Estudio de los perfiles codificantes de la estimulación somática en las respuestas neuronales bloqueadas por el corazón en el asta dorsal espinal de la rata

Resumen

Describimos un protocolo para el registro extracelular multicanal espinal junto con el registro de la función cardíaca y el análisis de las neuronas del asta dorsal espinal bloqueadas por el corazón. Este método ofrece un marco sincronizado temporalmente para estudiar los mecanismos de la columna vertebral que subyacen a los cambios funcionales viscerales torácicos inducidos por la acupuntura.

Resumen

Muchos estudios han sugerido que la electroacupuntura puede ser beneficiosa en el tratamiento y la prevención de las enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, su mecanismo sigue siendo poco conocido. El asta dorsal espinal torácica (SDH) desempeña un papel importante en la integración y modulación de las entradas somáticas y viscerales, que luego pueden influir en el control cardíaco. A diferencia de la SDH lumbar, que ha sido ampliamente estudiada, la SDH torácica ha sido menos explorada debido a la dificultad en la exposición quirúrgica y la fijación estereotáxica. En este estudio, proporcionamos un enfoque general para monitorear simultáneamente la actividad neuronal y la función cardíaca mediante la combinación del registro de electrocardiogramas y matrices de microelectrodos. Además, describimos cómo identificar las neuronas bloqueadas por el corazón mediante el cálculo de la distribución de la tasa de disparo de la actividad neuronal en sincronía con los latidos del corazón. La estrategia es de gran importancia para estudiar la correlación entre la función cardiovascular y la actividad neuronal, así como para comprender el reflejo somatocardíaco desencadenado por las estimulaciones de los nervios periféricos.

Introducción

La acupuntura o estimulación de la superficie corporal, como técnica terapéutica destacada dentro del marco de la Medicina Tradicional China (MTC), opera estimulando áreas específicas de la superficie corporal. Facilita la regulación multinivel de las funciones del organismo a través de la regulación de las funciones viscerales a través de las vías aferentes, la integración central y los mecanismos nerviosos eferentes autónomos. Un elemento central de esta terapia es el concepto de que la estimulación dirigida de puntos de acupuntura definidos anatómicamente induce una regulación fisiológica sistémica. Cada vez hay más evidencia clínica que apoya el papel de la acupuntura como modalidad complementaria en el manejo de los trastornos cardiovasculares, con eficacia demostrada tanto en la prevención primaria como en los protocolos de tratamiento adyuvante ^1,2.

Las aferencias primarias de las neuronas sensoriales terminan predominantemente en el asta dorsal espinal (SDH), en consecuencia, las neuronas del asta dorsal espinal (SDHN) juegan un papel crucial en la integración y modulación de las entradas somáticas ^3,4,5. Además, las SDHRN también reciben aferencias cardíacas y transmiten información visceral a las neuronas preganglionares simpáticas espinales (SPN) para la modulación cardiovascular⁶. Las SPN con bloqueo cardíaco se encuentran en la esquina lateral del segmento torácico de la médula espinal (T1-T5), con axones que se proyectan hacia los ganglios cervicales o torácicos y posteriormente inervan el corazón a través de los nervios cardíacos, medios e inferiores. Como resultado, la médula espinal torácica desempeña un papel crucial en la integración y modulación de las entradas somáticas y viscerales, que luego pueden influir en el control cardíaco. Por lo tanto, es importante comprender cómo la estimulación somática regula la función cardíaca a través de la modulación de las SDHRN en el segmento torácico de la médula espinal.

Estudios previos han demostrado que la electroacupuntura en el CP6 (organizada en el segmento espinal T3 como una unidad homotópica de estructura-función) puede aliviar los síntomas de la isquemia miocárdica a través de la modulación del sistema nervioso autónomo ^7,8,9. Sin embargo, aún no se ha logrado la sincronización cuantitativa en tiempo real de los efectos de la acupuntura sobre la frecuencia cardíaca con la actividad del sistema nervioso. Solo se han documentado indicadores de actividad nerviosa autonómica inmediata y electrocardiograma (ECG) después de la acupuntura. Las investigaciones que relacionan las SDHN con las funciones fisiológicas viscerales siguen siendo escasas. Debido a la curvatura fisiológica de las vértebras torácicas y al estrecho espacio entre los segmentos vertebrales torácicos adyacentes, especialmente T1-T5, el acceso a estas áreas es un desafío, lo que resulta en escasas pruebas directas para dilucidar los mecanismos espinales subyacentes a la acupuntura en el punto de acupuntura homotópico espinal T3 PC6 que regula la función cardíaca en el tratamiento de la ECV.

