دراسة ملامح الترميز للتحفيز الجسدي على الاستجابات العصبية المقفلة بالقلب في القرن الظهري الشوكي للفئران

Summary

نصف بروتوكولا للتسجيل خارج الخلية متعددة القنوات للعمود الفقري جنبا إلى جنب مع تسجيل وظائف القلب وتحليل الخلايا العصبية للقرن الظهري الشوكي المغلق بالقلب. توفر هذه الطريقة إطارا متزامنا زمنيا لدراسة آليات العمود الفقري الكامنة وراء التغيرات الوظيفية الصدرية الحشوية الناجمة عن الوخز بالإبر.

Abstract

اقترحت العديد من الدراسات أن الوخز بالإبر الكهربائية قد يكون مفيدا في علاج أمراض القلب والأوعية الدموية والوقاية منها. ومع ذلك، لا تزال آليتها غير مفهومة جيدا. يلعب القرن الظهري الشوكي الصدري (SDH) دورا مهما في دمج وتعديل المدخلات الجسدية والحشوية ، والتي قد تؤثر بعد ذلك على التحكم في القلب. على عكس SDH القطني ، الذي تمت دراسته على نطاق واسع ، فقد تم استكشافه بشكل أقل من SDH الصدري بسبب صعوبة التعرض الجراحي والتثبيت التجسيمي. في هذه الدراسة ، نقدم نهجا عاما لمراقبة النشاط العصبي ووظيفة القلب في وقت واحد من خلال الجمع بين تسجيل مخططات كهربية القلب ومصفوفات الأقطاب الكهربائية. علاوة على ذلك ، نصف كيفية تحديد الخلايا العصبية المقفلة بالقلب عن طريق حساب توزيع معدل إطلاق النشاط العصبي بالتزامن مع ضربات القلب. هذه الاستراتيجية ذات أهمية كبيرة لدراسة العلاقة بين وظيفة القلب والأوعية الدموية والنشاط العصبي وكذلك لفهم المنعكس القلبي الجسدي الناجم عن تحفيز الأعصاب الطرفية.

Introduction

يعمل الوخز بالإبر أو تحفيز سطح الجسم ، كتقنية علاجية بارزة في إطار الطب الصيني التقليدي (TCM) ، عن طريق تحفيز مناطق معينة على سطح الجسم. يسهل التنظيم متعدد المستويات لوظائف الكائن الحي من خلال تنظيم الوظائف الحشوية عبر المسارات الواردة ، والتكامل المركزي ، والآليات العصبية الصادرة اللاإرادية. من الأمور الأساسية لهذا العلاج مفهوم أن التحفيز المستهدف لنقاط الوخز المحددة تشريحيا يحفز التنظيم الفسيولوجي الجهازي. تدعم الأدلة السريرية المتزايدة دور الوخز بالإبر كطريقة تكميلية في إدارة اضطرابات القلب والأوعية الدموية ، مع فعالية مثبتة في كل من بروتوكولات الوقاية الأولية والعلاج المساعد^1،2.

تنتهي الوافدات الأولية للخلايا العصبية الحسية في الغالب في القرن الظهري الشوكي (SDH) ، وفي المقابل ، تلعب الخلايا العصبية للقرن الظهري الشوكي (SDHNs) دورا مهما في تكامل وتعديل المدخلات الجسدية^3،4،5. علاوة على ذلك ، تتلقى SDHRNs أيضا الوافدين القلبيين وتنقل المعلومات الحشوية إلى الخلايا العصبية السابقة للعقدة الودية للنخاع الشوكي (SPNs) لتعديل القلب والأوعية الدموية⁶. تقع SPNs المقفلة بالقلب في الزاوية الجانبية للجزء الصدري من الحبل الشوكي (T1-T5) ، مع محاور بارزة على العقد العنقية أو الصدرية وبالتالي تعصيب القلب عبر الأعصاب القلبية والوسطى والسفلية. نتيجة لذلك ، يلعب الحبل الشوكي الصدري دورا مهما في تكامل وتعديل المدخلات الجسدية والحشوية ، والتي قد تؤثر بعد ذلك على التحكم في القلب. لذلك من المهم فهم كيف ينظم التحفيز الجسدي وظيفة القلب من خلال تعديل SDHRNs في الجزء الصدري من الحبل الشوكي.

