חקר פרופילי הקידוד של גירוי סומטי על תגובות עצביות נעולות לבביות בקרן הגב של עמוד השדרה של החולדה

Summary

אנו מתארים פרוטוקול להקלטה חוץ-תאית רב-ערוצית בעמוד השדרה לצד הקלטה וניתוח של נוירונים של קרן גב עמוד השדרה הנעולים על הלב. שיטה זו מציעה מסגרת מסונכרנת זמנית לחקר מנגנוני עמוד השדרה העומדים בבסיס שינויים תפקודיים קרביים של בית החזה הנגרמים על ידי דיקור סיני.

Abstract

מחקרים רבים הציעו כי דיקור חשמלי עשוי להועיל בטיפול ובמניעה של מחלות לב וכלי דם. עם זאת, המנגנון שלו נותר לא מובן היטב. קרן הגב של עמוד השדרה החזי (SDH) ממלאת תפקיד חשוב בשילוב ובוויסות תשומות סומטיות וקרביות, שעשויות להשפיע על השליטה הלבבית. בניגוד ל-SDH המותני, שנחקר בהרחבה, SDH של בית החזה נחקר פחות בשל הקושי בחשיפה כירורגית וקיבוע סטריאוטקסי. במחקר זה, אנו מספקים גישה כללית לניטור בו זמנית של פעילות עצבית ותפקוד לב על ידי שילוב של רישום של אלקטרוקרדיוגרמות ומערכי מיקרואלקטרודות. יתר על כן, אנו מתארים כיצד לזהות נוירונים נעולים לבביים על ידי חישוב התפלגות קצב הירי של פעילות עצבית בסנכרון עם פעימות הלב. לאסטרטגיה חשיבות רבה לחקר המתאם בין תפקוד הלב וכלי הדם לפעילות עצבית וכן להבנת הרפלקס הסומטו-קרדיולוגי המופעל על ידי גירויים עצביים היקפיים.

Introduction

דיקור סיני או גירוי פני הגוף, כטכניקה טיפולית בולטת במסגרת הרפואה הסינית המסורתית (TCM), פועל על ידי גירוי אזורים ספציפיים על פני הגוף. הוא מקל על ויסות רב-שכבתי של תפקודי האורגניזם באמצעות ויסות תפקודי הקרביים באמצעות מסלולים אפרנטיים, אינטגרציה מרכזית ומנגנוני עצבים אוטונומיים. במרכז טיפול זה עומדת התפיסה שגירוי ממוקד של נקודות דיקור המוגדרות אנטומית גורם לוויסות פיזיולוגי מערכתי. עדויות קליניות הולכות וגדלות תומכות בתפקידו של הדיקור כשיטה משלימה בניהול הפרעות לב וכלי דם, עם יעילות מוכחת הן במניעה ראשונית והן בפרוטוקולי טיפול משלים ^1,2.

מוליכים ראשוניים של נוירונים חושיים מסתיימים בעיקר בקרן הגב של עמוד השדרה (SDH), בהתאמה, נוירוני קרן הגב של עמוד השדרה (SDHNs) ממלאים תפקיד מכריע באינטגרציה ואפנון של תשומות סומטיות ^3,4,5. יתר על כן, ה-SDHRNs מקבלים גם מוליכים לבביים ומעבירים מידע קרביים לנוירונים פרגנגליונים סימפתטיים בעמוד השדרה (SPNs) לצורך אפנון לב וכלי דם⁶. ה-SPNs הנעולים על הלב ממוקמים בפינה הצדדית של מקטע בית החזה של חוט השדרה (T1-T5), כאשר האקסונים מקרינים לגרעיני צוואר הרחם או בית החזה ובהמשך מעצבבים את הלב דרך העצבים הלבביים, האמצעיים והתחתונים. כתוצאה מכך, חוט השדרה החזי ממלא תפקיד מכריע באינטגרציה ובאפנון של תשומות סומטיות וקרביות, אשר עשויות להשפיע על השליטה הלבבית. לכן חשוב להבין כיצד גירוי סומטי מווסת את תפקוד הלב באמצעות אפנון של SDHRNs בקטע בית החזה של חוט השדרה.

