng sgRNA: ng donör plazmidi) ve HDR verimliliğini optimize etmek için gerektiği gibi ayarlayın. Sonuçların izlenmesi, en etkili kombinasyonun belirlenmesine yardımcı olacaktır.

1. Nakavt mutantları yapmak için,
   1. Cas9 seyreltme tamponunu kullanarak Cas9 proteininin alikotunu istenen konsantrasyona seyreltin ve gRNA'nın alikotunu ultra saf su ile seyreltin.
   2. Bir Ribonükleoprotein (RNP) kompleksi oluşturmak için Cas9 proteinini her gRNA ile önceden karıştırın. Önceden karıştırılmış çözeltileri birleştirin.
2. HDR aracılı gen kaseti yerleştirmeleri için,
   1. Cas9 proteinini ve gRNA'ları nakavt mutantları yapmak için önerildiği gibi seyreltin ve karıştırın.
   2. Donör plazmidini ultra saf suyla seyreltin.
   3. Tüm yapıları birleştirin.

5. Mikroenjeksiyon iğnelerinin çekilmesi ve yüklenmesi

1. Enjeksiyon iğnelerini çekmek için kuvars filament kullanın (Şekil 2). Filamentin 10 cm uzunluğunda, dış çapı 1 mm ve iç çapı 0,7 mm olduğundan emin olun.
2. Aşağıdaki iki programdan biriyle bir lazer mikropipet çektirmesi kullanarak iğneleri çekin:
   Program 1: Isı 805, Filament 4, Hız 50, Gecikme 145, Çekme 145
   Program 2: Isı 650, Filament 4, Hız 40, Gecikme 150, Çekme 156
   NOT: Program 1, daha ince ancak daha uzun bir iğne ucu ile sonuçlanır, bu da onu daha ince bir ucun hassasiyet için faydalı olduğu daha düşük konsantrasyonlu yapılara sahip enjeksiyonlar için uygun hale getirir. Program 2, yapı daha kalın olduğundan ve daha sağlam bir iğne gerektirdiğinden, daha yüksek konsantrasyonlu enjeksiyonlar için ideal olan daha kısa ama daha kalın bir iğne ucu verir.

6. Embriyo toplama

1. Sivrisinekleri toplamak için elektrikli veya manuel bir aspiratör hazırlayın ve toplama ve embriyo toplama için plastik şişeler kullanın.
2. Beyaz daire filtre kağıtlarını nemlendirin ve iç duvara veya kollektördeki nemli pamuğun üzerine yerleştirin.
3. 5-10 gün önce kanla beslenmiş 5-10 dişi sivrisineği kolektöre yerleştirin. Kollektörü 45 dakika karanlıkta bırakın.
4. Embriyo toplama için filtre kağıtlarını çıkarın.

7. Embriyo sıralaması

1. Embriyo enjeksiyonu için A. aegypti'nin vahşi tip bir suşu (Liverpool) kullanın.
2. Hasat kağıdından preblastoderm evresi embriyolarını, özellikle açık gri renkli olanları seçin (Şekil 3).
3. Islak bir fırça ile birkaç embriyoyu bir lamel üzerine yerleştirilen çift taraflı yapışkan banda aktarın. Embriyoları, çevreleri hala ıslakken, tüm arka uçları öne bakacak şekilde yan yana olduklarından emin olarak paralel olarak hizalayın.
4. Doğru yerleştirildikten sonra, embriyoları yerinde sabitlemek için ortamın hafifçe kurumasını bekleyin.
5. Kurumayı önlemek için hizalama sırasında embriyoların üzerine Halokarbon yağı 700 ekleyin.
   NOT: Yağı eklerken embriyoların suyla çevrili olmadığından emin olun, çünkü bu embriyoların yağda yüzmesine neden olur.

8. Embriyo mikroenjeksiyonu

NOT: Enjeksiyon oda sıcaklığında veya 18 °C'de yapılır. 18 ° C sıcaklık, embriyo gelişimini geciktirdiği için pratik nedenlerle önerilir.