أظهرت الدراسات السابقة أن الوخز بالإبر الكهربائية في PC6 (المنظم في الجزء الشوكي T3 كوحدة بنية ووظيفة متجانسة) يمكن أن يخفف من أعراض نقص تروية عضلة القلب من خلال تعديل الجهاز العصبي اللاإرادي^7،8،9. ومع ذلك ، فإن التزامن الكمي في الوقت الفعلي لتأثيرات الوخز بالإبر على معدل ضربات القلب مع نشاط الجهاز العصبي لم يتحقق بعد. تم توثيق مؤشرات النشاط العصبي اللاإرادي الفوري ومخطط كهربية القلب (ECG) فقط بعد الوخز بالإبر. لا تزال الأبحاث التي تربط SDHNs بالوظائف الفسيولوجية الحشوية نادرة. نظرا للانحناء الفسيولوجي للفقرات الصدرية والمسافة الضيقة بين الأجزاء الفقرية الصدرية المجاورة ، وخاصة T1-T5 ، فإن الوصول إلى هذه المناطق يمثل تحديا ، مما يؤدي إلى أدلة مباشرة ضئيلة لتوضيح آليات العمود الفقري الكامنة وراء الوخز بالإبر في نقطة الوخز بالإبر المتجانسة للعمود الفقري T3 PC6 التي تنظم وظيفة القلب في علاج الأمراض القلبية الوعائية.

لفهم العلاقة بين SDH وتنظيم وظائف القلب بوساطة الوخز بالإبر بشكل أفضل ، يجب تنفيذ التسجيل المتزامن لوظائف القلب والأنشطة العصبية. هنا ، سوف نقدم نهجا عاما للتسجيل خارج الخلية متعددة القنوات في العمود الفقري جنبا إلى جنب مع تسجيل وظائف القلب بالإضافة إلى تحليل SDHRNs المقفلة بالقلب. توفر هذه الطريقة إطارا متزامنا زمنيا لدراسة آليات العمود الفقري الكامنة وراء التغيرات الوظيفية الصدرية الحشوية الناجمة عن الوخز بالإبر.

Protocol

التزم بروتوكول التجارب على بشكل صارم بمتطلبات المعيار الوطني "المبادئ التوجيهية للمراجعة الأخلاقية لرعاية المختبر" (GB / T 35892-2018) وتمت الموافقة عليه من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة للمؤسسة. تم استخدام ذكور فئران Sprague-Dawley (SD) من درجة SPF ، تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع ووزنها حوالي 220 جراما ، في هذه الدراسة. تم ارتداء عباءات المختبر والقفازات والأقنعة خلال جميع التجارب. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد. في نهاية التجربة ، تم القتل الرحيم للفئران عن طريق التروية القلبية تحت التخدير العميق متبوعا بخلع عنق الرحم.

1. إعداد ما قبل الجراحة

1. قم بتوصيل دائرة جهاز التنفس الصناعي بأنبوب القصبة الهوائية على شكل حرف Y ، مما يضمن واجهة آمنة ومحكمة الإغلاق.
2. تحقق من التهوية المناسبة عن طريق التأكد من تدفق الهواء المستقر وحجم المد والجزر المناسب وإعدادات معدل التنفس على شاشة جهاز التنفس الصناعي.
3. تأكد من عدم وجود ملوثات مكثفة أو جسيمات داخل الأنبوب من خلال فحص جميع الأجزاء بصريا تحت الإضاءة الساطعة.
4. قم بتغذية إشارات تخطيط القلب المضخمة في نفس الوقت في كل من مدخلات مخطط كهربية القلب ومنفذ الإدخال التناظري لنظام تسجيل مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة باستخدام موصل BNC ثلاثي الاتجاهات.
5. قم بتوجيه الإشارات المضخمة من خلال مقسم BNC ثلاثي الاتجاهات لتوصيل المدخلات التناظرية لمخطط كهربية القلب ومنفذ الإدخال التناظري لنظام تسجيل المصفوفة الكهربائية الدقيقة في وقت واحد.
6. قم بإنشاء مشغلات التزامن عن طريق توصيل إخراج TTL لمخطط كهربية القلب بالإدخال الرقمي لنظام تسجيل مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة. باستخدام كبل واجهة BNC إلى Dupont ، ابدأ الاستحواذ المتزامن على كلا النظامين ، والتحقق من المحاذاة الزمنية.

