Studio dei profili codificanti della stimolazione somatica sulle risposte neuronali bloccate cardiache nel corno dorsale spinale del ratto

Riepilogo

Descriviamo un protocollo per la registrazione extracellulare multicanale spinale insieme alla registrazione della funzione cardiaca e all'analisi dei neuroni del corno dorsale spinale bloccati nel cuore. Questo metodo offre un quadro temporalmente sincronizzato per lo studio dei meccanismi spinali alla base dei cambiamenti funzionali viscerali toracici indotti dall'agopuntura.

Abstract

Molti studi hanno suggerito che l'elettroagopuntura può essere utile nel trattamento e nella prevenzione delle malattie cardiovascolari. Tuttavia, il suo meccanismo rimane poco compreso. Il corno dorsale spinale toracico (SDH) svolge un ruolo importante nell'integrazione e nella modulazione degli input somatici e viscerali, che possono quindi influenzare il controllo cardiaco. A differenza dell'SDH lombare, che è stato ampiamente studiato, l'SDH toracico è stato meno esplorato a causa della difficoltà di esposizione chirurgica e della fissazione stereotassica. In questo studio, forniamo un approccio generale per il monitoraggio simultaneo dell'attività neuronale e della funzione cardiaca combinando la registrazione di elettrocardiogrammi e array di microelettrodi. Inoltre, descriviamo come identificare i neuroni bloccati dal cuore calcolando la distribuzione della frequenza di attivazione dell'attività neuronale in sincronia con i battiti cardiaci. La strategia è di grande importanza per studiare la correlazione tra funzione cardiovascolare e attività neuronale, nonché per comprendere il riflesso somatocardiaco innescato dalle stimolazioni dei nervi periferici.

Introduzione

L'agopuntura o stimolazione della superficie corporea, come tecnica terapeutica di spicco nell'ambito della Medicina Tradizionale Cinese (MTC), agisce stimolando aree specifiche della superficie corporea. Facilita la regolazione multilivello delle funzioni dell'organismo attraverso la regolazione delle funzioni viscerali attraverso vie afferenti, integrazione centrale e meccanismi nervosi efferenti autonomi. Al centro di questa terapia c'è il concetto che la stimolazione mirata di agopunti anatomicamente definiti induce una regolazione fisiologica sistemica. Crescenti evidenze cliniche supportano il ruolo dell'agopuntura come modalità complementare nella gestione dei disturbi cardiovascolari, con efficacia dimostrata sia nella prevenzione primaria che nei protocolli di trattamento aggiuntivo ^1,2.

Le afferenze primarie dei neuroni sensoriali terminano prevalentemente nel corno dorsale spinale (SDH), corrispondentemente, i neuroni del corno dorsale spinale (SDHN) svolgono un ruolo cruciale nell'integrazione e nella modulazione degli input somatici ^3,4,5. Inoltre, gli SDHRN ricevono anche afferenze cardiache e trasmettono informazioni viscerali ai neuroni pregangliari simpatici spinali (SPN) per la modulazione cardiovascolare⁶. Gli SPN bloccati nel cuore si trovano nell'angolo laterale del segmento toracico del midollo spinale (T1-T5), con assoni che sporgono verso i gangli cervicali o toracici e successivamente innervano il cuore attraverso i nervi cardiaco, medio e inferiore. Di conseguenza, il midollo spinale toracico svolge un ruolo cruciale nell'integrazione e nella modulazione degli input somatici e viscerali, che possono quindi influenzare il controllo cardiaco. È quindi importante capire come la stimolazione somatica regoli la funzione cardiaca attraverso la modulazione delle SDHRN nel segmento toracico del midollo spinale.