Para comprender mejor la relación entre la SDH y la regulación de la función cardíaca mediada por la acupuntura, es necesario implementar el registro sincrónico de la función cardíaca y las actividades neuronales. Aquí, proporcionaremos un enfoque general para el registro extracelular multicanal espinal junto con el registro de la función cardíaca, así como el análisis de las SDHRN bloqueadas por el corazón. Este método ofrece un marco sincronizado temporalmente para estudiar los mecanismos de la columna vertebral que subyacen a los cambios funcionales viscerales torácicos inducidos por la acupuntura.

Protocolo

El protocolo de experimentación con animales se adhirió estrictamente a los requisitos de la norma nacional "Directrices para la Revisión Ética del Bienestar de los Animales de Laboratorio" (GB/T 35892-2018) y fue aprobado por el Comité de Ética de la institución. En este estudio se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley (SD) de grado SPF, de 6 a 8 semanas de edad y con un peso aproximado de 220 g. Se usaron batas de laboratorio, guantes y máscaras durante todos los experimentos. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales. Al final del experimento, las ratas fueron sacrificadas mediante perfusión cardíaca bajo anestesia profunda seguida de dislocación cervical.

1. Configuración preoperatoria

1. Conecte el circuito del ventilador al tubo endotraqueal en forma de Y, lo que garantiza una interfaz segura y hermética.
2. Verifique la ventilación adecuada confirmando el flujo de aire estable, el volumen corriente adecuado y los ajustes de frecuencia respiratoria en la pantalla del ventilador.
3. Asegúrese de que no haya contaminantes de condensado o partículas dentro de la tubería examinando visualmente todos los segmentos bajo una iluminación brillante.
4. Alimente simultáneamente las señales de ECG amplificadas tanto en la entrada del electrocardiógrafo como en el puerto de entrada analógica del sistema de registro de matriz de microelectrodos mediante un conector BNC de tres vías.
5. Dirija las señales amplificadas a través de un divisor BNC de tres vías para conectar simultáneamente la entrada analógica del electrocardiógrafo y el puerto de entrada analógica del sistema de registro de matriz de microelectrodos.
6. Establezca disparadores de sincronización conectando la salida TTL del electrocardiógrafo a la entrada digital del sistema de registro de la matriz de microelectrodos. Utilizando un cable de interfaz BNC a Dupont, inicie la adquisición simultánea en ambos sistemas, verificando la alineación temporal.

2. Preparación preoperatoria

1. Anestesia
   1. Inducir la anestesia con isoflurano al 3-5% por inhalación y luego administrar una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg) a la rata anestesiada. Administrar isoflurano para anestesia inhalatoria antes de colocar los electrodos, manteniendo una concentración de ~1,2%. Proceda solo si: Evalúe la profundidad de la anestesia mediante un pellizco en los dedos de los pies antes de continuar.
   2. Retira el pelo de la parte anterior del cuello y la parte posterior del dorso de las ratas.
   3. Coloque a la rata en posición supina sobre una manta térmica y aplique ungüento en los ojos de la rata para evitar que se seque. Observe la frecuencia respiratoria y verifique las respuestas de retirada aplicando presión a la almohadilla del pie con pinzas.

3. Intubación traqueal

1. Coloque las ratas en posición supina y desinfecte el área del cuello con tintura de yodo.
2. Realizar una incisión longitudinal de aproximadamente 1 cm a lo largo de la línea media del cuello y diseccionar sin rodeos el tejido muscular.
3. Una vez que la glándula tiroides esté expuesta, separe cuidadosamente la membrana delgada entre los dos lóbulos tiroideos, teniendo cuidado de no dañar el tejido tiroideo. Proceda a exponer la tráquea.
4. Examine la cánula en forma de "Y" para confirmar que está completamente seca. Utilice unas tijeras de resorte para hacer una incisión transversal en la tráquea, seguida de la inserción de la cánula en la abertura traqueal. Asegure la cánula traqueal con suturas no absorbibles 3-0 para evitar fugas de aire y extubaciones accidentales.
5. Sutura cuidadosamente los músculos del cuello y la piel y conecta la rata a un ventilador. Ajustar la frecuencia respiratoria a 85 respiraciones/min y el volumen corriente a 3,5 mL, de acuerdo con el peso corporal de la rata⁷ (Figura 1B).

4. Detección de ECG

1. Inserte tres electrodos en la piel de la rata: el electrodo positivo en la extremidad inferior izquierda, el electrodo negativo en la extremidad superior derecha y el electrodo de tierra en la extremidad inferior derecha¹⁰.
2. Adquisición de datos mediante un electrocardiógrafo (ajustes de filtro: paso bajo a 100 Hz, paso alto a 1 kHz; frecuencia de muestreo: 4 kHz/s). Utilice el software de registro de ECG para registrar, guardar y analizar datos.

