Étude des profils codants de la stimulation somatique sur les réponses neuronales à verrouillage cardiaque dans la corne dorsale spinale du rat

Résumé

Nous décrivons un protocole d’enregistrement extracellulaire multicanal de la colonne vertébrale parallèlement à l’enregistrement de la fonction cardiaque et à l’analyse des neurones de la corne dorsale de la colonne vertébrale verrouillés cardiaquement. Cette méthode offre un cadre temporel synchronisé pour l’étude des mécanismes spinaux sous-jacents aux changements fonctionnels viscéraux thoraciques induits par l’acupuncture.

Résumé

De nombreuses études ont suggéré que l’électroacupuncture pourrait être bénéfique dans le traitement et la prévention des maladies cardiovasculaires. Cependant, son mécanisme reste mal compris. La corne dorsale thoracique (SDH) joue un rôle important dans l’intégration et la modulation des entrées somatiques et viscérales, qui peuvent ensuite influencer le contrôle cardiaque. Contrairement à la SDH lombaire, qui a été largement étudiée, la SDH thoracique a été moins explorée en raison de la difficulté d’exposition chirurgicale et de la fixation stéréotaxique. Dans cette étude, nous proposons une approche générale pour surveiller simultanément l’activité neuronale et la fonction cardiaque en combinant l’enregistrement d’électrocardiogrammes et de réseaux de microélectrodes. De plus, nous décrivons comment identifier les neurones verrouillés cardiaques en calculant la distribution de la vitesse de décharge de l’activité neuronale en synchronisation avec les battements cardiaques. Cette stratégie est d’une grande importance pour l’étude de la corrélation entre la fonction cardiovasculaire et l’activité neuronale ainsi que pour la compréhension du réflexe somatocardiaque déclenché par les stimulations nerveuses périphériques.

Introduction

L’acupuncture ou stimulation de la surface du corps, en tant que technique thérapeutique de premier plan dans le cadre de la médecine traditionnelle chinoise (MTC), fonctionne en stimulant des zones spécifiques de la surface du corps. Il facilite la régulation à plusieurs niveaux des fonctions de l’organisme par la régulation des fonctions viscérales via les voies afférentes, l’intégration centrale et les mécanismes nerveux efférents autonomes. Au cœur de cette thérapie se trouve le concept selon lequel la stimulation ciblée de points d’acupuncture anatomiquement définis induit une régulation physiologique systémique. De plus en plus de preuves cliniques soutiennent le rôle de l’acupuncture en tant que modalité complémentaire dans la gestion des troubles cardiovasculaires, avec une efficacité démontrée à la fois dans la prévention primaire et les protocoles de traitement d’appoint ^1,2.

Les afférences primaires des neurones sensoriels se terminent principalement dans la corne dorsale spinale (SDH), en conséquence, les neurones de la corne dorsale spinale (SDHN) jouent un rôle crucial dans l’intégration et la modulation des entrées somatiques ^3,4,5. De plus, les SDHRN reçoivent également des afférences cardiaques et transmettent des informations viscérales aux neurones préganglionnaires sympathiques de la colonne vertébrale (SPN) pour la modulation cardiovasculaire⁶. Les SPN à verrouillage cardiaque sont situés au coin latéral du segment thoracique de la moelle épinière (T1-T5), avec des axones projetés vers les ganglions cervicaux ou thoraciques et innervant ensuite le cœur via les nerfs cardiaques, moyens et inférieurs. De ce fait, la moelle épinière thoracique joue un rôle crucial dans l’intégration et la modulation des entrées somatiques et viscérales, ce qui peut ensuite influencer le contrôle cardiaque. Il est donc important de comprendre comment la stimulation somatique régule la fonction cardiaque par la modulation des SDHRN dans le segment thoracique de la moelle épinière.

