쥐 척추 등쪽 뿔(Rat Spinal Dorsal Horn)의 심장 잠금 뉴런 반응에 대한 체세포 자극의 코딩 프로파일 연구

요약

우리는 심장 기능을 기록하고 심장 잠금 척추 등쪽 뿔 뉴런을 분석하는 것과 함께 척추 다채널 세포 외 기록을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법은 침술에 의해 유발된 흉추의 내장 기능 변화의 기저에 있는 척추 메커니즘을 연구하기 위한 시간적으로 동기화된 틀을 제공합니다.

초록

많은 연구에서 전기 침술이 심혈관 질환의 치료와 예방에 도움이 될 수 있다고 제안했습니다. 그러나 그 메커니즘은 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다. 흉추 등쪽 뿔(SDH)은 심장 조절에 영향을 미칠 수 있는 체세포 및 내장 입력을 통합하고 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 광범위하게 연구된 요추 SDH와 대조적으로, 흉추 SDH는 외과적 노출과 정위 고정의 어려움으로 인해 연구가 적었습니다. 이 연구에서는 심전도와 미세 전극 어레이의 기록을 결합하여 신경 활동과 심장 기능을 동시에 모니터링하기 위한 일반적인 접근 방식을 제공합니다. 또한 심장 박동과 동기화된 뉴런 활동의 발사 속도 분포를 계산하여 심장 고정 뉴런을 식별하는 방법을 설명합니다. 이 전략은 심혈관 기능과 신경 활동 사이의 상관 관계를 연구하고 말초 신경 자극에 의해 유발되는 체성 심장 반사를 이해하는 데 매우 중요합니다.

서문

침술 또는 신체 표면 자극은 전통 중국 의학(TCM)의 틀 내에서 두드러진 치료 기법으로, 신체 표면의 특정 부위를 자극함으로써 작동합니다. 그것은 구심성 경로(afferent pathways), 중추 통합(central integration) 및 자율신경 원심성 신경 기전(autonomic efferent nervous mechanisms)을 통한 내장 기능의 조절을 통해 유기체의 기능에 대한 다단계 조절을 촉진합니다. 이 치료법의 핵심은 해부학적으로 정의된 경혈의 표적 자극이 전신의 생리적 조절을 유도한다는 개념입니다. 침술요법이 심혈관 질환 관리에 있어 보완적인 방법으로서 역할을 한다는 임상적 증거가 늘어나고 있으며, 1차 예방과 보조 치료 프로토콜 모두에서 효과가 입증되고 있다 ^1,2.

감각 뉴런의 일차 구심성은 주로 척추 등쪽 뿔(spinal dorsal horn, SDH)에서 말단하며, 이에 따라 척추 등쪽 뿔 뉴런(spinal dorsal horn neuron, SDHN)은 체세포 입력의 통합 및 조절에 중요한 역할을 합니다 ^3,4,5. 또한, SDHRN은 심장 구심성(cardiac afferent)을 수신하고 심혈관 조절을 위해 척추 교감신경 신경절전 뉴런(spinal sympathetic preganglionic neuron, SPN)에 내장 정보를 전달합니다⁶. 심장 잠금 SPN은 척수(T1-T5)의 흉부 분절 측면 모서리에 위치하며, 축삭은 경추 또는 흉부 신경절로 돌출된 후 심장, 중간 및 하부 신경을 통해 심장에 신경을 분포시킵니다. 결과적으로, 흉추 척수는 체세포 및 내장 입력의 통합 및 조절에 중요한 역할을 하며, 이는 심장 조절에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 체세포 자극이 척수의 흉부 분절에서 SDHRN의 조절을 통해 심장 기능을 어떻게 조절하는지 이해하는 것이 중요합니다.

