Genome Editing bei der Gelbfiebermücke Aedes aegypti mittels CRISPR-Cas9

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Genom-Editierung durch embryonale Mikroinjektion in der Mücke A. aegypti unter Verwendung der CRISPR-Cas9-Technologie.

Zusammenfassung

Das Aufkommen der CRISPR-Cas9-Technologie (Clustered, Regularly Interspers, Short Palindromic Repeats) hat die Gentechnik revolutioniert und die Türen für eine präzise Genom-Editierung bei mehreren Arten, einschließlich Nicht-Modellorganismen, geöffnet. In der Mücke Aedes aegypti wurden mit dieser Technologie Funktionsverlustmutationen und DNA-Insertionen erreicht. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Genom-Editierung durch embryonale Mikroinjektion in die Mücke A. aegypti unter Verwendung der CRISPR-Cas9-Technologie, wobei der Schwerpunkt sowohl auf der Erzeugung von Gen-Knockout- als auch von Knockin-Linien liegt. In diesem Protokoll werden Quarznadeln mit einer Mischung aus Guide-RNA, rekombinantem Cas9 und einem Plasmid gefüllt, das eine DNA-Kassette enthält, die ein Gen für einen fluoreszierenden Marker kodiert, falls Gen-Knockin gewünscht wird. Die Embryonen im Präblastodermstadium werden auf einem Streifen doppelseitigem Klebeband aufgereiht, das auf ein Deckglas gelegt wird, das anschließend auf einen Objektträger aufgebracht wird. Mit Hilfe eines Mikroinjektors werden die Nadeln schonend in das hintere Ende der Embryonen eingeführt und ein kleines Volumen des CRISPR-Gemisches abgegeben. Wenn die Embryonen geschlüpft sind, werden die Larven unter dem Fluoreszenz-Endoskop untersucht, und die Puppen werden nach Geschlecht sortiert und in verschiedene Käfige getrennt. Sobald die erwachsenen Tiere schlüpfen, werden diese wechselseitig mit Wildtyp-Individuen gekreuzt, mit Blut gefüttert und zur Eiablage ausgesetzt. Sobald diese Eier ausgebrütet sind, stellen die gesammelten fluoreszierenden Larven Individuen dar, die die DNA-Kassette stabil in ihr Genom eingefügt haben. Diese Larven werden dann bis zum Erwachsenenstadium gezüchtet, mit Wildtyp-Individuen ausgekreuzt und dann mit molekularen Techniken weiter untersucht, um zu bestätigen, dass die genaue Sequenz der DNA-Kassette an der gewünschten Stelle des Mückengenoms vorhanden ist. Homozygote Linien können auch durch Befolgen der bereitgestellten Pipeline des Kreuzungsschemas und des molekularen Screenings der Mutationen erhalten werden.

Einleitung

Die präzise Genom-Editierung ist mit der Etablierung der CRISPR-Cas-Technologien der molekularen Schere wohl einfacher, aber möglich geworden¹. Diese Technologien machen sich einen Mechanismus zunutze, den das prokaryotische Immunsystem zur Bekämpfung von Phageninfektionen nutzt². Unter diesen Systemen beruhen geclusterte, regelmäßig eingestreute, kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) zusammen mit der Cas9-Nuklease in der Regel auf 20 Basenpaar-RNAs, den Guide-RNAs (gRNAs), mit Sequenzen, die homolog zur Ziel-DNA sind, denen eine NGG-Protospacer-Nachbarmotiv-Sequenz⁽PAM) 3 folgt. Die auf Cas9 geladenen gRNAs leiten diese Nukleasen präzise zu bestimmten Zielstellen im Genom und lösen Doppelstrang-DNA-Brüche^{aus 3}.

DNA-Doppelstrangbrüche induzieren die Reparaturmechanismen, um die Doppelhelix zu flicken⁴. Während von jeder DNA-Reparatur erwartet wird, dass sie präzise ist, gibt es weniger genaue DNA-Reparaturmechanismen, die Sequenznarben und damit Funktionsverlustmutationen hinterlassen können⁴. Unter den fehleranfälligen DNA-Reparaturmechanismen kann das Non-Homologus End-Joining (NHEJ) Frame-Shift-Mutationen verursachen, einschließlich kleiner Deletionen, Insertionen und Nukleotidänderungen (SNPs), die zu Funktionsverlustmutationen führen können. Der Mechanismus der Homology Directed Repair (HDR) hingegen stützt sich auf das homologe Chromosom als Vorlage, um die exakte Sequenz des unbeschädigten Allels zu kopieren und eine perfekte Reparatur der Ziel-DNA-Sequenz^{durchzuführen 4}.

Basierend auf diesem Wissen wurde die CRISPR-Cas9-Technologie entwickelt, um Genome präzise zu bearbeiten, wohl an jeder Sequenz, die eine PAM-Stelle^{enthält 3}. Bei Mücken wurde die CRISPR-Cas9-Technologie verwendet, um eine Vielzahl von Genen durch embryonale Mikroinjektion einer Mischung aus Cas9 und gRNAs auszuschalten, wobei der NHEJ-Reparaturmechanismus genutzt wurde ^5,6. Eine ähnliche Keimbahnmutagenese wird durch die Injektion von gRNA + Cas9-Mischung in die Hämolymphe erwachsener weiblicher Mücken erreicht⁷. Diese Technologie wurde als ReMOT-Kontrolle bezeichnet und beruht auf einer modifizierten Version eines Cas9, das mit einem Peptid markiert ist, das von den Eierstöcken durch Endozytose während des Prozesses der Eizellentwicklung (Vitellogenese) aufgenommen ^wird7. Das Einbringen spezifischer Genkassetten in ein Genom ist nur durch embryonale Mikroinjektion einer Mischung aus gRNA und Cas9 (oder eines Plasmids, das diese Moleküle exprimiert) zusammen mit einem Plasmid, das für eine gewünschte DNA-Kassette kodiert⁸, möglich. Unter Ausnutzung des HDR-Mechanismus wird das Plasmid, das die DNA-Kassette von Interesse enthält, flankiert von homologen Sequenzen (500-1.000 bp)^9,10 stromaufwärts und stromabwärts der Zielstelle, als Vorlage verwendet, um den Doppelstrangbruch umzuschreiben, wobei auch die DNA-Kassette in die Zielsequenz⁹ kopiert wird.