Des études antérieures ont démontré que l’électroacupuncture à PC6 (organisée dans le segment rachidien T3 comme une unité homotopique structure-fonction) peut soulager les symptômes de l’ischémie myocardique par modulation du système nerveux autonome ^7,8,9. Cependant, la synchronisation quantitative en temps réel des effets de l’acupuncture sur la fréquence cardiaque avec l’activité du système nerveux n’a pas encore été réalisée. Seuls l’activité nerveuse autonome immédiate et les indicateurs d’électrocardiogramme (ECG) après l’acupuncture ont été documentés. Les recherches reliant les SDHN aux fonctions physiologiques viscérales restent rares. En raison de la courbure physiologique des vertèbres thoraciques et de l’espace étroit entre les segments vertébraux thoraciques adjacents, en particulier T1-T5, l’accès à ces zones est difficile, ce qui entraîne peu de preuves directes pour élucider les mécanismes spinaux sous-jacents à l’acupuncture au niveau de l’acupuncture homotopique spinale T3 PC6 régulant la fonction cardiaque dans le traitement des MCV.

Pour mieux comprendre la relation entre la SDH et la régulation de la fonction cardiaque médiée par l’acupuncture, l’enregistrement synchrone de la fonction cardiaque et des activités neuronales doit être mis en œuvre. Ici, nous fournirons une approche générale pour l’enregistrement extracellulaire multicanal de la colonne vertébrale parallèlement à l’enregistrement de la fonction cardiaque ainsi qu’à l’analyse des SDHRN à verrouillage cardiaque. Cette méthode offre un cadre temporel synchronisé pour l’étude des mécanismes spinaux sous-jacents aux changements fonctionnels viscéraux thoraciques induits par l’acupuncture.

Protocole

Le protocole d’expérimentation animale a strictement respecté les exigences de la norme nationale « Guidelines for Ethical Review of Welfare of Laboratory Animals » (GB/T 35892-2018) et a été approuvé par le comité d’éthique de l’institution. Des rats Sprague-Dawley (SD) mâles de grade SPF, âgés de 6 à 8 semaines et pesant environ 220 g, ont été utilisés dans cette étude. Des blouses de laboratoire, des gants et des masques ont été portés pendant toutes les expériences. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux. À la fin de l’expérience, des rats ont été euthanasiés par perfusion cardiaque sous anesthésie profonde suivie d’une luxation cervicale.

1. Configuration préopératoire

1. Connectez le circuit du ventilateur à la sonde endotrachéale en forme de Y, assurant une interface sûre et étanche à l’air.
2. Vérifiez une ventilation adéquate en confirmant un débit d’air stable, un volume courant approprié et des paramètres de fréquence respiratoire sur l’écran du ventilateur.
3. Assurez-vous de l’absence de condensat ou de contaminants particulaires à l’intérieur du tube en examinant visuellement tous les segments sous un éclairage intense.
4. Introduisez simultanément les signaux ECG amplifiés dans l’entrée de l’électrocardiographe et le port d’entrée analogique du système d’enregistrement du réseau de microélectrodes à l’aide d’un connecteur BNC à trois voies.
5. Acheminez les signaux amplifiés à travers un répartiteur BNC à trois voies pour connecter simultanément l’entrée analogique de l’électrocardiographe et le port d’entrée analogique du système d’enregistrement du réseau de microélectrodes.
6. Établissez des déclencheurs de synchronisation en connectant la sortie TTL de l’électrocardiographe à l’entrée numérique du système d’enregistrement du réseau de microélectrodes. À l’aide d’un câble d’interface BNC-Dupont, lancez l’acquisition simultanée sur les deux systèmes, en vérifiant l’alignement temporel.