Studi precedenti hanno dimostrato che l'elettroagopuntura al PC6 (organizzata nel segmento spinale T3 come unità omotopica struttura-funzione) può alleviare i sintomi dell'ischemia miocardica attraverso la modulazione del sistema nervoso autonomo ^7,8,9. Tuttavia, la sincronizzazione quantitativa in tempo reale degli effetti dell'agopuntura sulla frequenza cardiaca con l'attività del sistema nervoso non è ancora stata realizzata. Sono stati documentati solo l'attività nervosa autonomica immediata e gli indicatori dell'elettrocardiogramma (ECG) dopo l'agopuntura. La ricerca che collega gli SDHN con le funzioni fisiologiche viscerali rimane scarsa. A causa della curvatura fisiologica delle vertebre toraciche e dello spazio ristretto tra i segmenti vertebrali toracici adiacenti, in particolare T1-T5, l'accesso a queste aree è difficile, con conseguenti scarse prove dirette per chiarire i meccanismi spinali alla base dell'agopuntura all'agopuntura omotopica spinale T3 PC6 che regola la funzione cardiaca nel trattamento delle CVD.

Per comprendere meglio la relazione tra SDH e regolazione della funzione cardiaca mediata dall'agopuntura, è necessario implementare la registrazione sincrona della funzione cardiaca e delle attività neurali. Qui, forniremo un approccio generale per la registrazione extracellulare multicanale spinale insieme alla registrazione della funzione cardiaca, nonché all'analisi delle SDHRN bloccate cardiache. Questo metodo offre un quadro temporalmente sincronizzato per lo studio dei meccanismi spinali alla base dei cambiamenti funzionali viscerali toracici indotti dall'agopuntura.

Protocollo

Il protocollo dell'esperimento sugli animali ha aderito rigorosamente ai requisiti dello standard nazionale "Linee guida per la revisione etica del benessere degli animali da laboratorio" (GB/T 35892-2018) ed è stato approvato dal Comitato Etico dell'istituto. In questo studio sono stati utilizzati ratti maschi Sprague-Dawley (SD) di grado SPF, di età compresa tra 6 e 8 settimane e del peso di circa 220 g. Camici da laboratorio, guanti e maschere sono stati indossati durante tutti gli esperimenti. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali. Al termine dell'esperimento, i ratti sono stati soppressi tramite perfusione cardiaca in anestesia profonda seguita da lussazione cervicale.

1. Configurazione preoperatoria

1. Collegare il circuito del ventilatore al tubo endotracheale a forma di Y, garantendo un'interfaccia sicura ed ermetica.
2. Verificare la corretta ventilazione confermando il flusso d'aria stabile, il volume corrente appropriato e le impostazioni della frequenza respiratoria sul display del ventilatore.
3. Garantire l'assenza di condensa o particelle contaminanti all'interno del tubo esaminando visivamente tutti i segmenti in condizioni di illuminazione intensa.
4. Alimenta simultaneamente i segnali ECG amplificati sia nell'ingresso dell'elettrocardiografo che nella porta di ingresso analogica del sistema di registrazione dell'array di microelettrodi utilizzando un connettore BNC a tre vie.
5. Instradare i segnali amplificati attraverso uno splitter BNC a tre vie per collegare contemporaneamente l'ingresso analogico dell'elettrocardiografo e la porta di ingresso analogica del sistema di registrazione dell'array di microelettrodi.
6. Stabilire i trigger di sincronizzazione collegando l'uscita TTL dell'elettrocardiografo all'ingresso digitale del sistema di registrazione dell'array di microelettrodi. Utilizzando un cavo di interfaccia BNC-Dupont, avviare l'acquisizione simultanea su entrambi i sistemi, verificando l'allineamento temporale.

2. Preparazione preoperatoria

1. Anestetizzazione
   1. Indurre l'anestesia con isoflurano al 3-5% per inalazione e quindi somministrare un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico (50 mg/kg) al ratto anestetizzato. Somministrare isoflurano per anestesia per inalazione prima di posizionare gli elettrodi, mantenendo una concentrazione di ~1,2%. Procedere solo se Valutare la profondità dell'anestesia tramite un pizzico di dita dei piedi prima di procedere.
   2. Rimuovi i peli dal collo anteriore e dalla parte posteriore dei ratti.
   3. Posiziona il ratto in posizione supina su una coperta riscaldante e applica un unguento sugli occhi del ratto per evitare che si secchi. Osservare la frequenza respiratoria e verificare le risposte di ritiro esercitando pressione sul poggiapiedi con una pinza.

