ラット脊髄背角における心臓ロックニューロン応答に対する体細胞刺激のコードプロファイルの研究

要約

心機能の記録と心臓にロックされた脊髄後角ニューロンの分析と並行して、脊椎マルチチャネル細胞外記録のプロトコルについて説明します。この方法は、鍼治療によって誘発される胸部内臓機能変化の根底にある脊椎メカニズムを研究するための時間的に同期したフレームワークを提供します。

要約

多くの研究が、電気鍼治療が心血管疾患の治療と予防に有益である可能性があることを示唆しています。しかし、そのメカニズムはよくわかっていません。胸部脊髄後角(SDH)は、体細胞と内臓の入力を統合して調節する重要な役割を果たしており、それが心臓制御に影響を与える可能性があります。広く研究されてきた腰椎SDHとは対照的に、胸部SDHは外科的曝露と定位固定の難しさのためにあまり探求されていません。本研究では、心電図の記録と微小電極アレイを組み合わせて、神経細胞の活動と心機能を同時にモニタリングする一般的なアプローチを提供します。さらに、心拍と同期したニューロン活動の発火率分布を計算することにより、心臓ロックニューロンを特定する方法について説明します。この戦略は、心血管機能とニューロン活動の相関関係を研究するため、また末梢神経刺激によって引き起こされる体性心反射を理解するために非常に重要です。

概要

鍼治療または体表面刺激は、伝統的な中国医学(TCM)の枠組みの中で著名な治療技術として、体表面の特定の領域を刺激することによって機能します。これは、求心性経路、中枢統合、および自律神経遠心性神経メカニズムを介した内臓機能の調節を通じて、生物の機能のマルチレベルの調節を促進します。この治療法の中心となるのは、解剖学的に定義されたツボの標的刺激が全身の生理学的調節を誘発するという概念です。臨床的証拠の増加は、心血管障害の管理における補完的なモダリティとしての鍼治療の役割を支持しており、一次予防と補助治療プロトコルの両方で有効性が実証されています^1,2。

感覚ニューロンの一次求心性神経は、主に脊髄背角(SDH)で終結し、それに応じて、脊髄背角ニューロン(SDHN)は、体細胞入力^3,4,5の統合と調節において重要な役割を果たします。さらに、SDHRNは心筋求心性神経も受け取り、心血管調節のための脊髄交感神経節前ニューロン(SPN)に内臓情報を伝達します⁶。心臓ロックされたSPNは、脊髄の胸部セグメント(T1-T5)の外側角に位置し、軸索が頸部または胸部神経節に突き出ており、その後、心臓神経、中神経、および下部神経を介して心臓を神経支配します。その結果、胸部脊髄は、体細胞入力と内臓入力の統合と調節に重要な役割を果たし、心臓制御に影響を与える可能性があります。したがって、体細胞刺激が脊髄の胸部セグメントのSDHRNの調節を通じて心機能をどのように調節するかを理解することが重要です。

これまでの研究では、PC6(T3脊髄部にホモトピック構造機能単位として組織化)での電気鍼治療が、自律神経系の調節を通じて心筋虚血の症状を緩和できることが実証されている^7,8,9。しかし、鍼治療が心拍数に及ぼす影響と神経系の活動とをリアルタイムで定量的に同期させることは、まだ実現されていません。鍼治療後の即時の自律神経活動と心電図(ECG)指標のみが文書化されています。SDHNと内臓生理機能を結びつける研究は、まだ少ないのが現状です。胸椎の生理学的湾曲と隣接する胸椎セグメント、特にT1-T5の間の狭いスペースのために、これらの領域へのアクセスは困難であり、CVDの治療における心機能を調節するT3脊髄ホモトピックPC6での鍼治療の根底にある脊髄メカニズムを解明するための直接的な証拠はほとんどありません。

SDHと鍼治療による心機能調節との関係をより深く理解するためには、心機能と神経活動の同期記録を実施する必要があります。ここでは、脊椎マルチチャネル細胞外記録と心機能記録、および心臓ロックSDHRNの分析のための一般的なアプローチを提供します。この方法は、鍼治療によって誘発される胸部内臓機能変化の根底にある脊椎メカニズムを研究するための時間的に同期したフレームワークを提供します。