이전 연구에서는 PC6의 전기침술(T3 척추 분절에서 동종주제 구조-기능 단위로 조직됨)이 자율신경계의 조절을 통해 심근허혈 증상을 완화할 수 있음을 입증했다 ^7,8,9. 그러나 신경계 활동과 함께 심박수에 대한 침술의 효과에 대한 실시간 정량적 동기화는 아직 실현되지 않았습니다. 침술 치료 후 즉각적인 자율신경 활동과 심전도(ECG) 지표만 문서화되었습니다. SDHN과 내장 생리적 기능을 연결하는 연구는 여전히 부족합니다. 흉추의 생리학적 곡률과 인접한 흉추 분절, 특히 T1-T5 사이의 좁은 공간으로 인해 이러한 영역에 접근하는 것이 어렵기 때문에 CVD 치료에서 심장 기능을 조절하는 T3 척추 동종 경혈 PC6에서 침술의 기저에 있는 척추 메커니즘을 설명할 수 있는 직접적인 증거가 부족합니다.

SDH와 침술 매개 심장 기능 조절 사이의 관계를 더 잘 이해하기 위해서는 심장 기능과 신경 활동의 동기 기록이 구현되어야 합니다. 여기에서는 심장 기능 기록과 함께 척추 다채널 세포 외 기록에 대한 일반적인 접근 방식을 제공하고 심장 잠금 SDHRN을 분석합니다. 이 방법은 침술에 의해 유발된 흉추의 내장 기능 변화의 기저에 있는 척추 메커니즘을 연구하기 위한 시간적으로 동기화된 틀을 제공합니다.

프로토콜

동물 실험 프로토콜은 국가 표준 "실험실 동물 복지에 대한 윤리적 검토 지침"(GB/T 35892-2018)의 요구 사항을 엄격하게 준수했으며 해당 기관의 윤리 위원회에서 승인했습니다. 이 연구에는 생후 6-8주, 체중 약 220g의 수컷 SPF 등급 Sprague-Dawley(SD) 쥐가 사용되었습니다. 모든 실험 중에는 실험용 가운, 장갑, 마스크를 착용했다. 시약과 사용된 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다. 실험이 끝날 무렵, 쥐는 깊은 마취 상태에서 심장 관류를 통해 안락사시킨 후 경추 탈구를 일으켰습니다.

1. 수술 전 설정

1. 인공호흡기 회로를 Y자형 기관내관에 연결하여 안전하고 밀폐된 인터페이스를 보장합니다.
2. 인공호흡기 디스플레이에서 안정적인 공기 흐름, 적절한 일회량 및 호흡수 설정을 확인하여 적절한 환기를 확인하십시오.
3. 밝은 조명 아래에서 모든 세그먼트를 육안으로 검사하여 튜브 내부에 응축수 또는 미립자 오염 물질이 없는지 확인합니다.
4. 3방향 BNC 커넥터를 사용하여 증폭된 ECG 신호를 심전도 입력과 미세 전극 어레이 기록 시스템의 아날로그 입력 포트에 동시에 공급합니다.
5. 증폭된 신호를 3방향 BNC 스플리터를 통해 라우팅하여 심전도 아날로그 입력과 미세 전극 어레이 기록 시스템의 아날로그 입력 포트를 동시에 연결합니다.
6. 심전도의 TTL 출력을 미세 전극 어레이 기록 시스템의 디지털 입력에 연결하여 동기화 트리거를 설정합니다. BNC-듀퐁 인터페이스 케이블을 사용하여 두 시스템에서 동시 수집을 시작하여 시간 정렬을 확인합니다.

2. 수술 전 준비

1. 마취
   1. 흡입으로 3-5% 이소플루란으로 마취를 유도한 후 마취된 쥐에게 펜토바르비탈 나트륨(50mg/kg)을 복강내 주사합니다. 전극을 배치하기 전에 흡입 마취를 위해 이소플루란을 투여하여 농도를 ~1.2%로 유지합니다. 진행하기 전에 발가락 꼬집기를 통해 마취 깊이를 평가하는 경우에만 진행하십시오.
   2. 쥐의 앞쪽 목과 뒤쪽 뒤쪽에서 털을 제거합니다.
   3. 쥐를 따뜻한 담요 위에 누운 자세로 놓고 쥐의 눈에 연고를 발라 건조를 방지합니다. 호흡 속도를 관찰하고 집게로 발판에 압력을 가하여 금단 반응을 확인합니다.