3. Intubazione tracheale

1. Metti i ratti in posizione supina e disinfetta la zona del collo con tintura di iodio.
2. Eseguire un'incisione longitudinale di circa 1 cm lungo la linea mediana del collo e sezionare senza mezzi termini il tessuto muscolare.
3. Una volta esposta la ghiandola tiroidea, separare accuratamente la sottile membrana tra i due lobi tiroidei, facendo attenzione a non danneggiare il tessuto tiroideo. Procedere con l'esposizione della trachea.
4. Esamina la "cannula a forma di Y" per confermare che sia completamente asciutta. Utilizzare le forbici a molla per praticare un'incisione trasversale nella trachea, seguita dall'inserimento della cannula nell'apertura tracheale. Fissare la cannula tracheale con suture 3-0 non assorbibili per evitare perdite d'aria ed estubazioni accidentali.
5. Sutura con cura i muscoli del collo e la pelle e collega il ratto a un ventilatore. Regolare la frequenza respiratoria a 85 respiri/min e il volume corrente a 3,5 ml, in base al peso corporeo del ratto⁷ (Figura 1B).

4. Rilevamento ECG

1. Inserire tre elettrodi nella pelle del ratto: l'elettrodo positivo nell'arto inferiore sinistro, l'elettrodo negativo nell'arto superiore destro e l'elettrodo di terra nell'arto inferiore destro¹⁰.
2. Acquisizione dei dati tramite elettrocardiografo (impostazioni del filtro: passa-basso a 100 Hz, passa-alto a 1 kHz; frequenza di campionamento: 4 kHz/s). Utilizzare il software di registrazione ECG per registrare, salvare e analizzare i dati.

5. Cateterismo pericardico per somministrazione di farmaci bradichinina (BK)

1. Metti il ratto in posizione supina e disinfetta la pelle del torace con iodio.
2. Eseguire una toracotomia tra la 1a e la 3a cartilagine costale sulla parte superiore sinistra del torace per esporre il timo. Sezionare bruscamente il timo lungo la linea mediana per esporre il pericardio (vedi Figura 1C, D).
3. Utilizzare la punta di un ago da dissezione in vetro (0,5 mm di diametro) per praticare una piccola apertura nel pericardio.
4. Inserire un catetere in silicone, lungo 10-15 cm, con diversi piccoli fori all'estremità distale attraverso l'incisione nel pericardio. Fissare il catetere al tessuto della parete toracica utilizzando la biocolla.
5. Chiudere la cavità toracica strato per strato, assicurandosi che la respirazione del ratto rimanga libera (vedi Figura 1D).