1. Aşağıdaki parametrelere sahip bir mikro enjektör kurun: dengeleme basıncı (Pc) 300 hPa, enjeksiyon basıncı (Pi) 500 hPa. Gerektiğinde bu koşulları ayarlayın.
2. Karışık yapıdan 3 μL'yi bir mikro yükleyici kullanarak bir iğneye yükleyin.
3. Hizalanmış embriyoların bulunduğu kapak camını bir mikroskop lamının üzerine yerleştirin (Şekil 3). Kapak camını yerleştirin ve enjeksiyon için mikroskobun altına kaydırın. Embriyonun arka ucunun iğneye doğru konumlandırıldığından emin olun.
4. Bir iğneyi bir mikromanipülatör ile birlikte bir iğne tutucusuna yerleştirin ve iğneyi hizalanmış embriyoların arka ucuna doğru 10°'lik bir açıyla sabit tutarak konumlandırın (Şekil 4A). İğneyi mikroskop altında nazikçe açın ve bir lamel kenarıyla hafifçe dokunun.
   NOT: Diğer bir seçenek ise iğneye embriyo ile vurarak iğnede küçük bir açıklık oluşturmaktır. Bununla birlikte, Cas9 proteininin yapışkanlığı iğneyi tıkayabileceğinden, biraz daha geniş bir iğne açıklığı önerilir.
5. Sürgülü camı enjeksiyon için iğneye doğru hareket ettirin (Şekil 5).

9. Enjekte edilen embriyo sonrası bakım

1. Embriyoları çevreleyen yağı çıkarmak için tüy bırakmayan, tek kullanımlık mendiller kullanın.
2. Embriyoları durulamak için deiyonize su ekleyin ve embriyoları ıslak bir filtre kağıdına taşıyın. Islak filtre kağıdını Karat 9 oz bardakların içindeki ıslak bir mendil üzerine yerleştirin (Şekil 4B ve Şekil 6A,B).
3. Nemi korumak için bardağın dibine ıslak pamuk yerleştirin (Şekil 6B).
4. Enjekte edilen embriyoları ıslak filtre kağıdı üzerinde muhafaza edin.

10. Embriyo kuluçka ve G0 larva taraması

1. Enjeksiyondan en az 4 gün sonra, embriyolu filtre kağıdını kuluçka için Sterilite 6 litrelik tavalarda yaklaşık 3 L deiyonize suya aktarın.
   NOT: Yumurtalar tipik olarak enjeksiyondan sonraki 2 hafta içinde daha verimli bir şekilde çatlar. Bu süre zarfında yumurtaların nemli kaldığından emin olun. Filtre kağıdı çok ıslak olmamalıdır, çünkü aşırı nem embriyoların erken yumurtadan çıkmasına neden olabilir. Daha uzun süre koruma, kuluçka oranlarını iyileştirebilirken, en iyi sonuçlar için bir ayı aşmayın. Oksijensiz su kullanmak da yumurtadan çıkmaya yardımcı olabilir.
2. G0 larvaları yumurtadan çıktıktan sonra, su ile karıştırılmış balık yemini tavaya yiyecek olarak ekleyin.
3. G0 larvalarını 3. ila 4. instar larva aşamasında floresan işaretleyici için tarayın (Şekil 7).
4. Larvaları floresan durumlarına göre ayrı ayrı muhafaza edin, floresan pozitif ve floresan negatif larvalar ayrı tavalarda tutulur.

11. Cinsiyet sıralama pupa ve vahşi türe geçiş

1. Enjekte edilen sivrisinekleri, tanımlama için genital lobdaki boyut ve cinsiyete özgü yapıları kullanarak, pupa olduklarında cinsiyete göre ayırın:
   1. Erkekler: Daha küçük boyut, daha belirgin ve sivri bir genital lob ve daha geniş kürekler (pupaların kuyruk ucundaki yapılar; Şekil 8A 1,A2).
   2. Dişiler: Daha büyük boyut, daha küçük ve daha az belirgin bir genital lob ve daha dar kürekler (Şekil 8B 1,B2).
2. Her cinsiyetten floresan pozitif veya floresan negatif sivrisinekleri havuzlayın.
3. Havuzlanmış sivrisinekleri, Liverpool suşundan karşı cinsten sivrisineklerle geçin. Yabani türün G0 sivrisineğe 3: 1 ila 5: 1 oranını kullanın.
4. Sivrisinekleri 4 gün boyunca geçin.
5. Geçtikten sonra dişilere kan unu verin.