מחקרים קודמים הראו כי דיקור חשמלי ב-PC6 (המאורגן במקטע עמוד השדרה T3 כיחידת מבנה-תפקוד הומוטופית) יכול להקל על תסמינים של איסכמיה של שריר הלב באמצעות אפנון של מערכת העצבים האוטונומית ^7,8,9. עם זאת, סנכרון כמותי בזמן אמת של השפעות הדיקור על קצב הלב עם פעילות מערכת העצבים עדיין לא מומש. תועדו רק פעילות עצבית אוטונומית מיידית ואינדיקטורים של אלקטרוקרדיוגרמה (ECG) לאחר דיקור סיני. המחקר הקושר בין SDHNs לתפקודים פיזיולוגיים קרביים נותר נדיר. בשל העקמומיות הפיזיולוגית של חוליות בית החזה והמרווח הצר בין מקטעי חוליות בית החזה הסמוכים, במיוחד T1-T5, הגישה לאזורים אלה מאתגרת, וכתוצאה מכך עדויות ישירות מועטות להבהרת מנגנוני עמוד השדרה העומדים בבסיס דיקור סיני בנקודת הדיקור ההומוטופית של עמוד השדרה T3 PC6 המווסתת את תפקוד הלב בטיפול במחלות לב וכלי דם.

כדי להבין טוב יותר את הקשר בין SDH לוויסות תפקוד הלב בתיווך דיקור, יש ליישם רישום סינכרוני של תפקוד הלב ופעילויות עצביות. כאן, נספק גישה כללית להקלטה חוץ-תאית רב-ערוצית בעמוד השדרה לצד רישום תפקודי לב וכן ניתוח ה-SDHRNs הנעולים על הלב. שיטה זו מציעה מסגרת מסונכרנת זמנית לחקר מנגנוני עמוד השדרה העומדים בבסיס שינויים תפקודיים קרביים של בית החזה הנגרמים על ידי דיקור סיני.

Protocol

פרוטוקול הניסויים בבעלי חיים עמד בקפדנות בדרישות התקן הלאומי "קווים מנחים לבחינה אתית של רווחת חיות מעבדה" (GB/T 35892-2018) ואושר על ידי ועדת האתיקה של המוסד. במחקר זה נעשה שימוש בחולדות Sprague-Dawley (SD) זכרים בדרגת SPF, בגילאי 6-8 שבועות ובמשקל של כ-220 גרם. חלוקי מעבדה, כפפות ומסכות נלבשו במהלך כל הניסויים. פרטי הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים. בסיום הניסוי, חולדות הומתו באמצעות זלוף לב בהרדמה עמוקה ואחריה נקע צוואר הרחם.

1. הגדרה טרום ניתוחית

1. חבר את מעגל ההנשמה לצינור האנדוטרכיאלי בצורת Y, והבטיח ממשק מאובטח ואטום.
2. ודא אוורור תקין על ידי אישור זרימת אוויר יציבה, נפח גאות מתאים והגדרות קצב נשימה בתצוגת מכונת ההנשמה.
3. ודא היעדר מזהמים מעובים או חלקיקים בתוך הצינור על ידי בחינה ויזואלית של כל הקטעים בתאורה בהירה.
4. הזינו בו-זמנית את אותות ה-ECG המוגברים הן לכניסת האלקטרוקרדיוגרף והן ליציאת הקלט האנלוגי של מערכת ההקלטה של מערך המיקרו-אלקטרודות באמצעות מחבר BNC תלת-כיווני.
5. נתב את האותות המוגברים דרך מפצל BNC תלת-כיווני כדי לחבר בו-זמנית את יציאת הקלט האנלוגי של הקלט האנלוגי של מערכת ההקלטה של מערך המיקרו-אלקטרודות.
6. קבע טריגרים לסנכרון על ידי חיבור פלט ה-TTL של האלקטרוקרדיוגרף לקלט הדיגיטלי של מערכת ההקלטה של מערך המיקרו-אלקטרודות. באמצעות כבל ממשק BNC-to-Dupont, התחל רכישה בו-זמנית בשתי המערכות, תוך אימות יישור זמני.