Die CRISPR-Cas9-Technologie wurde verwendet, um mehrere Gene auszuschalten, die hauptsächlich mit den sensorischen Systemen der Mücke Aedes aegypti verbunden sind ¹¹, aber auch Gene, die mit der männlichen Fruchtbarkeit und der weiblichen Lebensfähigkeit (PgSIT) für die Populationskontrolle verbunden sind¹². Das Ausschalten von Zielgenen wurde auch durch das Einklopfen von Genen, die für fluoreszierende Marker kodieren, in die kodierenden Sequenzen spezifischer Gene^{erreicht 13,14}. Diese Strategie hat den Vorteil, dass sie nicht nur Frame-Shift-Mutationen induziert, sondern auch die Verwendung von Fluoreszenzlicht zur Sortierung der Individuen der neuen Knockout-Linie^{ermöglicht 13,14}. Das Genom von A. aegypti wurde auch mit Sequenzen binärer Expressionssysteme, wie dem Q-System (QF-QUAS)¹¹, editiert. Das Einklopfen des Gens, das für den QF-Transaktivator stromabwärts zu einem Promotor eines spezifischen Gens kodiert^, stellt eine definierte raumzeitliche Expression des Transaktivators^{sicher 15,16}. Sobald eine QF-exprimierende Mückenlinie mit einer anderen Mückenlinie gekreuzt wird, die die Bindungsstellen (QUAS) für QF enthält, bindet diese an diese und löst die Expression von Genen aus, die der QUAS-Sequenz^15,16 nachgeschaltet sind. Insgesamt ermöglicht dieses System die gewebe- und zeitspezifische Expression solcher Effektorgene, bei denen es sich um Fluoreszenzmarker handeln kann, die zur Zelllokalisierung oder zum Nachweis neuronaler Aktivität verwendet werden, und sogar Cas9-Nukleasen zur Störung von Genen in bestimmten Geweben (d. h. somatischer Knockout)¹¹.

Unter Berücksichtigung aller verfügbaren Informationen für die genetische Transformation von A. aegypti stellen wir hierin ein detailliertes Protokoll mit Schritt-für-Schritt-Anweisungen zur Durchführung der Genom-Editierung mit dem CRISPR-Cas9-System durch embryonale Mikroinjektion zur Verfügung. Strategien zur Erzeugung von Knockout durch Frame-Shift-Mutationen und Deletionen, die durch NHEJ vermittelt werden, und Knockin-Linien, durch HDR-vermittelte Genkassetten-Insertionen, werden diskutiert.

Protokoll

Einzelheiten zu den Geräten und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Alle Tiere wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren behandelt, wie von den National Institutes of Health empfohlen. Die Verfahren wurden vom UCSD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, Animal Use Protocol #S17187) und UCSD Biological Use Authorization (BUA #R2401) genehmigt.

1. gRNAs und Spenderplasmid-Design

1. Für die Herstellung von Knockout-Mutanten entwerfen Sie zwei gRNAs im Abstand von ~20-100 bp (Abbildung 1A).
   1. Design von 20 bp gRNAs für CRISPR-Cas9, ohne die PAM-Sequenz (NGG), unter Verwendung eines Online-Tools (Abbildung 1A), wie z. B. CHOPCHOP ( https://chopchop.cbu.uib.no/)¹⁷oder Benchling (benchling.com) oder CRISPOR (http://crispor.gi.ucsc.edu/)¹⁸. Wählen Sie die spezifischsten und off-target-freien gRNAs für Experimente aus, wie vom Online-Tool vorgeschlagen.
   2. Stellen Sie sicher, dass eine effiziente Restriktionsenzym-Schneidstelle in der Sequenz zwischen den gRNA-Schnittstellen enthalten ist (Abbildung 1A). Fügen Sie eine Restriktionsenzymstelle zwischen gRNA-Schnittstellen ein, um eine schnelle visuelle Bestätigung erfolgreicher Bearbeitungen zu ermöglichen.
      HINWEIS: Wenn die Deletion erfolgt, wird die Restriktionsstelle entfernt, so dass das Enzym die Sequenz nicht schneidet und eine einzelne, ungeschnittene Bande auf einem Gel erzeugt, um die Deletion zu bestätigen.
2. Für HDR-vermittelte Genkassetten-Insertionen entwerfen Sie mehrere gRNAs mit den genannten Werkzeugen zur Herstellung von Knockout-Mutanten und wählen Sie nach späterer Auswertung die effektivste aus.
3. Design von Donor-Plasmiden für die homologiegerichtete Reparatur (HDR), die Homologiearme an der Zielstelle, die Cargo-DNA-Sequenz, einen Fluoreszenzmarker, den Ursprung der Replikation und ein Antibiotikaresistenzgen enthalten (Abbildung 1B).
   1. Wählen Sie die Homologiearme aus den stromaufwärts und flussabwärts gelegenen Regionen der Zielstelle, die sich jeweils über 500 bis 1.000 bp¹⁰ erstrecken (Abbildung 1B).
   2. Wählen Sie die Frachtsequenz aus, die einen Fluoreszenzmarker, ein Gen von Interesse oder ein regulatorisches Element (z. B. QF2) enthalten kann.
   3. Wählen Sie einen fluoreszierenden Marker aus. Gängige Fluoreszenzmarker, die für A. aegypti verwendet werden, sind in einer DNA-Kassette enthalten, die einen Promotor, ein Fluoreszenzmarker-kodierendes Gen und eine 3'-UTR-Sequenz enthält. Weitere Informationen finden Sie in der Diskussion.