プロトコル

動物実験プロトコルは、国家基準「実験動物の福祉に関する倫理的審査のためのガイドライン」(GB / T 35892-2018)の要件を厳格に遵守し、機関の倫理委員会によって承認されました。この研究では、6〜8週齢、体重約220gの雄SPFグレードのSprague-Dawley(SD)ラットを使用しました。実験では、実験用ガウン、手袋、マスクを着用しました。試薬や使用した機器の詳細は、 資料表に記載されています。実験のエンドポイントでは、ラットは深い麻酔下で心臓灌流によって安楽死させられ、その後子宮頸部脱臼が行われました。

1. 術前セットアップ

1. 人工呼吸器回路をY字型の気管内チューブに接続し、安全で気密性の高いインターフェースを確保します。
2. ベンチレーターのディスプレイで安定した気流、適切な一回換気量、呼吸数の設定を確認して、適切な換気を確認します。
3. チューブ内に凝縮物や粒子状の汚染物質がないことを確認するには、明るい照明の下ですべてのセグメントを目視で検査します。
4. 増幅された心電図信号を、3ウェイBNCコネクタを使用して、心電計入力と微小電極アレイ記録システムのアナログ入力ポートの両方に同時に供給します。
5. 増幅された信号を3方向BNCスプリッターに通し、心電計アナログ入力と微小電極アレイ記録システムのアナログ入力ポートを同時に接続します。
6. 心電計のTTL出力を微小電極アレイ記録システムのデジタル入力に接続することにより、同期トリガーを確立します。BNC-デュポンインターフェースケーブルを使用して、両方のシステムで同時集録を開始し、時間アライメントを確認します。

2. 術前準備

1. 麻酔
   1. 吸入により3〜5%イソフルランで麻酔を誘発し、次に、麻酔をかけたラットにペントバルビタールナトリウム(50 mg / kg)の腹腔内注射を投与します。.電極を配置する前に、吸入麻酔用のイソフルランを投与し、濃度を~1.2%に保ちます。続行する前に、つま先をつまんで麻酔の深さを評価する場合にのみ続行してください。
   2. ラットの前首と後部の毛を取り除きます。
   3. ラットを温熱ブランケットの上で仰臥位に置き、乾燥を防ぐためにラットの目に軟膏を塗布します。呼吸数を観察し、鉗子でフットパッドに圧力を加えて離脱反応を確認します。

3. 気管挿管

1. ラットを仰臥位に置き、ヨウ素チンキ剤で首の部分を消毒します。
2. 首の正中線に沿って約1cmの縦方向の切開を行い、筋肉組織を鈍く解剖します。
3. 甲状腺が露出したら、甲状腺組織を傷つけないように注意しながら、2つの甲状腺葉の間に薄い膜を慎重に分離します。気管を露出させます。
4. 「Y字型カニューレ」を調べて、完全に乾いていることを確認します。スプリングハサミを使用して気管を横切開し、続いてカニューレを気管開口部に挿入します。気管カニューレを3-0の非吸収性縫合糸で固定し、空気漏れや偶発的な抜管を防ぎます。
5. 首の筋肉と皮膚を慎重に縫合し、ラットを人工呼吸器に接続します。ラットの体重^に応じて 、呼吸数を85呼吸/分に、一回換気量を3.5mLに調整します7(図1B)。

4. 心電図検出

1. ラットの皮膚に3つの電極を挿入します:正極を左下肢に、負極を右上肢に、接地電極を右下肢¹⁰に挿入します。
2. 心電計(フィルタ設定:100Hzローパス、1kHzハイパス、サンプリング周波数:4kHz/s)を用いてデータを取得します。ECG記録ソフトウェアを使用して、データを記録、保存、および分析します。