5. Cateterismo pericárdico para la administración de fármacos bradicinina (BK)

1. Coloque la rata en posición supina y desinfecte la piel del pecho con yodo.
2. Realizar una toracotomía entre el 1º y 3º cartílago costal en la parte superior izquierda del tórax para exponer el timo. Diseccione sin rodeos el timo a lo largo de la línea media para exponer el pericardio (ver Figura 1C, D).
3. Utilice la punta de una aguja de disección de vidrio (0,5 mm de diámetro) para hacer una pequeña abertura en el pericardio.
4. Insertar un catéter de silicona, de 10-15 cm de longitud, con varios orificios pequeños en su extremo distal a través de la incisión en el pericardio. Fije el catéter al tejido de la pared torácica con biopegamento.
5. Cierre la cavidad torácica capa por capa, asegurándose de que la respiración de la rata permanezca sin obstrucciones (véase la figura 1D).

6. Exposición de la médula espinal T3

1. Coloque a la rata en posición prona y realice una desinfección rutinaria con yodo. Realice una incisión de aproximadamente 8 cm a lo largo de la línea media de la espalda desde las vértebras T2 a T6.
2. Use tijeras de resorte para cortar la piel y las capas musculares, incluido el músculo trapecio. Inserte un retractor entre los músculos para exponer aún más el campo quirúrgico.
3. Separe cuidadosamente las glándulas de grasa e hibernación en la cara anterior de las vértebras torácicas de la rata, evitando los vasos sanguíneos debajo de las glándulas (ver Figura 1E).
4. Retire los músculos que se unen a la pinza de cabeza y la parte recta de los músculos largos del cuello, exponiendo las apófisis espinosas de T2.
5. Desplazar los músculos semiespinal y espinal para exponer el arco vertebral de T2 a T6 (ver Figura 1E). Use rongeurs para eliminar la apófisis espinosa de la vértebra T3, exponiendo así la médula espinal T3.
   NOTA: Durante el proceso de exposición de las vértebras torácicas, asegúrese de que se preste especial atención a la preservación de la apófisis espinosa de T2, ya que sirve como punto principal de aplicación de fuerza para la exposición posterior de la médula espinal T3.
6. Retire la duramadre y la membrana aracnoidea, y gotee aceite de parafina sobre la superficie de la médula espinal para mantener la viabilidad de las neuronas espinales (véase la figura 1F).
   NOTA: Los vasos sanguíneos del tejido adiposo marrón de la rata se originan en la lámina T3, T4 o T5 y se distribuyen como un seno venoso. Tenga cuidado de no tocarlos, ya que esto podría causar una pérdida excesiva de sangre en la rata.

7. Fijación y configuración de las vértebras torácicas

1. Utilice una pinza espinal personalizada para asegurar las apófisis articulares de T2 y T6. Humedece los músculos circundantes con solución salina para mantener la hidratación.
2. Conecte la guía de electrodos al micromanipulador de un instrumento estereotáctico e insértelo verticalmente en el asta dorsal de la médula espinal en el segmento espinal T3 a través del surco mediano dorsal, 500 μm lateral a la línea media, a una profundidad de 1.500 μm.
3. Inserte el electrodo de referencia en el músculo de la espalda (véase la figura 1G).
4. Inicie el software de grabación extracelular multicanal y vaya a Archivo | Configuración de hardware; Seleccione la matriz de 32 canales de la lista de interfaces del dispositivo; haga clic con el botón derecho en el grupo de canales seleccionado; y, a continuación, elija Propiedades en el menú contextual . Configure los parámetros de procesamiento de señal: En la pestaña Filtro , configure el filtro de paso de banda (BP) en 250 Hz - 5 kHz; en el campo Frecuencia de muestreo , entrada 30 kHz/s; habilite los algoritmos de detección de picos marcando la casilla Habilitar procesamiento de picos para activar la clasificación de picos en tiempo real y la extracción de eventos basada en umbrales.
   NOTA: Asegúrese de que los músculos y tejidos que rodean los procesos articulares de T2 y T6, especialmente en la región donde se aplica la pinza espinal personalizada para la fijación de la columna, para evitar el desplazamiento durante los experimentos posteriores.