2. Vorbereitung der Injektionsmischung

1. Verdünnen Sie das Cas9-Protein mit dem Cas9-Verdünnungspuffer auf 1 μg/μl.
   HINWEIS: Cas9 nicht mehr als 2x auftauen und einfrieren. Es ist ratsam, Aliquote des Cas9-Proteins zu machen.
2. Kaufen Sie die gRNAs ein oder stellen Sie sie im eigenen Haus her.
   HINWEIS: Verwenden Sie für die Eigenproduktion standardmäßige RNA-Dekontaminationsverfahren und RNAse-freie Materialien.
   1. Entwerfen Sie 4-6 gRNAs und wählen Sie die beiden besten gRNAs für die Injektion aus (siehe In-vitro-Spaltungsassay unten).
   2. Entwerfen Sie einen Forward-Primer, der die T7-Promotorsequenz stromaufwärts der gRNA-Sequenz enthält. Verwenden Sie den universellen gRNA-Reverse-Primer für die Nicht-Template-PCR-Reaktionen, wie unten beschrieben. Die überlappende Sequenzbase paart sich mit der entsprechenden Sequenz im universellen Reverse-Primer (fett und unterstrichen), wodurch eine Vorlage für die DNA-Polymerase zur Amplifikation ihrer Sequenzen entsteht.
      HINWEIS: Für diese PCR-Reaktionen sollte der Forward-Primer den T7-Promotor (fett) enthalten, gefolgt von zwei Guaninen (wichtig für die Transkriptionsinitiierung über die T7-RNA-Polymerase), der 20-Nukleotid-Sequenz der gRNA (N₂₀; ohne PAM-Sequenz) und der Primer-Überlappungssequenz (unterstrichen).
      Primer vorne: 5'- GAAATTAATACGACTCACTATAGGN₂₀ GTTTTAGAGCTAGAAATAGC- 3'
      Grundierung Rückseite: 5''-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTT CAAGTTGATAACGGACTAGC
      CTTATT TTAACTT GCTATTTCTAGCTCTAAAAC - 3'
   3. Synthetisieren Sie das DNA-Template durch Nicht-Template-PCR. Richten Sie mehrere Reaktionen ein (jede enthält 12,5 μl des 2x Mastermixes, 1,25 μl der 10 μM Lösung des Forward Primers, 1,25 μl der 10 μM Lösung des Reverse Primers und 10 μl Reinstwasser), so dass genügend PCR-Produkt (300 ng) für die in vitro Transkriptionsreaktion zur Verfügung steht. Unter folgenden PCR-Bedingungen sind folgende Bedingungen anzuwenden: anfängliche Denaturierung für 30 s bei 98 °C; 35 Zyklen Verstärkung für 10 s bei 98 °C, 10 s bei 62 °C und 10 s bei 72 °C; Endausdehnung bei 72 °C für 2 min; und Lagerung bei 4 °C.
   4. Bestätigen Sie die Amplifikation eines einzelnen DNA-Fragments (122 Basenpaare) auf einem Agarosegel (2%).
   5. Reinigen Sie die PCR-Vorlage mit einem PCR-Aufreinigungskit gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
   6. Führen Sie eine In-vitro-Transkriptionsreaktion mit einem T7-Transkriptionskit durch. Mischen Sie 2 μl 10x Reaktionspuffer, je 2 μl Nukleotide (ATP, CTP, UTP und GTP), 2 μl T7-RNA-Polymerase, 3 μl der Matrizen-DNA (100 ng/μl) und 5 μl Reinstwasser. Die Mischung wird bei 37 °C mindestens 2 h (nicht länger als 16 h) bis über Nacht (12 h) inkubiert.
      HINWEIS: Bei dieser Reaktion bindet die T7-RNA-Polymerase an den T7-Promotor, der in der Primer-Forward-Sequenz enthalten ist, was zur Transkription der gRNA führt.
   7. Behandeln Sie die Transkriptionsreaktion mit DNase, indem Sie 1 μl DNase hinzufügen (gut mischen) und 15 Minuten lang bei 37 °C inkubieren.
   8. Reinigen Sie die synthetisierten sgRNAs mit einem Transkriptions-Cleanup-Kit, indem Sie die Empfehlungen des Herstellers befolgen.
   9. Führen Sie einen In-vitro-Spaltungsassay durch, um die Schneideffizienz der ausgewählten gRNAs zu beurteilen (Abbildung 1C).
      1. Entwerfen Sie Primer zur Amplifikation eines DNA-Fragments (500-1.000 bp), das die gRNA-Schneidstelle flankiert.
      2. Richten Sie die PCR-Reaktionen wie folgt ein: 12,5 μl des 2x Mastermixes, 1,25 μl der 10 μM Lösung des Forward Primers, 1,25 μl der 10 μM Lösung des Reverse Primers, 9 μl Reinstwasser und 1 μl 5 ng/μl Template-DNA.
      3. Es sind folgende PCR-Bedingungen zu verwenden: Bedingungen: anfängliche Denaturierung für 30 s bei 98 °C; 35 Amplifikationszyklen für 10 s bei 98 °C, 15-30 s bei X °C (ideale Glühtemperatur für Primer) und 35 s bei 72 °C; Endausdehnung bei 72 °C für 2 min; und abschließende Langzeitlagerung bei 4 °C.
      4. Beziehen Sie sich auf die Richtlinien des Herstellers für die besten Verstärkungstemperaturen und die beste Zeitspanne. Poolen Sie mindestens fünf Reaktionen oder skalieren Sie das Volumen der Reagenzien hoch, so dass nach der PCR-Aufreinigung (Einzelbande) oder der Aufreinigung der Agarose-Gel-PCR-Bande genügend PCR-Produkt (1,5-2 μg) erhalten wird.
      5. Richten Sie Cas9-Spaltungsreaktionen mit rekombinantem Cas9 ein, indem Sie die folgende Mischung 1 h lang bei 37 °C inkubieren: 1 μl 10x Cas9-Reaktionspuffer, 0,35 μl rekombinantes Cas9 (1 μg/μl), 1 μl gRNA (100 ng/μl), 6,65 μl Reinstwasser und 1 μl 300 ng/μl Template-DNA.
      6. Richten Sie eine negative Kontrollreaktion ohne gRNA ein.
      7. Überprüfen Sie die Spaltungseffizienz, indem Sie Reaktionen auf einem Agarosegel (1,5-2,0 %; Abbildung 1C).