6. Esposizione del midollo spinale T3

1. Posizionare il ratto in posizione prona ed eseguire la disinfezione di routine con iodio. Praticare un'incisione di circa 8 cm lungo la linea mediana della schiena dalle vertebre T2 a T6.
2. Usa le forbici a molla per tagliare la pelle e gli strati muscolari, compreso il muscolo trapezio. Inserire un divaricatore tra i muscoli per esporre ulteriormente il campo chirurgico.
3. Separare attentamente il grasso e le ghiandole di ibernazione nella parte anteriore delle vertebre toraciche del ratto, evitando i vasi sanguigni sotto le ghiandole (vedi Figura 1E).
4. Rimuovere i muscoli che si attaccano al morsetto per la testa e la parte diritta dei muscoli lunghi del collo, esponendo i processi spinosi di T2.
5. Spostare i muscoli semispinali e spinali per esporre l'arco vertebrale da T2 a T6 (vedi Figura 1E). Utilizzare i rongeurs per rimuovere il processo spinoso della vertebra T3, esponendo così il midollo spinale T3.
   NOTA: Durante il processo di esposizione delle vertebre toraciche, assicurarsi che venga prestata particolare attenzione alla conservazione del processo spinoso di T2, poiché funge da punto di applicazione della forza principale per la successiva esposizione del midollo spinale T3.
6. Rimuovere la dura madre e la membrana aracnoidea e gocciolare olio di paraffina sulla superficie del midollo spinale per mantenere la vitalità dei neuroni spinali (vedi Figura 1F).
   NOTA: I vasi sanguigni del tessuto adiposo bruno del ratto hanno origine dalla lamina T3, T4 o T5 e sono distribuiti come un seno venoso. Fare attenzione a non toccarli, poiché ciò potrebbe causare un'eccessiva perdita di sangue nel ratto.

7. Fissazione e impostazioni delle vertebre toraciche

1. Usa un morsetto spinale personalizzato per fissare i processi articolari di T2 e T6. Inumidire i muscoli circostanti con soluzione salina per mantenere l'idratazione.
2. Collegare l'array di elettrodi al micromanipolatore di uno strumento stereotassico e inserirlo verticalmente nel corno dorsale del midollo spinale in corrispondenza del segmento spinale T3 attraverso il solco mediano dorsale, 500 μm lateralmente alla linea mediana, a una profondità di 1.500 μm.
3. Inserire l'elettrodo di riferimento nel muscolo della schiena (vedere la Figura 1G).
4. Avvia il software di registrazione extracellulare multicanale e vai su File | Configurazione hardware; selezionare l'array a 32 canali dall'elenco dell'interfaccia del dispositivo; fare clic con il pulsante destro del mouse sul gruppo di canali selezionato; , quindi scegliere Proprietà dal menu contestuale . Configurare i parametri di elaborazione del segnale: Nella scheda Filtro , impostare il filtro passa-banda (BP) su 250 Hz - 5 kHz; nel campo Frequenza di campionamento , immettere 30 kHz/s; abilitare gli algoritmi di rilevamento dei picchi selezionando la casella Abilita elaborazione picchi per attivare l'ordinamento dei picchi in tempo reale e l'estrazione degli eventi basata su soglia.
   NOTA: Garantire una completa pulizia dei muscoli e dei tessuti che circondano i processi articolari di T2 e T6, specialmente nella regione in cui viene applicato il morsetto spinale personalizzato per la fissazione spinale, per prevenire lo spostamento durante gli esperimenti successivi.

8. Stimoli somatici e BK

1. Utilizzare BK (1 μg/mL in acqua distillata) per indurre la stimolazione nocicettiva cardiaca. Iniettare 4 μl della soluzione di BK con una micro-siringa collegata a un catetere in silicone con diverse piccole aperture¹¹.
2. Osservare le variazioni della frequenza cardiaca (aumenti o diminuzioni) e della secrezione neuronale (aumenti o diminuzioni) nel corno dorsale del midollo spinale T3 entro 30 minuti dall'iniezione per identificare le interazioni dinamiche tra i neuroni del corno dorsale del midollo spinale toracico.
3. Eseguire l'agopuntura manuale al punto di agopuntura PC6 (MAPC6) utilizzando il parametro di stimolazione di 1 Hz. PC6 (punto di Neiguan) si trova a 2 mm prossimalmente all'articolazione carpale sull'avambraccio ventrale, tra il flessore radiale del carpo e il tronco nervoso mediano. Inserire gli aghi (0,25 mm x 25 mm) nei punti di agopuntura PC6 a una profondità di ~3 mm. Confrontare i cambiamenti nell'attività neuronale e nella funzione cardiaca prima e dopo gli stimoli somatici.