5. ブラジキニン(BK)投与のための心膜カテーテル法

1. ラットを仰臥位に置き、胸部の皮膚をヨウ素で消毒します。
2. 胸腺を露出させるために、左上胸部の第1肋軟骨と第3肋軟骨の間で開胸術を行います。正中線に沿って胸腺を鈍く解剖して、心膜を露出させます( 図1C、Dを参照)。
3. ガラス解剖針(直径0.5mm)の先端を使用して、心膜に小さな開口部を作ります。
4. 長さ10〜15 cmのシリコンカテーテルを挿入し、その遠位端にいくつかの小さな穴を開けて、心膜の切開部を通します。バイオグルーを使用してカテーテルを胸壁組織に固定します。
5. ラットの呼吸が妨げられないように、胸腔を層ごとに閉じます( 図1Dを参照)。

6. T3脊髄の露出

1. ラットを腹臥位に置き、ヨウ素による定期的な消毒を行います。T2椎骨からT6椎骨まで背中の正中線に沿って約8cmを切開します。
2. スプリングハサミを使用して、僧帽筋を含む皮膚と筋肉の層を切り開きます。筋肉の間にリトラクターを挿入して、手術野をさらに露出させます。
3. ラットの胸椎の前面で脂肪腺と冬眠腺を慎重に分離し、腺の下の血管を避けます( 図1Eを参照)。
4. ヘッドクランプに付着している筋肉と長い首の筋肉の直線部分を取り除き、T2の棘突起を露出させます。
5. 半棘筋と脊椎筋を変位させて、椎弓をT2からT6に露出させます( 図1Eを参照)。ロンゲールを使用してT3椎骨の棘突起を取り除き、それによってT3脊髄を露出させます。
   注:胸椎を露出させる過程では、T2の棘突起を保存することに特別な注意が払われていることを確認してください。これは、T3脊髄のその後の露出のための主要な力の印加点として機能するためです。
6. 硬膜とくも膜を切除し、脊髄の表面にパラフィンオイルを滴下して、脊髄ニューロンの生存率を維持します( 図1Fを参照)。
   注:ラットの褐色脂肪組織の血管は、T3、T4、またはT5椎弓板で発生し、静脈洞のように分布しています。ラットの過度の失血を引き起こす可能性があるため、それらに触れないように注意してください。

7.胸椎の固定と設定

1. カスタム脊椎クランプを使用して、T2とT6の関節突起を固定します。生理食塩水で周囲の筋肉を湿らせ、水分補給を維持します。
2. 定位装置のマイクロマニピュレータに電極アレイを取り付け、正中線から500μm横方向の背側正中溝を介してT3脊髄節の脊髄背角に垂直に挿入し、1,500μmの深さまで挿入します。
3. 参照電極を背中の筋肉に挿入します( 図1Gを参照)。
4. マルチチャンネル細胞外記録ソフトウェアを起動し、[ファイル] |ハードウェア構成;デバイスインターフェースリストから32チャンネルアレイを選択します。選択したチャネルグループを右クリックします。をクリックし、コンテキストメニューから [プロパティ] を選択します。信号処理パラメータの設定:「フィルタ」タブで、バンドパスフィルタ(BP)を250 Hz - 5 kHzに設定します。に ampリングレートフィールドで、30 kHz / sを入力します。[Enable Spike Processing] チェックボックスをオンにして、スパイク検出アルゴリズムを有効にします。これにより、リアルタイムのスパイクソートとしきい値ベースのイベント抽出がアクティブになります。
   注:T2およびT6の関節突起を取り巻く筋肉および組織、特にカスタム脊椎クランプが脊椎固定に適用される領域において、その後の実験中の変位を防ぐために、完全なクリアランスを確保してください。

8. 体細胞刺激とBK刺激

1. BK(蒸留水で1μg / mL)を使用して、心臓侵害受容刺激を誘発します。.いくつかの小さな開口部¹¹を有するシリコーンカテーテルに接続されたマイクロシリンジを用いて、BK溶液4μLを注入する。
2. 注射後30分以内にT3脊髄背角の心拍数変化(増加または減少)とニューロン放電(増加または減少)を観察して、胸部脊髄背角ニューロン間の動的相互作用を特定します。
3. PC6(内関経穴)は、腹側前腕の手根関節の近位2mm、橈骨屈筋と正中神経幹の間に位置しています。針(0.25 mm x 25 mm)をPC6のツボに~3mmの深さで挿入します。体細胞刺激の前後の神経活動と心機能の変化を比較します。