3. Zusammenbau des Spenderplasmids

1. PCR-amplifizieren Sie die Homologiearme aus der genomischen DNA von A. aegypti.
   1. Informationen zum Primer-Design finden Sie in den Richtlinien des Herstellers des Klon-Kits. Verwenden Sie ein Online-Tool (z. B. Benchling), das Unterstützung für das Plasmiddesign und die Assemblierung mit verschiedenen Klonierungsstrategien bietet (z. B. Gibson, Golden Gate und Restriktionsenzym-basierte Klonierung).
   2. Amplifizieren Sie die Frachtsequenz aus genomischer DNA von A. aegypti oder bestellen Sie ein kommerziell synthetisiertes Genfragment.
   3. Amplifizieren Sie fluoreszierende Marker aus Plasmiden im eigenen Haus.
2. Ligate DNA-Fragmente aus den Schritten 3.1.1 bis 3.1.3 durch Gibson-Assemblierung in das Rückgrat eines vorhandenen Plasmids. Inkubieren Sie eine Mischung aus 10 μl 2x Mastermix, X μL aller DNA-Fragmente und 10-X μl Reinstwasser bei 50 °C für 1 h.
   HINWEIS: Für die Berechnung des idealen Verhältnisses von Einsätzen zum Plasmidrückgrat beziehen Sie sich auf die Richtlinien des Herstellers.
   1. Berechnen Sie die Konzentrationen jedes Klonierungsfragments in Picomol: pmols = (Gewicht in ng) × 1.000/(Basenpaare × 650 Dalton).
   2. Verwenden Sie 50-100 ng Plasmidrückgrat und einen 2-3-fachen molaren Überschuss jedes Einsatzes.
   3. Wenn Sie 2-3 Fragmente assemblieren, fügen Sie 0,02-0,5 pmol jedes Fragments in die Gibson-Reaktion ein. Wenn Sie 4-6 Fragmente zusammensetzen, fügen Sie von jedem 0,2-1,0 pmol hinzu.
3. Verwenden Sie 3-5 μl der Gibson-Assemblierungsreaktion, um E . coli-kompetente Zellen JM109 zu transformieren.
   HINWEIS: JM109 wurde für die Gibson-Assemblierung aufgrund seines recA-Genotyps ausgewählt, der unerwünschte Rekombinationsereignisse reduziert und eine Nukleaseverschleppung während der Zellernte verhindert, wodurch die Integrität der assemblierten DNA-Fragmente gewährleistet wird
   Für Plasmide, die größer als 10 kb sind, empfehlen wir die Transformation von DH5α-kompetenten Zellen unter Verwendung des erweiterten Protokolls gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
4. Expandieren Sie die transformierten Bakterien und reinigen Sie das Plasmid mit einem Miniprep-Kit.
5. Zur Bestätigung der korrekten Plasmidassemblierung führen Sie einen diagnostischen Restriktionsenzymverdau mit der gereinigten Plasmid-DNA durch und visualisieren Sie es durch Agarosegelelektrophorese (Abbildung 1D, E).
   HINWEIS: Wir empfehlen die Verwendung eines Online-Tools für die Auswahl einiger Restriktionsenzyme, die das Plasmid an einer einzigen Stelle schneiden können. Software wie Benchling verfügt über ein integriertes Tool, das den virtuellen Verdau von Plasmidsequenzen mit den ausgewählten Restriktionsenzymen durchführt und das erwartete DNA-Bandenmuster auf einem virtuellen Elektrophoresegel anzeigt (Abbildung 1D).
   1. Führen Sie den Verdau des Plasmidrestriktionsenzyms durch. Eine Mischung aus 1 μl 10x Restriktionsverdau-Puffer, 0,5 μl Restriktionsenzym 1, 0,5 μl Restriktionsenzym 2, 1 μl Plasmid-DNA (300 ng/ml) und 7 μl Reinstwasser bei 37 °C für 2 h inkubieren.
   2. Führen Sie die Restriktionsverdaureaktionen an einem Agarosegel (1,5%) durch.
      HINWEIS: Das DNA-Bandenmuster (Abbildung 1E) sollte dem Muster der virtuellen Digest-Bande (Abbildung 1D) ähneln. Plasmide können auch für die Sequenzierung ganzer Plasmide eingesandt werden, wenn ein Service verfügbar ist.
6. Kulturieren Sie den Plasmidklon in 150 ml LB-Medien.
7. Führen Sie das Plasmid Maxiprep gemäß den Richtlinien des Herstellers durch.
8. Suspendieren Sie das Plasmid in Reinstwasser.