2. التحضير قبل الجراحة

1. التخدير
   1. تحفيز التخدير بنسبة 3-5٪ من الأيزوفلوران عن طريق الاستنشاق ثم إعطاء حقنة داخل الصفاق من البنتوباربيتال الصوديوم (50 مجم / كغ) للفأر المخدر. قم بإعطاء الأيزوفلوران للتخدير بالاستنشاق قبل وضع الأقطاب الكهربائية ، مع الحفاظ على تركيز ~ 1.2٪. المضي قدما فقط إذا قمت بتقييم عمق التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم قبل المتابعة.
   2. قم بإزالة الشعر من الرقبة الأمامية والخلفية للفئران.
   3. ضع الجرذ في وضع ضعيف على بطانية دافئة وضع مرهما على عيون الفئران لمنع الجفاف. راقب معدل التنفس وتحقق من استجابات الانسحاب عن طريق الضغط على وسادة القدم بالملقط.

3. التنبيب الرغامي

1. ضع الفئران في وضع ضعيف وقم بتطهير منطقة الرقبة بصبغة اليود.
2. قم بإجراء شق طولي يبلغ حوالي 1 سم على طول خط الوسط للرقبة وتشريح الأنسجة العضلية بصراحة
3. بمجرد تعرض الغدة الدرقية ، افصل الغشاء الرقيق بعناية بين فصين من الغدة الدرقية ، مع الحرص على عدم إتلاف أنسجة الغدة الدرقية. تابع لفضح القصبة الهوائية.
4. افحص "القنية على شكل حرف Y للتأكد من أنها جافة تماما. استخدم مقص زنبركي لعمل شق عرضي في القصبة الهوائية ، متبوعا بإدخال القنية في فتحة القصبة الهوائية. قم بتأمين قنية القصبة الهوائية ب 3-0 خيوط غير قابلة للامتصاص لمنع تسرب الهواء ونزع الأنبوب العرضي.
5. قم بخياطة عضلات الرقبة والجلد بعناية وقم بتوصيل الفئران بجهاز التنفس الصناعي. اضبط معدل التنفس على 85 نفسا / دقيقة وحجم المد والجزر إلى 3.5 مل ، وفقا لوزن جسم الفئران⁷ (الشكل 1 ب).

4. كشف تخطيط القلب

1. أدخل ثلاثة أقطاب كهربائية في جلد الفئران: القطب الموجب في الطرف السفلي الأيسر ، والقطب السالب في الطرف العلوي الأيمن ، والقطب الأرضي في الطرف السفلي الأيمن¹⁰.
2. الحصول على البيانات باستخدام مخطط كهربية القلب (إعدادات المرشح: تمرير منخفض عند 100 هرتز، تمرير عالي عند 1 كيلو هرتز؛ تردد أخذ العينات: 4 كيلو هرتز / ثانية). استخدم برنامج تسجيل تخطيط القلب لتسجيل البيانات وحفظها وتحليلها.

5. قسطرة التامور لإعطاء الدواء براديكينين (BK)

1. ضع الجرذ في وضع ضعيف وقم بتطهير الجلد على الصدر باليود.
2. إجراء بضع الصدر بين الغضاريف الساحلية 1 و 3 في الجزء العلوي الأيسر من الصدر لفضح الغدة الصعترية. قم بتشريح الغدة الصعترية بصراحة على طول خط الوسط لفضح التامور (انظر الشكل 1 ج ، د).
3. استخدم طرف إبرة تشريح زجاجية (قطرها 0.5 مم) لعمل فتحة صغيرة في التامور.
4. أدخل قسطرة سيليكون بطول 10-15 سم مع عدة ثقوب صغيرة في نهايته البعيدة من خلال شق في التامور. ثبت القسطرة في أنسجة جدار الصدر باستخدام الغراء الحيوي.
5. أغلق تجويف الصدر طبقة تلو الأخرى ، مع التأكد من بقاء تنفس الفئران دون عائق (انظر الشكل 1 د).