8. Estímulos somáticos y BK

1. Utilice BK (1 μg/mL en agua destilada) para inducir la estimulación nociceptiva cardíaca. Inyectar 4 μL de la solución BK con una microjeringa conectada a un catéter de silicona con varias aberturas pequeñas¹¹.
2. Observe los cambios en la frecuencia cardíaca (aumentos o disminuciones) y la descarga neuronal (aumenta o disminuye) en el asta dorsal de la médula espinal T3 dentro de los 30 minutos posteriores a la inyección para identificar las interacciones dinámicas entre las neuronas del asta dorsal de la médula espinal torácica.
3. Realizar acupuntura manual en el punto de acupuntura PC6 (MAPC6) utilizando el parámetro de estimulación de 1 Hz. PC6 (punto de acupuntura de Neiguan) se localiza a 2 mm proximal a la articulación del carpo en el antebrazo ventral, entre el flexor radial del carpo y el tronco del nervio mediano. Inserte las agujas (0,25 mm x 25 mm) en los puntos de acupuntura PC6 a una profundidad de ~3 mm. Compara los cambios en la actividad neuronal y la función cardíaca antes y después de los estímulos somáticos.

9. Análisis y tratamiento de datos

1. Importe los datos neuronales registrados en formato ns6 en el software de la siguiente manera:
   1. Conversión de archivos: Vaya a Archivo | Abrir para cargar el archivo ns6. Seleccionar archivo | Guardar como y elija el formato .nex5 para generar datos estandarizados del tren de picos.
   2. Spike Sorting: Importe los archivos .nex5 convertidos en el software de clasificación para la clasificación neuronal. Clasifique las formas de onda de los picos en función de las características de la forma de onda y el análisis de componentes principales (PCA), con parámetros de umbral establecidos en ±3 SD a partir del ruido de referencia.
   3. A continuación, ejecute el código correspondiente para filtrar y categorizar las señales.
2. Analice los SDRN con bloqueo cardíaco.
   1. Tomando la onda R como evento de referencia, cuente el número de disparos de neuronas dentro de una ventana de 0,2 s antes y después de cada onda R.
   2. Después de contar las ondas R a intervalos de 50 ms, cree un histograma de eventos de anillo. Normalice el histograma (es decir, reste la tasa de descarga promedio en 0,2 s antes y después del evento de onda R) para obtener la distribución de la tasa de descarga de la actividad de cada neurona durante el latido del corazón.
   3. Evalúe la significación estadística a través de las pruebas de permutación Monte Carlo¹² , implementadas con 1.000 iteraciones aleatorias. Obtenga la distribución de la tasa de disparo y el intervalo de confianza de la neurona en el proceso de latidos cardíacos aleatorios aleatorizando 0,2 s del tiempo antes y después de cada onda R de latidos cardíacos (el rango es ± 0,1 s). Si la distribución de disparo de los latidos del corazón de una neurona excede (mayor o menor que) el intervalo de confianza del 95% de la distribución de la tasa de disparo del proceso de latidos cardíacos aleatorios, identifique la neurona como una neurona bloqueada por el corazón (consulte el Archivo complementario 1).

Resultados

Siguiendo el protocolo anterior, se expusieron las SDHN T3, con bradicinina (BK) o punción somática administrada en regiones pericárdicas/puntos de acupuntura. Esta investigación cuantificó los perfiles de activación neuronal evocados por estímulos (tipo/frecuencia) y los cambios electrocardiográficos (ECG) concurrentes durante la entrada visceral nociceptiva, la aplicación de BK y la modulación somatosensorial.

La figura 2A

Discusión

La decodificación de los perfiles de codificación neuronal de SDH es esencial para comprender el mecanismo neuromodulador del efecto terapéutico inducido por la acupuntura sobre la disfunción visceral. Aquí, combinamos la técnica de registro in vivo MEA con el sistema de registro de ECG para registrar simultáneamente la actividad de descarga de los SDHN T3 y el ECG. La estimulación del dolor cardíaco puede activar los nociceptores de tipo C que inervan el corazón y tra...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia System	Kent Scientific	SomnoSuite
Central v6.5	Black Microsystems	Cerebus-128
Fine Scissors	Fine Scissors	Fine Scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science T ools	16220-14
Gelatin Sponges	Coltene	274-007
Intubation Cannula	Harward Apparatus	73-2737
Isoflurane	RWD	R510
LabChart Professional Software	LabChart Professional Software	Version 8.0
microband electrode array	Neuronexus	A1x32-6mm-50-177
micromanipulator	Narishige	DMA-1510
needles	Zhongyantaihe	0.25 mm x 0.25 mm
NeuroExplorer software (V5.0)	Plexon	V5.0
offline Sorter	Plexon	V4.0
Powerlab	ADInstruments	PL26T04
rats	the Experimental Center of the Academy of Military Medical Sciences of the People's Liberation Army of China
Spinal Adaptor	N/A	N/A	Custom made
Spring Scissors	Fine Science Tools	15023-10
stereotactic instrument	Narishige	SR-5R-HT