2. הכנה טרום ניתוחית

1. הרדמה
   1. יש לעורר הרדמה עם איזופלורן 3-5% בשאיפה ולאחר מכן לתת זריקה תוך-צפקית של נתרן פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג) לחולדה המורדמת. יש לתת איזופלורן להרדמה באינהלציה לפני הנחת האלקטרודות, תוך שמירה על ריכוז של ~1.2%. המשך רק אם העריך את עומק ההרדמה באמצעות צביטת הבוהן לפני שתמשיך.
   2. הסר את השיער מהצוואר הקדמי ומהגב האחורי של החולדות.
   3. הניחו את החולדה במצב שכיבה על שמיכה מחממת ומרחו משחה על עיני החולדה כדי למנוע התייבשות. שימו לב לקצב הנשימה ובדקו אם יש תגובות נסיגה על ידי הפעלת לחץ על כרית כף הרגל בעזרת מלקחיים.

3. אינטובציה של קנה הנשימה

1. הניחו את החולדות במצב שכיבה וחטאו את אזור הצוואר בתמיסת יוד.
2. בצע חתך אורכי של כ -1 ס"מ לאורך קו האמצע של הצוואר ונתח בצורה בוטה את רקמת השריר.
3. לאחר חשיפת בלוטת התריס, יש להפריד בזהירות את הקרום הדק בין שתי אונות בלוטת התריס, תוך הקפדה לא לפגוע ברקמת בלוטת התריס. המשך לחשוף את קנה הנשימה.
4. בדוק את "הצינורית בצורת Y כדי לאשר שהיא יבשה לחלוטין. השתמש במספריים קפיציים כדי לבצע חתך רוחבי בקנה הנשימה, ואחריו החדרת הצינורית לפתח קנה הנשימה. אבטח את צינורית קנה הנשימה עם 3-0 תפרים שאינם נספגים כדי למנוע דליפת אוויר והוצאת צינורות בשוגג.
5. תפר בזהירות את שרירי הצוואר והעור וחבר את החולדה למכונת הנשמה. התאימו את קצב הנשימה ל-85 נשימות לדקה ואת נפח הגאות ל-3.5 מ"ל, בהתאם למשקל הגוף של החולדה⁷ (איור 1B).

4. זיהוי א.ק.ג

1. הכנס שלוש אלקטרודות לעור החולדה: האלקטרודה החיובית לגפה התחתונה השמאלית, האלקטרודה השלילית לגפה העליונה הימנית והאלקטרודה הקרקעית לגפה התחתונה הימנית¹⁰.
2. רכוש נתונים באמצעות אלקטרוקרדיוגרף (הגדרות מסנן: מעבר נמוך ב-100 הרץ, מעבר גבוה ב-1 קילו-הרץ; תדר דגימה: 4 קילו-הרץ/שנייה). השתמש בתוכנת הקלטת אק"ג כדי להקליט, לשמור ולנתח נתונים.

5. צנתור קרום הלב למתן תרופות ברדיקינין (BK)

1. הניחו את החולדה במצב שכיבה וחטאו את העור על החזה ביוד.
2. בצע כריתת בית חזה בין הסחוס הראשון והשלישי בחזה העליון השמאלי כדי לחשוף את התימוס. נתחו בצורה בוטה את בלוטת התימוס לאורך קו האמצע כדי לחשוף את קרום הלב (ראו איור 1C,D).
3. השתמש בקצה מחט חיתוך זכוכית (בקוטר 0.5 מ"מ) כדי ליצור פתח קטן בקרום הלב.
4. הכנס קטטר סיליקון באורך 10-15 ס"מ, עם מספר חורים קטנים בקצהו הדיסטלי דרך החתך בקרום הלב. אבטח את הקטטר לרקמת דופן בית החזה באמצעות דבק ביולוגי.
5. סגרו את חלל החזה שכבה אחר שכבה, וודאו שהנשימה של החולדה תישאר ללא הפרעה (ראו איור 1D).