6. التعرض للحبل الشوكي T3

1. ضع الفئران في وضع الانبطاح وقم بالتطهير الروتيني باليود. قم بعمل شق بطول 8 سم تقريبا على طول خط الوسط للظهر من الفقرات T2 إلى T6.
2. استخدم مقص زنبركي لقطع طبقات الجلد والعضلات ، بما في ذلك العضلة شبه المنحرفة. أدخل ضام بين العضلات لكشف المجال الجراحي بشكل أكبر.
3. افصل بعناية الغدد الدهنية والسبات في الجانب الأمامي من الفقرات الصدرية للفئران ، وتجنب الأوعية الدموية الموجودة أسفل الغدد (انظر الشكل 1 ه).
4. قم بإزالة العضلات المرتبطة بمشبك الرأس والجزء المستقيم من عضلات الرقبة الطويلة ، مما يكشف عن العمليات الشائكة ل T2.
5. قم بإزاحة عضلات العمود الفقري والعمود الفقري لفضح القوس الفقري من T2 إلى T6 (انظر الشكل 1E). استخدم rongeurs لإزالة العملية الشائكة للفقرة T3 ، وبالتالي تعريض الحبل الشوكي T3.
   ملاحظة: أثناء عملية تعريض الفقرات الصدرية ، تأكد من إيلاء اهتمام خاص للحفاظ على العملية الشائكة ل T2 ، لأنها بمثابة النقطة الأساسية لتطبيق القوة للتعرض اللاحق للحبل الشوكي T3.
6. قم بإزالة الأم الجافية والغشاء العنكبوتي ، وقم بتقطير زيت البارافين على سطح الحبل الشوكي للحفاظ على صلاحية الخلايا العصبية الشوكية (انظر الشكل 1F).
   ملاحظة: تنشأ الأوعية الدموية للأنسجة الدهنية البنية للفئران في الصفيحة T3 أو T4 أو T5 وتتوزع مثل الجيوب الأنفية الوريدية. احرص على عدم لمسها ، فقد يتسبب ذلك في فقدان الدم المفرط في الفئران.

7. تثبيت الفقرات الصدرية والإعدادات

1. استخدم مشبك العمود الفقري المخصص لتأمين العمليات المفصلية ل T2 و T6. بلل العضلات المحيطة بالمحلول الملحي للحفاظ على الترطيب.
2. قم بتوصيل مصفوفة الأقطاب الكهربائية بأداة مجسمة وقم بإدخالها عموديا في القرن الظهري للحبل الشوكي في الجزء الشوكي T3 من خلال التلم المتوسط الظهري ، 500 ميكرومتر جانبيا إلى خط الوسط ، على عمق 1,500 ميكرومتر.
3. أدخل القطب المرجعي في عضلة الظهر (انظر الشكل 1G).
4. قم بتشغيل برنامج التسجيل متعدد القنوات خارج الخلية وانتقل إلى ملف | تكوين الأجهزة حدد مصفوفة 32 قناة من قائمة واجهة الجهاز ؛ انقر بزر الماوس الأيمن على مجموعة القنوات المحددة ؛ ثم اختر خصائص من قائمة السياق . تكوين معلمات معالجة الإشارة: ضمن علامة التبويب عامل التصفية ، اضبط مرشاح ممر النطاق (BP) على 250 هرتز - 5 كيلو هرتز؛ في حقل معدل أخذ العينات ، أدخل kHz/s 30؛ قم بتمكين خوارزميات الكشف عن السنبلة عن طريق تحديد المربع المسمى تمكين معالجة سبايك لتنشيط فرز الارتفاع في الوقت الفعلي واستخراج الأحداث المستندة إلى العتبة.
   ملاحظة: تأكد من إزالة شاملة للعضلات والأنسجة المحيطة بالعمليات المفصلية ل T2 و T6 ، خاصة في المنطقة التي يتم فيها تطبيق المشبك الشوكي المخصص لتثبيت العمود الفقري ، لمنع النزوح أثناء التجارب اللاحقة.

8. المحفزات الجسدية و BK

1. استخدم BK (1 ميكروغرام / مل في الماء المقطر) للحث على تحفيز الألم القلبي. حقن 4 ميكرولتر من محلول BK بحقنة دقيقة متصلة بقسطرة سيليكون بعدة فتحات صغيرة¹¹.
2. مراقبة تغيرات معدل ضربات القلب (زيادة أو نقصان) والإفراز العصبي (زيادة أو نقصان) في القرن الظهري للحبل الشوكي T3 في غضون 30 دقيقة من الحقن لتحديد التفاعلات الديناميكية بين الخلايا العصبية للقرن الظهري في الحبل الشوكي الصدري.
3. إجراء الوخز بالإبر اليدوي عند نقطة الوخز بالإبر PC6 (MAPC6) باستخدام معلمة التحفيز 1 هرتز. يقع PC6 (نقطة الوخز بالإبر Neiguan) على بعد 2 مم من المفصل الرسغي على الساعد البطني ، بين العضلات الرأسية المثنية وجذع العصب المتوسط. أدخل الإبر (0.25 مم × 25 مم) في نقاط الوخز بالإبر PC6 على عمق ~ 3 مم. قارن بين التغيرات في النشاط العصبي ووظيفة القلب قبل وبعد المحفزات الجسدية.