4. Mischen des Injektionskonstrukts

HINWEIS: Die empfohlenen Endkonzentrationsbereiche für jedes Konstrukt sind in Tabelle 1 aufgeführt. Beginnen Sie mit einem Verhältnis von 2:1:2 (ng Cas9: ng sgRNA: ng Donorplasmid) und passen Sie es nach Bedarf an, um die HDR-Effizienz zu optimieren. Die Überwachung der Ergebnisse hilft dabei, die effektivste Kombination zu identifizieren.

1. Zur Herstellung von Knockout-Mutanten,
   1. Verdünnen Sie das Aliquot des Cas9-Proteins mit dem Cas9-Verdünnungspuffer auf die gewünschte Konzentration und verdünnen Sie das Aliquot der gRNA mit Reinstwasser.
   2. Mischen Sie das Cas9-Protein mit jeder gRNA vor, um einen Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex zu bilden. Kombinieren Sie die vorgemischten Lösungen.
2. Für HDR-vermittelte Genkassetten-Insertionen,
   1. Cas9-Protein und gRNAs verdünnen und mischen, wie für die Herstellung von Knockout-Mutanten empfohlen.
   2. Verdünnen Sie das Spenderplasmid mit Reinstwasser.
   3. Kombinieren Sie alle Konstrukte.

5. Ziehen und Laden von Mikroinjektionsnadeln

1. Verwenden Sie Quarzfilament, um die Injektionsnadeln zu ziehen (Abbildung 2). Achte darauf, dass das Filament 10 cm lang, mit einem Außendurchmesser von 1 mm und einem Innendurchmesser von 0,7 mm ist.
2. Ziehen Sie die Nadeln mit einem Laser-Mikropipettenabzieher mit einem der folgenden zwei Programme:
   Programm 1: Hitze 805, Filament 4, Geschwindigkeit 50, Verzögerung 145, Zug 145
   Programm 2: Hitze 650, Filament 4, Geschwindigkeit 40, Verzögerung 150, Zug 156
   HINWEIS: Programm 1 führt zu einer dünneren, aber längeren Nadelspitze, wodurch es für Injektionen mit Konstrukten mit niedrigerer Konzentration geeignet ist, bei denen eine feinere Spitze für die Präzision von Vorteil ist. Programm 2 ergibt eine kürzere, aber dickere Nadelspitze, ideal für Injektionen mit höherer Konzentration, da das Konstrukt dicker ist und eine stabilere Nadel erfordert.

6. Entnahme von Embryonen

1. Bereiten Sie einen elektrischen oder manuellen Sauger vor, um Mücken zu sammeln, und verwenden Sie Plastikfläschchen für die Entnahme und Embryonenentnahme.
2. Befeuchten Sie weißes Kreisfilterpapier und legen Sie es an die Innenwand oder auf feuchte Watte im Auffangbehälter.
3. Geben Sie 5-10 weibliche Mücken, die vor 5-10 Tagen mit Blut gefüttert wurden, in den Auffangbehälter. Stellen Sie den Sammler für 45 Minuten in die Dunkelheit.
4. Nehmen Sie die Filterpapiere für die Embryonenentnahme heraus.

7. Aufstellung der Embryonen

1. Verwenden Sie einen Wildtyp-Stamm (Liverpool) von A. aegypti für die Embryoinjektion.
2. Wählen Sie Embryonen im Präblastodermstadium, insbesondere solche, die eine hellgraue Farbe haben, aus dem Entnahmepapier aus (Abbildung 3).
3. Übertragen Sie einige Embryonen mit einer benetzten Bürste auf das doppelseitige Klebeband, das auf einem Deckglas angebracht ist. Richten Sie die Embryonen parallel aus, während ihre Umgebung noch feucht ist, und stellen Sie sicher, dass sie nebeneinander liegen, wobei alle hinteren Enden nach vorne zeigen.
4. Sobald sie richtig positioniert sind, lassen Sie die Umgebung leicht trocknen, um die Embryonen an Ort und Stelle zu halten.
5. Geben Sie während der Ausrichtung Halocarbon Oil 700 auf die Embryonen, um ein Austrocknen zu verhindern.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Embryonen nicht von Wasser umgeben sind, wenn Sie das Öl hinzufügen, da dies dazu führen würde, dass die Embryonen im Öl schwimmen.

8. Mikroinjektion des Embryos

HINWEIS: Die Injektion erfolgt bei Raumtemperatur oder bei 18 °C. Die Temperatur von 18 °C wird aus praktischen Gründen empfohlen, da sie die Entwicklung des Embryos verzögert.

1. Richten Sie einen Mikroinjektor mit folgenden Parametern ein: Ausgleichsdruck (Pc) 300 hPa, Injektionsdruck (Pi) 500 hPa. Passen Sie diese Bedingungen bei Bedarf an.
2. Laden Sie 3 μl des gemischten Konstrukts mit einem Mikrolader in eine Nadel.
3. Legen Sie das Deckglas mit den ausgerichteten Embryonen auf einen Objektträger (Abbildung 3). Positionieren Sie das Deckglas und schieben Sie es zur Injektion unter das Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass das hintere Ende des Embryos in Richtung der Nadel positioniert ist.
4. Stecken Sie eine Nadel zusammen mit einem Mikromanipulator in einen Nadelhalter und positionieren Sie die Nadel in einem Winkel von 10° zum hinteren Ende der ausgerichteten Embryonen und halten Sie sie stationär (Abbildung 4A). Öffnen Sie die Nadel vorsichtig unter einem Mikroskop und berühren Sie sie leicht mit dem Rand eines Deckglases.
   HINWEIS: Eine andere Möglichkeit besteht darin, eine kleine Öffnung in der Nadel zu erzeugen, indem Sie mit einem Embryo darauf klopfen. Es wird jedoch eine etwas breitere Nadelöffnung empfohlen, da die Klebrigkeit des Cas9-Proteins die Nadel verstopfen kann.
5. Bewegen Sie das Gleitglas in Richtung der Injektionsnadel (Abbildung 5).