6. חשיפת חוט השדרה T3

1. הניחו את החולדה במצב נוטה ובצעו חיטוי שגרתי עם יוד. בצע חתך של כ -8 ס"מ לאורך קו האמצע של הגב מחוליות T2 עד T6.
2. השתמש במספריים קפיציים כדי לחתוך את שכבות העור והשרירים, כולל שריר הטרפז. הכנס מפסק בין השרירים כדי לחשוף עוד יותר את שדה הניתוח.
3. הפרידו בזהירות את בלוטות השומן ובלוטות השינה בהיבט הקדמי של חוליות בית החזה של החולדה, והימנעו מכלי הדם שמתחת לבלוטות (ראו איור 1E).
4. הסר את השרירים המחוברים למהדק הראש ואת החלק הישר של שרירי הצוואר הארוך, וחשוף את התהליכים הקוצניים של T2.
5. עקור את שרירי הסמי-ספינאליס והספינאליס כדי לחשוף את קשת החוליות מ-T2 ל-T6 (ראה איור 1E). השתמש ב-rongeurs כדי להסיר את התהליך הקוצני של חוליית T3, ובכך לחשוף את חוט השדרה T3.
   הערה: במהלך תהליך חשיפת חוליות בית החזה, יש לוודא שניתנת תשומת לב מיוחדת לשימור התהליך הקוצני של T2, מכיוון שהוא משמש כנקודת הפעלת הכוח העיקרית לחשיפה לאחר מכן של חוט השדרה T3.
6. הסירו את הדורה מאטר ואת הממברנה הארכנואידית, וטפטפו שמן פרפין על פני חוט השדרה כדי לשמור על הכדאיות של תאי העצב בעמוד השדרה (ראו איור 1F).
   הערה: כלי הדם של רקמת השומן החומה של החולדה מקורם בלמינה T3, T4 או T5 ומופצים כמו סינוס ורידי. הקפד לא לגעת בהם, מכיוון שהדבר עלול לגרום לאובדן דם מוגזם בחולדה.

7. קיבוע והגדרות של חוליות בית החזה

1. השתמש במהדק עמוד שדרה מותאם אישית כדי לאבטח את התהליכים המפרקיים של T2 ו-T6. יש להרטיב את השרירים שמסביב במי מלח כדי לשמור על לחות.
2. חבר את מערך האלקטרודות למיקרומניפולטור של מכשיר סטריאוטקטי והכנס אותו אנכית לקרן הגב של חוט השדרה בקטע עמוד השדרה T3 דרך החריץ החציוני הגבי, 500 מיקרומטר לרוחב לקו האמצע, לעומק של 1,500 מיקרומטר.
3. הכנס את אלקטרודת הייחוס לשריר הגב (ראה איור 1G).
4. הפעל את תוכנת ההקלטה החוץ-סלולרית הרב-ערוצית ונווט אל קובץ | תצורת חומרה; בחר את מערך 32 הערוצים מרשימת ממשק המכשירים; לחץ לחיצה ימנית על קבוצת הערוצים שנבחרה; ולאחר מכן, בחר Properties מהתפריט תלוי-ההקשר. הגדר פרמטרים של עיבוד אותות: תחת הכרטיסייה מסנן, הגדר את מסנן הפס (BP) ל-250 הרץ - 5 קילו-הרץ; בשדה קצב דגימה, הזן 30 קילו-הרץ לשנייה; אפשר אלגוריתמים לזיהוי ספייק על ידי סימון התיבה שכותרתה אפשר עיבוד ספייק כדי להפעיל מיון ספייק בזמן אמת וחילוץ אירועים מבוסס סף.
   הערה: הקפידו על פינוי יסודי של השרירים והרקמות המקיפים את התהליכים המפרקיים של T2 ו-T6, במיוחד באזור שבו מוחל מהדק עמוד השדרה המותאם אישית לקיבוע עמוד השדרה, כדי למנוע תזוזה במהלך הניסויים הבאים.

8. גירויים סומטיים ו- BK

1. השתמש ב-BK (1 מיקרוגרם/מ"ל במים מזוקקים) כדי לגרום לגירוי נוסיספטיבי לבבי. הזרקו 4 מיקרוליטר מתמיסת BK עם מזרק מיקרו המחובר לצנתר סיליקון עם מספר פתחים קטנים¹¹.
2. התבונן בשינויים בקצב הלב (עולה או יורד) והפרשה עצבית (עולה או יורדת) בקרן הגב של חוט השדרה T3 תוך 30 דקות מההזרקה כדי לזהות אינטראקציות דינמיות בין נוירונים של קרן גבית של חוט השדרה החזי.
3. בצע דיקור ידני בנקודת הדיקור PC6 (MAPC6) באמצעות פרמטר הגירוי של 1 הרץ. PC6 (נקודת דיקור נייגואן) ממוקם 2 מ"מ פרוקסימלי למפרק הקרפלי על האמה הגחונית, בין המכופף קרפי רדיאליס לגזע העצב המדיאני. הכנס את המחטים (0.25 מ"מ x 25 מ"מ) לנקודות הדיקור PC6 בעומק של ~3 מ"מ. השווה את השינויים בפעילות העצבית ובתפקוד הלב לפני ואחרי הגירויים הסומטיים.