12. G1 taraması

1. Kan beslemesinden üç gün sonra, Karat 9 oz bardakların duvarına bir kağıt havlu koyarak ve yaklaşık 3 oz deiyonize su ekleyerek yumurta kapları sağlayın.
2. 3-4 gün sonra G1 embriyolarını toplayın ve yumurtadan çıkarın. G1 larvalarını 3. ila 4. instar aşamalarında floresan işaretleyici için tarayın (Şekil 7).
3. Floresan larvaları toplayın, bu da bir HDR yerleştirilmesini önerir. Floresan G1 bireyleri pupa aşamasına ulaştığında, onları cinsiyetlerine göre ayırın ve her cinsiyeti ayrı kafeslere koyun.
4. Floresan G1 sivrisineklerini Liverpool suşunun karşı cinsinden bireylere geçin.

13. G1 yerleştirme yeri onaylıyor

1. Kan unu sağladıktan sonra, tek tek Drosophila şişelerine küçük bir parça kağıt havlu koyarak ve 3 mL deiyonize su ekleyerek G1 dişilerini tek dişi yumurta yumurtlaması için ayarlayın.
2. Nakavt mutantlar için:
   1. Yumurtlamadan sonra su buharlaşır ve kağıt havlu kurur, yumurtaları açıkça nakavt mutasyonları sergileyen dişilerden çıkarın ve G2 neslini elde edin.
   2. G1 annelerinin vücudunu toplayın, G2 yavrularını başarıyla yumurtadan çıkarın ve DNA'yı çıkarın.
   3. Hedef bölgeyi kapsayan diziyi amplifiye etmek için DNA'yı PCR için bir şablon olarak kullanın. Primerlerin ~ 200 bp'lik bir DNA parçasını çoğalttığından emin olun. Reaksiyonları ayarlayın (her biri 12.5 μL 2x ana karışım, 1.25 μL 10 μM ileri primer çözeltisi, 1.25 μL 10 μM ters astar çözeltisi, 9 μL ultra saf su ve 1 μL şablon DNA [5 ng/μL]). Aşağıdaki PCR koşullarını kullanın: 98 °C'de 30 saniye boyunca ilk denatürasyon; 98 °C'de 10 sn, X °C'de (primerlerin ideal tavlama sıcaklığı) 15-30 sn ve 72 °C'de 10 sn için 35 döngü amplifikasyon; 72 °C'de 2 dakika son uzatma; ve son olarak 4 °C'de uzun süreli depolama.
   4. 1 μL 10x restriksiyon sindirim tamponu, 0.5 μL restriksiyon enzimi 1, 0.5 μL restriksiyon enzimi 2, 1 μL PCR fragmanı (200 ng/mL) ve 7 μL ultra saf su karışımını 37 °C'de 30 dakika inkübe ederek PCR fragmanlarını saflaştırın ve restriksiyon enzimi sindirimini gerçekleştirin.
      NOT: Bazı kısıtlama enzimleri, önceden saflaştırılmadan PCR karışımında kullanılabilir.
   5. Bölünmenin meydana gelip gelmediğini doğrulamak için jel elektroforezi ile PCR fragmanı sindirimini görselleştirin.
   6. Nakavt mutasyonlarını tanımlamak için sindirilmemiş PCR fragmanını sıralayın.
   7. HDR aracılı yerleştirmeler için, yumurtlamadan sonra:
      1. G1 annelerinin vücudunu toplayın ve DNA'yı çıkarın.
      2. Hedef bölgeyi kapsayan diziyi çoğaltmak için DNA'yı PCR için bir şablon olarak kullanın.
      3. Yerleştirilen DNA kasetinin bütünlüğünü doğrulamak için amplifiye edilmiş DNA parçasının dizilimini gerçekleştirin.
      4. Yumurtayı çatlatın ve G2 neslini elde edin.