2. Préparation préopératoire

1. Anesthésie
   1. Induire une anesthésie avec 3 à 5 % d’isoflurane par inhalation, puis administrer une injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (50 mg/kg) au rat anesthésié. Administrer l’isoflurane pour l’anesthésie par inhalation avant de placer les électrodes, en maintenant une concentration de ~1,2 %. Ne procédez que si Évaluez la profondeur de l’anesthésie par pincement des orteils avant de continuer.
   2. Retirez les poils de l’avant du cou et de l’arrière du dos des rats.
   3. Placez le rat en position couchée sur une couverture chauffante et appliquez une pommade sur les yeux du rat pour éviter le dessèchement. Observez le rythme respiratoire et vérifiez les réponses de retrait en appliquant une pression sur le coussinet plantaire à l’aide d’une pince.

3. Intubation trachéale

1. Placez les rats en position couchée et désinfectez la région du cou avec de la teinture d’iode.
2. Effectuez une incision longitudinale d’environ 1 cm le long de la ligne médiane du cou et disséquez brutalement le tissu musculaire.
3. Une fois la glande thyroïde exposée, séparez soigneusement la fine membrane entre les deux lobes thyroïdiens, en prenant soin de ne pas endommager le tissu thyroïdien. Procédez à l’exposition de la trachée.
4. Examinez la canule en forme de Y pour confirmer qu’elle est complètement sèche. À l’aide de ciseaux à ressort, faites une incision transversale dans la trachée, suivie de l’insertion de la canule dans l’ouverture trachéale. Fixez la canule trachéale avec des sutures non résorbables 3-0 pour éviter les fuites d’air et l’extubation accidentelle.
5. Suturez soigneusement les muscles du cou et la peau et connectez le rat à un ventilateur. Ajuster la fréquence respiratoire à 85 respirations/min et le volume courant à 3,5 mL, en fonction du poids corporel du rat⁷ (figure 1B).

4. Détection ECG

1. Insérez trois électrodes dans la peau du rat : l’électrode positive dans le membre inférieur gauche, l’électrode négative dans le membre supérieur droit et l’électrode de terre dans le membre inférieur droit¹⁰.
2. Acquisition de données à l’aide d’un électrocardiographe (réglages du filtre : passe-bas à 100 Hz, passe-haut à 1 kHz ; fréquence d’échantillonnage : 4 kHz/s). Utilisez un logiciel d’enregistrement ECG pour enregistrer, sauvegarder et analyser les données.

5. Cathétérisme péricardique pour l’administration de médicaments bradykinine (BK)

1. Placez le rat en position couchée et désinfectez la peau de la poitrine avec de l’iode.
2. Effectuez une thoracotomie entre les 1er et 3e cartilages costaux sur la partie supérieure gauche du thorax pour exposer le thymus. Disséquez brusquement le thymus le long de la ligne médiane pour exposer le péricarde (voir Figure 1C, D).
3. À l’aide de la pointe d’une aiguille de dissection en verre (0,5 mm de diamètre), faire une petite ouverture dans le péricarde.
4. Insérez un cathéter en silicone, de 10 à 15 cm de long, avec plusieurs petits trous à son extrémité distale à travers l’incision du péricarde. Fixez le cathéter au tissu de la paroi thoracique à l’aide de biocolle.
5. Fermez la cavité thoracique couche par couche, en veillant à ce que la respiration du rat ne soit pas obstruée (voir figure 1D).