9. ניתוח ועיבוד נתונים

1. ייבא את הנתונים העצביים המוקלטים בפורמט ns6 לתוכנה באופן הבא:
   1. המרת קבצים: נווט אל קובץ | פתח כדי לטעון את קובץ ns6. בחר קובץ | שמירה בשם ובחר בפורמט .nex5 כדי ליצור נתוני רכבת ספייק סטנדרטיים.
   2. מיון ספייק: ייבא את קבצי ה-.nex5 שהומרו לתוכנת הסיווג לסיווג עצבי. מיין צורות גל ספייק על סמך מאפייני צורת גל וניתוח רכיבים עיקריים (PCA), עם פרמטרי סף המוגדרים ל-±3 SD מרעש הבסיס.
   3. לאחר מכן, בצע את הקוד הרלוונטי לסינון וסיווג האותות.
2. נתח SDRNs נעולים לבביים.
   1. אם ניקח את גל ה-R כאירוע הייחוס, ספרו את מספר ירי הנוירונים בחלון של 0.2 שניות לפני ואחרי כל גל R.
   2. לאחר ספירת גלי ה-R במרווחים של 50 אלפיות השנייה, צור היסטוגרמה של אירוע טבעתי. לנרמל את ההיסטוגרמה (כלומר, להפחית את קצב הפריקה הממוצע ב-0.2 שניות לפני ואחרי אירוע גל ה-R) כדי לקבל את התפלגות קצב הפריקה של פעילות כל נוירון במהלך פעימות הלב.
   3. הערכת מובהקות סטטיסטית באמצעות בדיקת תמורות מונטה קרלו¹² , המיושמת עם 1,000 איטרציות מעורבבות. השג את התפלגות קצב הירי ומרווח הסמך של הנוירון בתהליך פעימות הלב האקראיות על ידי חלוקה אקראית של 0.2 שניות מהזמן לפני ואחרי כל גל R של פעימות לב (הטווח הוא ± 0.1 שניות). אם התפלגות הירי של פעימות הלב של תא העצב עולה (יותר או פחות מ) מרווח בר-סמך של 95% של התפלגות קצב הירי של תהליך פעימות הלב האקראי, זהה את הנוירון כנוירון נעול לב (ראה קובץ משלים 1).

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול הנ"ל, נחשפו ה-T3 SDHNs, עם ברדיקינין (BK) או דיקור סומטי שניתן לאזורי קרום הלב/דיקור. מחקר זה כימת פרופילי הפעלה עצבית מעוררים גירוי (סוג/תדירות) ושינויים אלקטרוקרדיוגרפיים (ECG) במקביל במהלך קלט קרביים נוסיספטיבי, יישום BK ואפנון סומטוסנסורי.

Discussion

פענוח פרופילי קידוד עצבי SDH חיוני להבנת המנגנון הנוירומודולטורי של ההשפעה הטיפולית הנגרמת על ידי דיקור סיני על תפקוד לקוי של הקרביים. כאן, שילבנו את טכניקת ההקלטה של MEA in vivo עם מערכת הקלטת האק"ג כדי להקליט בו זמנית את פעילות הפריקה של ה-T3 SDHNs וה-ECG. גירוי כאב לב יכול להפ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia System	Kent Scientific	SomnoSuite
Central v6.5	Black Microsystems	Cerebus-128
Fine Scissors	Fine Scissors	Fine Scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science T ools	16220-14
Gelatin Sponges	Coltene	274-007
Intubation Cannula	Harward Apparatus	73-2737
Isoflurane	RWD	R510
LabChart Professional Software	LabChart Professional Software	Version 8.0
microband electrode array	Neuronexus	A1x32-6mm-50-177
micromanipulator	Narishige	DMA-1510
needles	Zhongyantaihe	0.25 mm x 0.25 mm
NeuroExplorer software (V5.0)	Plexon	V5.0
offline Sorter	Plexon	V4.0
Powerlab	ADInstruments	PL26T04
rats	the Experimental Center of the Academy of Military Medical Sciences of the People's Liberation Army of China
Spinal Adaptor	N/A	N/A	Custom made
Spring Scissors	Fine Science Tools	15023-10
stereotactic instrument	Narishige	SR-5R-HT