9. Analisi ed elaborazione dei dati

1. Importa i dati neurali registrati in formato ns6 nel software come segue:
   1. Conversione file: vai su File | Apri per caricare il file ns6. Seleziona File | Salva con nome e scegli il formato .nex5 per generare dati standardizzati del treno spike.
   2. Ordinamento delle punte: Importa i file .nex5 convertiti nel software di classificazione per la classificazione neuronale. Ordina le forme d'onda dei picchi in base alle caratteristiche della forma d'onda e all'analisi dei componenti principali (PCA), con parametri di soglia impostati a ±3 SD dal rumore di base.
   3. Quindi, eseguire il codice pertinente per filtrare e classificare i segnali.
2. Analizza gli SDRN con blocco cardiaco.
   1. Prendendo l'onda R come evento di riferimento, conta il numero di attivazioni dei neuroni entro una finestra di 0,2 s prima e dopo ogni onda R.
   2. Dopo aver contato le onde R a intervalli di 50 ms, creare un istogramma dell'evento ad anello. Normalizzare l'istogramma (cioè sottrarre la velocità di scarica media in 0,2 secondi prima e dopo l'evento dell'onda R) per ottenere la distribuzione della velocità di scarica dell'attività di ciascun neurone durante il battito cardiaco.
   3. Valuta la significatività statistica tramite il test di permutazione Monte Carlo¹² , implementato con 1.000 iterazioni mescolate. Ottenere la distribuzione della frequenza di attivazione e l'intervallo di confidenza del neurone nel processo del battito cardiaco randomizzato randomizzando 0,2 s del tempo prima e dopo ogni onda R del battito cardiaco (l'intervallo è ± 0,1 s). Se la distribuzione di attivazione del battito cardiaco di un neurone supera (maggiore o minore) l'intervallo di confidenza del 95% della distribuzione della frequenza di attivazione del processo di battito cardiaco randomizzato, identificare il neurone come un neurone bloccato cardiaco (vedere File supplementare 1).

Risultati

Seguendo il protocollo di cui sopra, gli SDHN T3 sono stati esposti, con bradichinina (BK) o needling somatico somministrato alle regioni pericardiche/agopunturali. Questa indagine ha quantificato i profili di attivazione neuronale evocati dallo stimolo (tipo/frequenza) e le concomitanti variazioni elettrocardiografiche (ECG) durante l'input viscerale nocicettivo, l'applicazione di BK e la modulazione somatosensoriale.

La Figura 2A

Discussione

La decodifica dei profili di codifica neuronale SDH è essenziale per comprendere il meccanismo neuromodulatorio dell'effetto terapeutico indotto dall'agopuntura sulla disfunzione viscerale. Qui, abbiamo combinato la tecnica di registrazione MEA in vivo con il sistema di registrazione ECG per registrare simultaneamente l'attività di scarica degli SDHN T3 e dell'ECG. La stimolazione del dolore cardiaco può attivare i nocicettori di tipo C che innervano il cuore e trasmettono in...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia System	Kent Scientific	SomnoSuite
Central v6.5	Black Microsystems	Cerebus-128
Fine Scissors	Fine Scissors	Fine Scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science T ools	16220-14
Gelatin Sponges	Coltene	274-007
Intubation Cannula	Harward Apparatus	73-2737
Isoflurane	RWD	R510
LabChart Professional Software	LabChart Professional Software	Version 8.0
microband electrode array	Neuronexus	A1x32-6mm-50-177
micromanipulator	Narishige	DMA-1510
needles	Zhongyantaihe	0.25 mm x 0.25 mm
NeuroExplorer software (V5.0)	Plexon	V5.0
offline Sorter	Plexon	V4.0
Powerlab	ADInstruments	PL26T04
rats	the Experimental Center of the Academy of Military Medical Sciences of the People's Liberation Army of China
Spinal Adaptor	N/A	N/A	Custom made
Spring Scissors	Fine Science Tools	15023-10
stereotactic instrument	Narishige	SR-5R-HT