9. Nachsorge des injizierten Embryos

1. Verwenden Sie fusselfreie Einwegtücher, um das Öl zu entfernen, das die Embryonen umgibt.
2. Fügen Sie deionisiertes Wasser hinzu, um die Embryonen zu spülen, und legen Sie die Embryonen auf ein feuchtes Filterpapier. Legen Sie das nasse Filterpapier auf ein feuchtes Tuch in Karat 9 oz Becher (Abbildung 4B und Abbildung 6A,B).
3. Legen Sie nasse Watte auf den Boden des Bechers, um die Feuchtigkeit zu halten (Abbildung 6B).
4. Bewahren Sie die injizierten Embryonen auf nassem Filterpapier auf.

10. Schlüpfen der Embryonen und G0-Larvenscreening

1. Mindestens 4 Tage nach der Injektion das Filterpapier mit den Embryonen zum Schlüpfen in ca. 3 l deionisiertes Wasser in Sterilite 6-Liter-Pfannen geben.
   HINWEIS: Die Eier schlüpfen in der Regel innerhalb von 2 Wochen nach der Injektion effizienter. Stellen Sie sicher, dass die Eier während dieser Zeit feucht bleiben. Das Filterpapier sollte nicht zu nass sein, da zu viel Feuchtigkeit zu einem frühen Schlüpfen der Embryonen führen kann. Eine längere Konservierung kann zwar die Schlupfraten verbessern, sollte aber nicht länger als einen Monat dauern, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Die Verwendung von sauerstoffarmem Wasser kann auch beim Schlüpfen helfen.
2. Sobald die G0-Larven geschlüpft sind, geben Sie mit Wasser vermischtes Fischfutter als Futter in die Pfanne.
3. Untersuchen Sie die G0-Larven im 3. bis 4. Larvenstadium auf den Fluoreszenzmarker (Abbildung 7).
4. Halten Sie die Larven getrennt nach ihrem Fluoreszenzstatus, wobei fluoreszierend-positive und fluoreszierend-negative Larven in getrennten Pfannen gehalten werden.

11. Geschlechtssortierung von Puppen und Auskreuzung in den Wildtyp

1. Trennen Sie die injizierten Mücken nach Geschlecht, wenn sie sich verpuppen, und verwenden Sie zur Identifizierung größen- und geschlechtsspezifische Strukturen am Genitallappen:
   1. Männchen: Kleinere Größe, ein markanterer und spitzerer Genitallappen und breitere Paddel (Strukturen am hinteren Ende der Puppen; Abbildung 8A 1,A2).
   2. Weibchen: Größere Größe, ein kleinerer und weniger ausgeprägter Genitallappen und schmalere Paddel (Abbildung 8B1, B2).
2. Pool fluoreszierend positive oder fluoreszierend-negative Mücken jedes Geschlechts.
3. Kreuzen Sie die gepoolten Mücken mit Mücken des anderen Geschlechts aus dem Liverpool-Stamm aus. Verwenden Sie ein Verhältnis von 3:1 bis 5:1 von Wildtyp zu G0-Mücke.
4. Kreuzen Sie die Mücken für 4 Tage.
5. Versorgen Sie die Weibchen nach der Überquerung mit einer Blutmahlzeit.

12. G1-Vorführung

1. Drei Tage nach der Blutfütterung stellen Sie Eierbecher bereit, indem Sie ein Papiertuch in die Wand der Karat-9-Unzen-Becher legen und etwa 3 Unzen deionisiertes Wasser hinzufügen.
2. Nach 3-4 Tagen werden die G1-Embryonen entnommen und ausgebrütet. Untersuchen Sie die G1-Larven auf den Fluoreszenzmarker im 3. bis 4. Stadium des Stadiums (Abbildung 7).
3. Sammeln Sie die fluoreszierenden Larven, was auf eine HDR-Insertion hindeutet. Wenn die fluoreszierenden G1-Individuen das Puppenstadium erreichen, trennen Sie sie nach Geschlecht und setzen Sie jedes Geschlecht in separate Käfige.
4. Kreuzen Sie die fluoreszierenden G1-Mücken mit Individuen des anderen Geschlechts des Liverpool-Stammes aus.