6. Exposition de la moelle épinière T3

1. Placez le rat en position couchée et effectuez une désinfection de routine à l’iode. Faites une incision d’environ 8 cm le long de la ligne médiane du dos à partir des vertèbres T2 à T6.
2. Utilisez des ciseaux à ressort pour couper la peau et les couches musculaires, y compris le muscle trapèze. Insérez un écarteur entre les muscles pour exposer davantage le champ opératoire.
3. Séparez soigneusement les glandes graisseuses et les glandes d’hibernation au niveau de la face antérieure des vertèbres thoraciques du rat, en évitant les vaisseaux sanguins sous les glandes (voir la figure 1E).
4. Retirez les muscles qui s’attachent à la pince de tête et la partie droite des muscles du long cou, exposant les apophyses épineuses de T2.
5. Déplacer les muscles semi-épineux et rachidien pour exposer l’arc vertébral de T2 à T6 (voir Figure 1E). Utilisez des rongeurs pour enlever l’apophyse épineuse de la vertèbre T3, exposant ainsi la moelle épinière T3.
   REMARQUE : Pendant le processus d’exposition des vertèbres thoraciques, assurez-vous qu’une attention particulière est accordée à la préservation de l’apophyse épineuse de T2, car elle sert de point d’application de force principal pour l’exposition ultérieure de la moelle épinière T3.
6. Retirez la dure-mère et la membrane arachnoïdienne, et versez de l’huile de paraffine sur la surface de la moelle épinière pour maintenir la viabilité des neurones de la moelle épinière (voir Figure 1F).
   REMARQUE : Les vaisseaux sanguins du tissu adipeux brun du rat proviennent de la lame T3, T4 ou T5 et sont distribués comme un sinus veineux. Veillez à ne pas les toucher, car cela pourrait provoquer une perte de sang excessive chez le rat.

7. Fixation et réglages des vertèbres thoraciques

1. Utilisez une pince vertébrale personnalisée pour sécuriser les processus articulaires de T2 et T6. Humidifiez les muscles environnants avec une solution saline pour maintenir l’hydratation.
2. Fixez le réseau d’électrodes au micromanipulateur d’un instrument stéréotaxique et insérez-le verticalement dans la corne dorsale de la moelle épinière au niveau du segment rachidien T3 à travers le sillon médian dorsal, à 500 μm latéralement à la ligne médiane, jusqu’à une profondeur de 1 500 μm.
3. Insérez l’électrode de référence dans le muscle du dos (voir Figure 1G).
4. Lancez le logiciel d’enregistrement extracellulaire multicanal et accédez à Fichier | Configuration matérielle ; sélectionner le réseau de 32 canaux dans la liste Interface de l’appareil ; clic droit sur le groupe de canaux sélectionné ; , puis choisissez Propriétés dans le menu contextuel . Configurer les paramètres de traitement du signal : Sous l’onglet Filtre , réglez le filtre passe-bande (BP) sur 250 Hz - 5 kHz ; dans le champ Taux d’échantillonnage , entrez 30 kHz/s ; activez les algorithmes de détection des pics en cochant la case Activer le traitement des pics pour activer le tri des pics en temps réel et l’extraction d’événements basée sur des seuils.
   REMARQUE : Assurez-vous d’un dégagement complet des muscles et des tissus entourant les apophyses articulaires de T2 et T6, en particulier dans la région où la pince vertébrale personnalisée est appliquée pour la fixation de la colonne vertébrale, afin d’éviter le déplacement lors des expériences ultérieures.

8. Stimuli somatiques et BK

1. Utilisez du BK (1 μg/mL dans de l’eau distillée) pour induire une stimulation nociceptive cardiaque. Injecter 4 μL de la solution BK à l’aide d’une micro-seringue reliée à un cathéter en silicone à plusieurs petites ouvertures¹¹.
2. Observer les changements de fréquence cardiaque (augmentation ou diminution) et la décharge neuronale (augmentation ou diminution) de la corne dorsale de la moelle épinière T3 dans les 30 minutes suivant l’injection afin d’identifier les interactions dynamiques entre les neurones de la corne dorsale de la moelle épinière thoracique.
3. Effectuez l’acupuncture manuelle au point d’acupuncture PC6 (MAPC6) en utilisant le paramètre de stimulation de 1 Hz. PC6 (point d’acupuncture Neiguan) est situé à 2 mm de l’articulation carpien sur l’avant-bras ventral, entre le fléchisseur radial du carpe et le tronc du nerf médian. Insérez les aiguilles (0,25 mm x 25 mm) dans les points d’acupuncture PC6 à une profondeur de ~3 mm. Comparez les changements dans l’activité neuronale et la fonction cardiaque avant et après les stimuli somatiques.