14. Yeni CRISPR hatlarının genişletilmesi

1. Nakavt mutant çizgiler için:
   1. G2 dişilerini, G1 başına 20 dişi olacak şekilde yumurtlama için ayarlayın. Her G1 bir satırı temsil eder.
   2. Yumurtlamadan sonra, nakavt mutasyonlarını G1 ile aynı şekilde onaylayın.
   3. Hem G1 hem de G2'de açıkça tanımlanmış mutasyonlar sergileyen beş G1 çizgisi ile devam edin. Her hattın G2'sinden toplanan yumurtaları çatlatın ve G3 nesline yol açın.
   4. Kesişen beş çizgiden, açıkça tanımlanmış mutasyonlara ve yüksek uygunluğa veya istenen fenotipe sahip iki çizgi seçin.
   5. Seçilen her çizgiden G3 dişilerini Liverpool suşundan erkeklerle çaprazlayın.
   6. Her hattan yumurtlamak için 50 bekar dişi ayarlayın. Daha önce G1 için yapıldığı gibi nakavt mutasyonlarını onaylayın.
      NOT: Çeşitliliği korumak için kurulumdaki kadın sayısını artırın.
   7. İki çizgi ile iki ek nesil için prosedürleri tekrarlayın (Şekil 4J).
2. Yeni HDR aracılı ekleme hatları için:
   1. G2 neslinde floresan bireylerin varlığını doğrulayın.
   2. Liverpool suşu ile her G1 bireyinden G2 sivrisineklerini çaprazlayın. Her G1 bireyi bir satırı temsil eder.
   3. Üç nesil daha geçiş ile devam edin. Floresan işaretleyiciyi sürekli olarak kontrol edin ve her satırın uygunluğunu¹⁹ gözlemleyin (Şekil 4x).
   4. Doğru eklemelere ve yüksek uygunluğa ve istenen fenotipe sahip bir satır seçin.

15. Homozigot çizgiler yapın

1. Nakavt mutant çizgiler için:
   1. G6 Kuşağı:
      1. G5 tarafından üretilen yumurtaları çatlatın ve G6 neslini elde edin.
      2. G6 yetişkinlerini kendi çizgileri içinde çaprazlayın (Şekil 4K ve Şekil 9A).
      3. Hat başına yumurtlama için 50 tek G6 dişi ayarlayın ve yumurtaları daha önce açıklandığı gibi yumurtadan çıkarın (Şekil 9B).
      4. G7 yavrularını başarıyla yumurtadan çıkaran G6 dişilerini toplayın, DNA'yı çıkarın ve G1 için yapıldığı gibi PCR ve kısıtlama enzimi sindirimi gerçekleştirin (Şekil 9C).
         NOT: Bu adımda DNA ekstraksiyonu için basit ve ucuz bir ezme tamponu (SB) kullanılabilir.
         1. El tipi bir öğütücü kullanarak, tek bir sivrisineği 100 μL 1x SB'de (10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA ve 25 mM NaCl) yumuşatın. Proteinaz K (200 μg/mL) ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika, ardından 95 °C'de 2 dakika inkübe edin. 5 dakika boyunca 10.000 × g'da döndürün ve süpernatan^20'yi toplayın.
      5. Sonuçları bir jel üzerinde görselleştirerek mutasyonu onaylayın.
      6. Dişiler tarafından üretilen yumurtaları mutasyon olmadan atın (Şekil 9D).
      7. Birkaç G7 soyu oluşturmak için doğrulanmış mutasyonlara sahip dişilerden larvaları koruyun ve mutasyon olmadan yavruları atın (Şekil 9D).
   2. G7 Kuşağı:
      1. Her G7 soyu içindeki dişiler ve erkekler arası çaprazlama (Şekil 9E).
      2. Her hat için yumurtlama için 10 tek G7 dişi ayarlayın ve yumurtaları daha önce açıklandığı gibi yumurtadan çıkarın (Şekil 9F).
      3. G7 yavrularını başarıyla yumurtadan çıkaran G7 dişilerini toplayın, DNA'yı çıkarın ve PCR ve kısıtlama enzimi sindirimi gerçekleştirin (Şekil 9G).
      4. Sonuçları bir jel üzerinde görselleştirerek her iki aleldeki veya tek bir aleldeki nakavt mutasyonlarını tespit edin.
      5. Her iki alelde de nakavt olduğu doğrulanan G7 dişilerinden larvaları koruyun ve G8 neslini üretin (Şekil 9H). Mutasyon olmadan yavruları atın (Şekil 9H).
         NOT: Bu adım, dişilerin homozigot olmasını sağlar. G8'de, döllerin homozigotluğunun test edilmesi, babaların da homozigot olup olmadığını doğrular.
   3. G8 Kuşağı:
      1. Her G7 kadın soyu için G8 yetişkinlerini çaprazlayın (Şekil 9I).
      2. Rastgele beş G8 erkeği seçin, DNA'yı çıkarın ve PCR ve kısıtlama enzimi sindirimi gerçekleştirin (Şekil 9J).
      3. Bir kan unu sağlayın ve her iki alelde de nakavt olduğu doğrulanan G8 erkekleriyle çaprazlanan G8 dişilerinden yumurtaları çıkarın.
      4. Tespit edilen tüm erkeklerin her iki alelinde de nakavtlara sahip olduğu G7 soylarıyla devam edin, bu da bu soyların homozigot olduğunu gösterir.
2. HDR aracılı ekleme hatları için:
   1. G5 tarafından üretilen yumurtaları çatlatın ve G6 neslini elde edin. Floresan işaretleyiciler için G6 aşamasında ekran larvaları.
   2. Larvaları floresan işaretleyiciler olmadan atın (Şekil 4xi).
   3. Floresan belirteçler sergileyen çapraz sivrisinekler.
   4. Floresan olmayan larva gözlenene kadar sonraki her nesil için bu işleme devam edin. Bu noktada, sivrisinek hattı homozigot olacaktır.