13. Bestätigung der G1-Einstichstelle

1. Nachdem Sie die Blutmahlzeit verabreicht haben, richten Sie G1-Weibchen für die Eiablage eines einzelnen Weibchens ein, indem Sie ein kleines Stück Papiertuch in einzelne Drosophila-Fläschchen legen und 3 ml deionisiertes Wasser hinzufügen.
2. Für Knockout-Mutanten:
   1. Nach der Eiablage verdunstet das Wasser und das Papiertuch trocknet aus, schlüpfen Sie die Eier von Weibchen aus, die eindeutig Knockout-Mutationen aufweisen, und erhalten Sie die G2-Generation.
   2. Sammeln Sie den Körper der G1-Mütter, die erfolgreich G2-Nachkommen geschlüpft haben, und extrahieren Sie DNA.
   3. Verwenden Sie die DNA als Vorlage für die PCR, um die Sequenz zu amplifizieren, die die Zielstelle bedeckt. Stellen Sie sicher, dass die Primer ein DNA-Fragment von ~200 bp amplifizieren. Richten Sie die Reaktionen ein (jede enthält 12,5 μl des 2x Mastermixes, 1,25 μl der 10 μM Lösung des Forward Primers, 1,25 μl der 10 μM Lösung des Reverse Primers, 9 μl Reinstwasser und 1 μl Template-DNA [5 ng/μL]). Unter folgenden PCR-Bedingungen sind folgende Bedingungen anzuwenden: anfängliche Denaturierung für 30 s bei 98 °C; 35 Amplifikationszyklen für 10 s bei 98 °C, 15-30 s bei X °C (ideale Glühtemperatur der Primer) und 10 s bei 72 °C; Endausdehnung bei 72 °C für 2 min; und abschließende Langzeitlagerung bei 4 °C.
   4. Reinigen Sie die PCR-Fragmente und führen Sie einen Restriktionsenzymverdau der PCR-Fragmente durch, indem Sie eine Mischung aus 1 μl 10x Restriktionsverdau-Puffer, 0,5 μl Restriktionsenzym 1, 0,5 μl Restriktionsenzym 2, 1 μl PCR-Fragment (200 ng/ml) und 7 μl Reinstwasser bei 37 °C für 30 Minuten inkubieren.
      HINWEIS: Bestimmte Restriktionsenzyme können ohne vorherige Reinigung im PCR-Mix verwendet werden.
   5. Visualisieren Sie den PCR-Fragmentverdau durch Gelelektrophorese, um zu bestätigen, ob eine Spaltung stattgefunden hat.
   6. Sequenzieren Sie das unverdaute PCR-Fragment, um die Knockout-Mutationen zu identifizieren.
   7. Für HDR-vermittelte Insertionen nach der Eiablage:
      1. Sammeln Sie den Körper der G1-Mütter und extrahieren Sie DNA.
      2. Verwenden Sie DNA als Vorlage für die PCR, um die Sequenz zu amplifizieren, die die Zielstelle bedeckt.
      3. Führen Sie eine Sequenzierung des amplifizierten DNA-Fragments durch, um die Integrität der eingefügten DNA-Kassette zu bestätigen.
      4. Brüte das Ei aus und erhalte die G2-Generation.

14. Ausbau der neuen CRISPR-Linien

1. Für Knockout-Mutantenlinien:
   1. Setze G2-Weibchen für die Eiablage ein, mit 20 Weibchen pro G1. Jedes G1 steht für eine Zeile.
   2. Bestätigen Sie nach der Eiablage die Knockout-Mutationen auf die gleiche Weise wie bei G1.
   3. Fahren Sie mit fünf G1-Linien fort, die eindeutig identifizierte Mutationen sowohl in G1 als auch in G2 aufweisen. Brüte die Eier aus, die du von G2 jeder Linie gesammelt hast, wodurch die G3-Generation entsteht.
   4. Wählen Sie aus den fünf gekreuzten Linien zwei Linien mit eindeutig identifizierten Mutationen und hoher Fitness oder den gewünschten Phänotyp aus.
   5. Kreuzen Sie G3-Hündinnen aus jeder ausgewählten Linie mit Männchen aus dem Liverpool-Stamm aus.
   6. Setze 50 einzelne Weibchen für die Eiablage aus jeder Linie ein. Bestätigen Sie Knockout-Mutationen, wie zuvor für G1 durchgeführt.
      HINWEIS: Erhöhen Sie die Anzahl der Frauen in der Einrichtung, um die Vielfalt zu erhalten.
   7. Wiederholen Sie die Verfahren für zwei weitere Generationen mit den beiden Linien (Abbildung 4J).
2. Für neue HDR-vermittelte Einfügezeilen:
   1. Überprüfen Sie das Vorhandensein von fluoreszierenden Personen in der G2-Generation.
   2. Kreuzen Sie G2-Mücken von jedem G1-Individuum mit dem Liverpool-Stamm aus. Jedes G1-Individuum steht für eine Linie.
   3. Fahren Sie mit drei weiteren Generationen der Auskreuzung fort. Überprüfen Sie kontinuierlich den Fluoreszenzmarker und beobachten Sie die Fitness¹⁹ jeder Linie (Abbildung 4x).
   4. Wählen Sie eine Linie mit korrekten Einfügungen und hoher Fitness und dem gewünschten Phänotyp.