9. Analyse et traitement des données

1. Importez les données neuronales enregistrées au format ns6 dans le logiciel comme suit :
   1. Conversion de fichier : accédez à Fichier | Ouvrez-le pour charger le fichier ns6. Sélectionnez Fichier | Enregistrer sous et choisissez le format .nex5 pour générer des données de train de pointes standardisées.
   2. Tri des pointes : Importez les fichiers .nex5 convertis dans le logiciel de classification pour la classification neuronale. Triez les formes d’onde de pointe en fonction de leurs caractéristiques et de l’analyse en composantes principales (ACP), avec des paramètres de seuil définis à ±3 écart-type par rapport au bruit de base.
   3. Ensuite, exécutez le code approprié pour filtrer et catégoriser les signaux.
2. Analysez les SDRN verrouillés cardiaquement.
   1. En prenant l’onde R comme événement de référence, comptez le nombre de décharges de neurones dans une fenêtre de 0,2 s avant et après chaque onde R.
   2. Après avoir compté les ondes R à des intervalles de 50 ms, créez un histogramme d’événements annulaires. Normalisez l’histogramme (c’est-à-dire soustrayez le taux de décharge moyen en 0,2 s avant et après l’événement de l’onde R) pour obtenir la distribution du taux de décharge de l’activité de chaque neurone pendant le battement cardiaque.
   3. Évaluez la signification statistique à l’aide des tests de permutation Monte Carlo¹² , mis en œuvre avec 1 000 itérations mélangées. Obtenez la distribution de la vitesse de décharge et l’intervalle de confiance du neurone dans le processus de battement de cœur aléatoire en randomisant 0,2 s du temps avant et après chaque onde R de battement de cœur (la plage est de ± 0,1 s). Si la distribution de décharge du rythme cardiaque d’un neurone dépasse (supérieure ou inférieure à) l’intervalle de confiance à 95 % de la distribution du taux de décharge du processus de battement cardiaque aléatoire, identifiez le neurone comme un neurone verrouillé cardiaquement (voir le fichier supplémentaire 1).

Résultats

Conformément au protocole ci-dessus, les SDHN T3 ont été exposés, avec de la bradykinine (BK) ou des aiguilles somatiques administrées dans des régions péricardiales/points d’acupuncture. Cette étude a quantifié les profils d’activation neuronale évoqués par stimulus (type/fréquence) et les changements électrocardiographiques (ECG) simultanés lors de l’entrée viscérale nociceptive, de l’application de BK et de la modulation somatosensorielle.

Discussion

Le décodage des profils de codage neuronal SDH est essentiel pour comprendre le mécanisme neuromodulateur de l’effet thérapeutique induit par l’acupuncture sur le dysfonctionnement viscéral. Ici, nous avons combiné la technique d’enregistrement in vivo MEA avec le système d’enregistrement ECG pour enregistrer simultanément l’activité de décharge des SDHN T3 et de l’ECG. La stimulation de la douleur cardiaque peut activer des nocicepteurs de type C qui innerv...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia System	Kent Scientific	SomnoSuite
Central v6.5	Black Microsystems	Cerebus-128
Fine Scissors	Fine Scissors	Fine Scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science T ools	16220-14
Gelatin Sponges	Coltene	274-007
Intubation Cannula	Harward Apparatus	73-2737
Isoflurane	RWD	R510
LabChart Professional Software	LabChart Professional Software	Version 8.0
microband electrode array	Neuronexus	A1x32-6mm-50-177
micromanipulator	Narishige	DMA-1510
needles	Zhongyantaihe	0.25 mm x 0.25 mm
NeuroExplorer software (V5.0)	Plexon	V5.0
offline Sorter	Plexon	V4.0
Powerlab	ADInstruments	PL26T04
rats	the Experimental Center of the Academy of Military Medical Sciences of the People's Liberation Army of China
Spinal Adaptor	N/A	N/A	Custom made
Spring Scissors	Fine Science Tools	15023-10
stereotactic instrument	Narishige	SR-5R-HT