9. データ分析と処理

1. ns6形式で記録されたニューラルデータをソフトウェアにインポートするには、次のようにします。
   1. ファイル変換: [ファイル]に移動します|ns6 ファイルをロードするために開きます。 [ファイル] |[名前を付けて保存 ] を選択し、.nex5 形式を選択して、標準化されたスパイク トレイン データを生成します。
   2. スパイクソーティング:変換された.nex5ファイルを神経細胞分類用の分類ソフトウェアにインポートします。波形特性と主成分解析(PCA)に基づいてスパイク波形をソートし、スレッショルド・パラメータをベースライン・ノイズから±3SDに設定します。
   3. 次に、シグナルのフィルタリングと分類に関連するコードを実行します。
2. 心臓ロックされたSDRNを解析します。
   1. R波を基準イベントとして、各R波の前後の0.2秒のウィンドウ内でのニューロンの発火数をカウントします。
   2. 50 ミリ秒間隔で R 波をカウントした後、リング イベント ヒストグラムを作成します。ヒストグラムを正規化(つまり、R波イベントの前後の0.2秒の平均放電率を差し引く)して、心拍中の各ニューロンの活動の放電率分布を取得します。
   3. モンテカルロ¹² 順列検定 (1,000 回のシャッフル反復で実装) を使用して統計的有意性を評価します。各心拍R波の前後の時間の0.2秒をランダム化することにより、ランダム化された心拍の過程におけるニューロンの発火率分布と信頼区間を取得します(範囲は0.1秒±)。ニューロンの心拍の発火分布が、無作為化された心拍プロセスの発火率分布の95%信頼区間を超える(または小さい)場合は、ニューロンを心臓ロックニューロンとして識別します( 補足ファイル1を参照)。

結果

上記のプロトコルに従って、T3 SDHNを曝露し、ブラジキニン(BK)または体細胞ニードリングを心膜周囲/ツボ領域に投与しました。この調査では、侵害受容性内臓入力、BK適用、および体性感覚調節中の刺激誘発ニューロン活性化プロファイル(タイプ/周波数)と同時心電図(ECG)の変化を定量化しました。

図2Aは、ラットのT3脊髄?...

ディスカッション

SDHニューロンコーディングプロファイルの解読は、鍼治療による内臓機能障害に対する治療効果の神経調節メカニズムを理解するために不可欠です。ここでは、MEA in vivo 記録技術とECG記録システムを組み合わせて、T3 SDHNとECGの放電活性を同時に記録しました。心臓の痛みの刺激は、心臓を神経支配し、内臓、DRG、T1-T5脊髄、および脊髄上を通じて前方に侵害受...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia System	Kent Scientific	SomnoSuite
Central v6.5	Black Microsystems	Cerebus-128
Fine Scissors	Fine Scissors	Fine Scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science T ools	16220-14
Gelatin Sponges	Coltene	274-007
Intubation Cannula	Harward Apparatus	73-2737
Isoflurane	RWD	R510
LabChart Professional Software	LabChart Professional Software	Version 8.0
microband electrode array	Neuronexus	A1x32-6mm-50-177
micromanipulator	Narishige	DMA-1510
needles	Zhongyantaihe	0.25 mm x 0.25 mm
NeuroExplorer software (V5.0)	Plexon	V5.0
offline Sorter	Plexon	V4.0
Powerlab	ADInstruments	PL26T04
rats	the Experimental Center of the Academy of Military Medical Sciences of the People's Liberation Army of China
Spinal Adaptor	N/A	N/A	Custom made
Spring Scissors	Fine Science Tools	15023-10
stereotactic instrument	Narishige	SR-5R-HT