3. 기관 삽관

1. 쥐를 누운 자세로 놓고 요오드 팅크로 목 부위를 소독합니다.
2. 목 정중선을 따라 약 1cm의 세로로 절개하여 근육 조직을 둔탁하게 절개합니다.
3. 갑상선이 노출되면 갑상선 조직이 손상되지 않도록 주의하면서 두 갑상선 엽 사이의 얇은 막을 조심스럽게 분리합니다. 기관을 노출시키십시오.
4. "Y자형 캐뉼라를 검사하여 완전히 건조되었는지 확인합니다. 스프링 가위를 사용하여 기관을 가로 절개한 다음 기관 개구부에 캐뉼라를 삽입합니다. 공기 누출 및 우발적인 발관을 방지하기 위해 3-0 비흡수성 봉합사로 기관 캐뉼라를 고정합니다.
5. 목 근육과 피부를 조심스럽게 봉합하고 쥐를 인공 호흡기에 연결하십시오. 쥐의 체중⁷에 따라 호흡수를 85 breaths/min으로 조정하고 일회 호흡량을 3.5 mL로 조정합니다.

4. ECG 감지

1. 쥐의 피부에 3개의 전극을 삽입하십시오: 양극은 왼쪽 하지에, 음극은 오른쪽 상지에, 접지 전극은 오른쪽 하지에¹⁰.
2. 심전도계를 사용하여 데이터를 수집합니다(필터 설정: 100Hz에서 저역 통과, 1kHz에서 고역 통과, 샘플링 주파수: 4kHz/s). ECG 기록 소프트웨어를 사용하여 데이터를 기록, 저장 및 분석할 수 있습니다.

5. 약물 투여를 위한 심낭 카테터 삽입: 브래디키닌(BK)

1. 쥐를 누운 자세로 놓고 가슴 피부를 요오드로 소독합니다.
2. 왼쪽 가슴 위쪽의 1번째와 3번째 늑연골 사이에 흉선을 노출시켜 흉선을 노출시킵니다. 심낭을 노출시키기 위해 정중선을 따라 흉선을 흉선으로 흉선을 절개합니다( 그림 1C, D 참조).
3. 유리 절제 바늘 끝(직경 0.5mm)을 사용하여 심낭에 작은 구멍을 만듭니다.
4. 심낭의 절개 부위를 통해 말단 끝에 여러 개의 작은 구멍이 있는 10-15cm 길이의 실리콘 카테터를 삽입합니다. 바이오 접착제를 사용하여 카테터를 흉벽 조직에 고정합니다.
5. 흉강을 한 겹씩 닫아 쥐의 호흡이 방해받지 않도록 합니다( 그림 1D 참조).