Sonuçlar

HDR homoloji rekombinasyonu için gRNA aracılı gen hedeflemesinin tasarımı ve doğrulanması
İstenen genin doğru bir şekilde hedeflendiğinden emin olmak için, birkaç gRNA seçmenizi ve HDR aracılı homolog rekombinasyon için 5' ve 3' homoloji kollarını kesme bölgesine yakın konumlandırmanızı öneririz (Şekil 1A). Örneğin, ilgilenilen genin başlangıç kodonunun her iki tarafını hed...

Tartışmalar

CRISPR-Cas teknolojisi, kromozom^1'de hedefe özgü değişiklikleri teşvik ederek genom düzenleme manzarasını değiştirdi. Transpoze edilebilir elementler, ilk transgenik sivrisineklerin oluşumu için gerekli olsa da, yerleştirme yerleri biraz rastgeledir ve kargo yapısının ifadesi (promotör + gen), genellikle ektopik ekspresyona yol açan bir genom konumsal etkisi (yani, yerleştirme bölgesi) nedeniyle gerçek genin ekspresyon profiline karşılık ge...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Cas9 reaction buffer	PNA Bio	CB01
Benchling software	Benchling	N/A	www.benchling.com
Cas9 dilution buffer	PNA Bio	CB03
Cas9 protein	PNA Bio	CP01-50
DH5α E. coli Competent Cells	New England Biolabs	C2987
Double-sided sticky tape	Scotch Permanent	3136
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-109
Filter papers	GE Healthcare Life Science	1450-042
Fish food	Tetra	B00025Z6YI	goldfish flakes
Flugs	Genesee Scientific	AS273
Fluorescent microscope	Leica Microsystems	M165 FC
Gene fragment	Integrated DNA Technologies	N/A
gRNA	Synthego	N/A
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Injection microscope	Leica Microsystems	DM2000
JM109  E. coli Competent Cells	Zymo Research	T3005
Microinjector	Eppendorf		FemtoJet 4x
Microloader Tips for Filling Femtotips	Eppendorf	E5242956003
Micromanipulator	Eppendorf		TransferMan 4r
Micropipette Pullers	Sutter Instrument	P-2000
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-542-B
Microscope slide	Eisco	12-550-A3
Mouse blood (live mice used for feeding)	University of California	IACUC, Animal Use Protocol #S17187	Used for mosquito blood feeding; details comply with animal ethics protocols
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0491S
PCR Purification Kit	Qiagen	28004
Plasmid Miniprep Kit	Zymo Research	D4036
Quartz filament	Sutter Instruments	QF100-70-10
Transcription Clean-Up Kit	Fisher Scientific	AM1908
Ultra-pure water	Life Technologies	10977-023