15. Machen Sie homozygote Linien

1. Für Knockout-Mutantenlinien:
   1. Generation G6:
      1. Die von G5 produzierten Eier ausbrüten und die G6-Generation erhalten.
      2. Kreuzen Sie G6-Erwachsene innerhalb ihrer jeweiligen Linien (Abbildung 4K und Abbildung 9A).
      3. Setzen Sie 50 einzelne G6-Weibchen für die Eiablage pro Linie ein und brüten Sie die Eier wie zuvor beschrieben aus (Abbildung 9B).
      4. Sammeln Sie die G6-Weibchen, die erfolgreich G7-Nachkommen geschlüpft haben, extrahieren Sie DNA und führen Sie PCR und Restriktionsenzymverdauung durch, wie dies bei G1 der Fall ist (Abbildung 9C).
         HINWEIS: In diesem Schritt kann ein einfacher und kostengünstiger Quetschpuffer (SB) für die DNA-Extraktion verwendet werden.
         1. Mazerieren Sie mit einer Handmühle eine einzelne Mücke in 100 μl 1x SB (10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA und 25 mM NaCl). Proteinase K (200 μg/ml) zugeben und 30 min lang bei 37 °C inkubieren, gefolgt von 95 °C für 2 min. Bei 10.000 × g 5 min runterschleudern und den Überstand²⁰ einsammeln.
      5. Bestätigen Sie die Mutation, indem Sie die Ergebnisse auf einem Gel visualisieren.
      6. Die Eier, die von Weibchen ohne Mutationen produziert wurden, werden verworfen (Abbildung 9D).
      7. Behalten Sie Larven von Weibchen mit bestätigten Mutationen bei, um mehrere G7-Linien zu etablieren, und verwerfen Sie Bruten ohne Mutationen (Abbildung 9D).
   2. Generation G7:
      1. Kreuzung von Weibchen und Männchen innerhalb jeder G7-Linie (Abbildung 9E).
      2. Setzen Sie 10 einzelne G7-Weibchen für die Eiablage pro Linie ein und brüten Sie die Eier wie zuvor beschrieben aus (Abbildung 9F).
      3. Sammeln Sie die G7-Weibchen, die erfolgreich G7-Nachkommen geschlüpft haben, extrahieren Sie DNA und führen Sie PCR und Restriktionsenzymverdauung durch (Abbildung 9G).
      4. Erkennen Sie Knockout-Mutationen auf beiden Allelen oder einem einzelnen Allel, indem Sie die Ergebnisse auf einem Gel visualisieren.
      5. Behalten Sie Larven von G7-Weibchen bei, bei denen Knockouts in beiden Allelen bestätigt wurden, wodurch die G8-Generation entsteht (Abbildung 9H). Bruten ohne Mutationen verwerfen (Abbildung 9H).
         HINWEIS: Dieser Schritt stellt sicher, dass die Weibchen homozygot sind. In G8 bestätigt die Prüfung der Homozygotie der Nachkommen, ob die Väter auch homozygot sind."
   3. Generation G8:
      1. Kreuzen Sie G8-Erwachsene pro G7-weiblicher Linie (Abbildung 9I).
      2. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip fünf G8-Männchen aus, extrahieren Sie DNA und führen Sie PCR und Restriktionsenzymverdauung durch (Abbildung 9J).
      3. Geben Sie eine Blutmahlzeit und brüten Sie die Eier von G8-Weibchen aus, die mit G8-Männchen gekreuzt wurden, bei denen Knockouts in beiden Allelen bestätigt wurden.
      4. Fahren Sie mit den G7-Linien fort, bei denen alle nachgewiesenen Männchen Knockouts in beiden Allelen aufweisen, was darauf hindeutet, dass diese Linien homozygot sind.
2. Für HDR-vermittelte Einfügezeilen:
   1. Die von G5 produzierten Eier ausbrüten und die G6-Generation erhalten. Screening der Larven im G6-Stadium auf fluoreszierende Marker.
   2. Larven ohne fluoreszierende Marker entsorgen (Abbildung 4xi).
   3. Kreuzen Sie Mücken, die fluoreszierende Marker aufweisen.
   4. Dieses Verfahren wird für jede weitere Generation fortgesetzt, bis keine nicht fluoreszierende Larve mehr beobachtet wird. Zu diesem Zeitpunkt ist die Mückengrenze homozygot.

Ergebnisse

Design und Validierung von gRNA-vermitteltem Gen-Targeting für die HDR-Homologie-Rekombination
Um sicherzustellen, dass das gewünschte Gen genau anvisiert wird, empfehlen wir, einige gRNAs auszuwählen und die 5'- und 3'-Homologiearme in der Nähe der Schnittstelle für die HDR-vermittelte homologe Rekombination zu positionieren (Abbildung 1A). Zum Beispiel haben wir zwei gRNAs so konzipiert, dass sie au...

Diskussion

Die CRISPR-Cas-Technologie hat die Landschaft der Genom-Editierung verändert, indem sie zielspezifische Veränderungen in den Chromosomen^{fördert 1}. Obwohl transponierbare Elemente für die Entstehung der ersten transgenen Mücken essentiell waren, sind ihre Insertionsstellen etwas zufällig, und die Expression des Cargo-Konstrukts (Promotor + Gen) entspricht möglicherweise nicht dem Expressionsprofil des tatsächlichen Gens aufgrund eines Genompositionseffekts ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Cas9 reaction buffer	PNA Bio	CB01
Benchling software	Benchling	N/A	www.benchling.com
Cas9 dilution buffer	PNA Bio	CB03
Cas9 protein	PNA Bio	CP01-50
DH5α E. coli Competent Cells	New England Biolabs	C2987
Double-sided sticky tape	Scotch Permanent	3136
Drosophila vials	Genesee Scientific	32-109
Filter papers	GE Healthcare Life Science	1450-042
Fish food	Tetra	B00025Z6YI	goldfish flakes
Flugs	Genesee Scientific	AS273
Fluorescent microscope	Leica Microsystems	M165 FC
Gene fragment	Integrated DNA Technologies	N/A
gRNA	Synthego	N/A
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Injection microscope	Leica Microsystems	DM2000
JM109  E. coli Competent Cells	Zymo Research	T3005
Microinjector	Eppendorf		FemtoJet 4x
Microloader Tips for Filling Femtotips	Eppendorf	E5242956003
Micromanipulator	Eppendorf		TransferMan 4r
Micropipette Pullers	Sutter Instrument	P-2000
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-542-B
Microscope slide	Eisco	12-550-A3
Mouse blood (live mice used for feeding)	University of California	IACUC, Animal Use Protocol #S17187	Used for mosquito blood feeding; details comply with animal ethics protocols
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase	New England Biolabs	M0491S
PCR Purification Kit	Qiagen	28004
Plasmid Miniprep Kit	Zymo Research	D4036
Quartz filament	Sutter Instruments	QF100-70-10
Transcription Clean-Up Kit	Fisher Scientific	AM1908
Ultra-pure water	Life Technologies	10977-023