9. تحليل البيانات ومعالجتها

1. قم باستيراد البيانات العصبية المسجلة بتنسيق ns6 إلى البرنامج التالي:
   1. تحويل الملفات: انتقل إلى ملف | افتح لتحميل ملف ns6. حدد ملف | حفظ باسم واختر تنسيق .nex5 لإنشاء بيانات قطار سبايك قياسية.
   2. فرز سبايك: قم باستيراد ملفات .nex5 المحولة إلى برنامج التصنيف لتصنيف الخلايا العصبية. فرز أشكال موجات الارتفاع بناء على خصائص شكل الموجة وتحليل المكون الرئيسي (PCA) ، مع تعيين معلمات العتبة عند ±3 SD من ضوضاء خط الأساس.
   3. بعد ذلك ، قم بتنفيذ التعليمات البرمجية ذات الصلة لتصفية الإشارات وتصنيفها.
2. تحليل SDRNs المقفلة بالقلب.
   1. مع أخذ الموجة R كحدث مرجعي ، احسب عدد عمليات إطلاق الخلايا العصبية خلال نافذة 0.2 ثانية قبل وبعد كل موجة R.
   2. بعد حساب موجات R على فترات 50 مللي ثانية ، قم بإنشاء رسم بياني لحدث الحلقة. تطبيع الرسم البياني (أي طرح متوسط معدل التفريغ في 0.2 ثانية قبل وبعد حدث الموجة R) للحصول على توزيع معدل التفريغ لنشاط كل خلية عصبية أثناء ضربات القلب.
   3. تقييم الدلالة الإحصائية من خلال اختبار التقليب مونت كارلو¹² ، الذي تم تنفيذه مع 1,000 تكرار مختلط. احصل على توزيع معدل إطلاق النار وفاصل الثقة للخلايا العصبية في عملية ضربات القلب العشوائية عن طريق التوزيع العشوائي 0.2 ثانية من الوقت قبل وبعد كل موجة من ضربات القلب R (النطاق ± 0.1 ثانية). إذا تجاوز توزيع إطلاق ضربات قلب الخلية العصبية (أكبر من أو أقل من) فاصل الثقة البالغ 95٪ لتوزيع معدل إطلاق النار لعملية ضربات القلب العشوائية ، فحدد الخلايا العصبية على أنها خلية عصبية مقفلة بالقلب (انظر الملف التكميلي 1).

النتائج

باتباع البروتوكول أعلاه ، تم الكشف عن T3 SDHNs ، مع إعطاء براديكينين (BK) أو الوخز بالإبر الجسدية لمناطق التامور / الوخز بالإبر. حدد هذا التحقيق ملامح تنشيط الخلايا العصبية المنبهة (النوع / التردد) وتغيرات تخطيط القلب الكهربائي المتزامنة (ECG) أثناء المدخلات الحشوية المحسبة للأ?...

Discussion

يعد فك تشفير ملفات تعريف الترميز العصبي SDH أمرا ضروريا لفهم آلية التعديل العصبي للتأثير العلاجي الناجم عن الوخز بالإبر على الخلل الوظيفي الحشوي. هنا ، قمنا بدمج تقنية التسجيل في المنطقة الحية مع نظام تسجيل تخطيط القلب لتسجيل نشاط تفريغ T3 SDHNs و ECG في وقت واحد. يمكن أن ي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia System	Kent Scientific	SomnoSuite
Central v6.5	Black Microsystems	Cerebus-128
Fine Scissors	Fine Scissors	Fine Scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science T ools	16220-14
Gelatin Sponges	Coltene	274-007
Intubation Cannula	Harward Apparatus	73-2737
Isoflurane	RWD	R510
LabChart Professional Software	LabChart Professional Software	Version 8.0
microband electrode array	Neuronexus	A1x32-6mm-50-177
micromanipulator	Narishige	DMA-1510
needles	Zhongyantaihe	0.25 mm x 0.25 mm
NeuroExplorer software (V5.0)	Plexon	V5.0
offline Sorter	Plexon	V4.0
Powerlab	ADInstruments	PL26T04
rats	the Experimental Center of the Academy of Military Medical Sciences of the People's Liberation Army of China
Spinal Adaptor	N/A	N/A	Custom made
Spring Scissors	Fine Science Tools	15023-10
stereotactic instrument	Narishige	SR-5R-HT