6. T3 척수 노출

1. 쥐를 엎드린 자세로 놓고 요오드로 일상적인 소독을 수행합니다. T2에서 T6 척추까지 등 정중선을 따라 약 8cm를 절개합니다.
2. 스프링 가위를 사용하여 승모근을 포함한 피부와 근육층을 자릅니다. 근육 사이에 견인기를 삽입하여 수술 영역을 더 노출시킵니다.
3. 쥐의 흉추 앞쪽에 있는 지방샘과 동면샘을 조심스럽게 분리하고, 땀샘 아래의 혈관을 피한다( 그림 1E 참조).
4. 머리 클램프에 붙어있는 근육과 긴 목 근육의 곧은 부분을 제거하여 T2의 가시 돌기를 노출시킵니다.
5. 척추궁(semispinalis)과 척추근(spinalis muscle)을 변위시켜 척추궁(vertebral arch)을 T2에서 T6으로 노출시킨다( 그림 1E 참조). 롱거스를 사용하여 T3 척추의 가시돌기를 제거하여 T3 척수를 노출시킵니다.
   참고: 흉추를 노출시키는 과정에서 T2의 척추 돌기가 T3 척수의 후속 노출을 위한 주요 힘 가하는 지점 역할을 하므로 T2의 척추 돌기를 보존하는 데 특별한 주의를 기울여야 합니다.
6. 경막과 지주막을 제거하고 척수 표면에 파라핀 오일을 떨어뜨려 척수 뉴런의 생존력을 유지합니다( 그림 1F 참조).
   참고: 쥐의 갈색 지방 조직의 혈관은 T3, T4 또는 T5 판막에서 시작되어 정맥동처럼 분포되어 있습니다. 쥐에게 과도한 출혈을 유발할 수 있으므로 만지지 않도록 주의하십시오.

7. 흉추 고정 및 설정

1. 맞춤형 척추 클램프를 사용하여 T2 및 T6의 관절 돌기를 고정합니다. 주변 근육에 식염수를 적셔 수분을 유지합니다.
2. 전극 어레이를 정위 기구의 미세 조작기에 부착하고 정중선 측면 500μm의 등쪽 정중열구를 통해 T3 척추 분절의 척수 등쪽 뿔에 1,500μm 깊이까지 수직으로 삽입합니다.
3. 참조 전극을 등 근육에 삽입합니다( 그림 1G 참조).
4. 멀티채널 셀룰러 외 레코딩 소프트웨어를 실행하고 File(파일) | 하드웨어 구성; 장치 인터페이스 목록에서 32 채널 어레이를 선택합니다. 선택한 채널 그룹을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 그런 다음 상황에 맞는 메뉴에서 속성을 선택합니다. 신호 처리 매개변수 구성: 필터 탭에서 대역 통과 필터(BP)를 250Hz - 5kHz로 설정합니다. 샘플링 속도 필드에 30kHz/s를 입력합니다. Enable Spike Processing(스파이크 처리 활성화) 상자를 선택하여 스파이크 감지 알고리즘을 활성화하면 실시간 스파이크 정렬 및 임계값 기반 이벤트 추출이 활성화됩니다.
   참고: T2 및 T6의 관절 돌기를 둘러싼 근육과 조직, 특히 척추 고정을 위해 맞춤형 척추 클램프가 적용되는 부위를 철저히 청소하여 후속 실험 중 변위를 방지합니다.

8. 체세포와 BK 자극

1. BK(증류수 중 1μg/mL)를 사용하여 심장 통각 자극을 유도합니다. 여러 개의 작은 구멍이 있는 실리콘 카테터에 연결된 마이크로 주사기로 BK 용액 4μL를 주입합니다¹¹.
2. 주사 후 30분 이내에 T3 척수 등쪽 뿔의 심박수 변화(증가 또는 감소)와 신경 방전(증가 또는 감소)을 관찰하여 흉추 척수 등쪽 뿔 뉴런 간의 동적 상호 작용을 식별합니다.
3. 경혈 PC6(MAPC6)에서 1Hz의 자극 매개변수를 사용하여 수동 침술을 수행합니다. PC6(Neiguan 경혈)은 굴근 수근 요골과 정중 신경 줄기 사이의 복부 팔뚝의 수근 관절에 2mm 근접한 위치에 있습니다. 바늘(0.25mm x 25mm)을 ~3mm 깊이의 PC6 경혈에 삽입합니다. 체세포 자극 전후의 뉴런 활동과 심장 기능의 변화를 비교합니다.

9. 데이터 분석 및 처리

1. ns6 형식으로 기록된 신경 데이터를 소프트웨어로 다음과 같이 가져옵니다.
   1. 파일 변환: 파일로 이동 | ns6 파일을 로드하려면 엽니다. 파일 | 다른 이름으로 저장하고 .nex5 형식을 선택하여 표준화된 스파이크 트레인 데이터를 생성합니다.
   2. 스파이크 정렬: 변환된 .nex5 파일을 뉴런 분류를 위한 분류 소프트웨어로 가져옵니다. 파형 특성과 주성분 분석(PCA)을 기반으로 스파이크 파형을 정렬하며, 임계값 파라미터는 베이스라인 노이즈에서 ±3 SD로 설정됩니다.
   3. 그런 다음 신호를 필터링하고 분류하기 위한 관련 코드를 실행합니다.
2. 심박 SDRN을 분석합니다.
   1. R파를 참조 이벤트로 삼아 각 R파의 전후 0.2초 창 내에서 뉴런이 발화하는 횟수를 계산합니다.
   2. 50ms 간격으로 R파를 계수한 후 링 이벤트 히스토그램을 만듭니다. 히스토그램을 정규화하여(즉, R-wave 이벤트 전후 0.2초 동안의 평균 방전율을 뺀다) 심장 박동 동안 각 뉴런 활동의 방전율 분포를 구합니다.
   3. 1,000번의 셔플링 반복으로 구현된 Monte Carlo¹² 순열 테스트를 통해 통계적 유의성을 평가합니다. 각 하트비트 R파(범위는 0.1초 ±)의 전후 시간을 0.2초 동안 무작위화하여 무작위 하트 비트 과정에서 뉴런의 발사 속도 분포 및 신뢰 구간을 구합니다. 뉴런 심장 박동의 발화 분포가 무작위 심장 박동 과정의 발화 속도 분포의 95% 신뢰 구간을 초과하면(보다 크거나 작음) 뉴런을 심장 잠금 뉴런으로 식별합니다( 보충 파일 1 참조).

결과

위의 프로토콜에 따라, T3 SDHN은 브래디키닌(BK) 또는 체세포 니들링(somatic needling)을 주위/경혈 부위에 투여하여 노출시켰다. 이 조사는 통각 내장 입력, BK 적용 및 체성 감각 조절 중 자극 유발 신경 활성화 프로파일(유형/주파수) 및 동시 심전도(ECG) 변화를 정량화했습니다.

그림 2A는 쥐의 T3 척수의 가로 절편을 보여줍니다. 왼쪽?...

토론

SDH 신경 세포 코딩 프로파일을 해독하는 것은 내장 기능 장애에 대한 침술 유도 치료 효과의 신경 조절 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다. 여기에서는 MEA 생체 내 기록 기술과 ECG 기록 시스템을 결합하여 T3 SDHN과 ECG의 방전 활동을 동시에 기록했습니다. 심장 통증 자극은 심장에 신경을 공급하고 내장, DRG, T1-T5 척수 및 척상척수를 통해 통각 정보를 전방으로 전...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia System	Kent Scientific	SomnoSuite
Central v6.5	Black Microsystems	Cerebus-128
Fine Scissors	Fine Scissors	Fine Scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science T ools	16220-14
Gelatin Sponges	Coltene	274-007
Intubation Cannula	Harward Apparatus	73-2737
Isoflurane	RWD	R510
LabChart Professional Software	LabChart Professional Software	Version 8.0
microband electrode array	Neuronexus	A1x32-6mm-50-177
micromanipulator	Narishige	DMA-1510
needles	Zhongyantaihe	0.25 mm x 0.25 mm
NeuroExplorer software (V5.0)	Plexon	V5.0
offline Sorter	Plexon	V4.0
Powerlab	ADInstruments	PL26T04
rats	the Experimental Center of the Academy of Military Medical Sciences of the People's Liberation Army of China
Spinal Adaptor	N/A	N/A	Custom made
Spring Scissors	Fine Science Tools	15023-10
stereotactic instrument	Narishige	SR-5R-HT